CN110575823B - 羧甲基化的聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米材料及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于无机材料和分析技术领域，具体涉及磁性固定化金属离子亲和色谱材料(Fe3O4@SiO2‑CMPEI‑Ni2+)的制备及选择性分离重组组氨酸标签视黄醇类X受体(His‑tagged RXR)的应用。首先，集合四氧化三铁核的磁性可控和羧甲基化的聚乙烯亚胺(CMPEI)含有大量亚氨基二乙酸官能团的特性，利用层层自组装制备方法的简易性，得到磁性核壳材料Fe3O4@SiO2‑CMPEI，之后将Ni2+通过螯合作用固定在磁球上用于重组标签蛋白的分离。该方法不仅制备工艺简便，避免了繁复的修饰步骤，而且磁核的磁响应特性简化了材料在菌体裂解液中选择性捕获重组组氨酸标签蛋白的处理过程，此类型的磁性材料在蛋白纯化等领域具有良好的应用前景。

Description

羧甲基化的聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米材料及应用
技术领域
本发明属于无机材料和分析技术领域，具体涉及聚阴离子电解质羧甲基化的聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米材料及其制备和应用。
本发明提出的磁性纳米材料，可高效地分离细菌裂解粗提液中的重组组氨酸标签蛋白。该材料在蛋白纯化等领域有良好的应用前景。
背景技术
随着重组蛋白在生物制药、生物工程、蛋白质组学等领域发挥着重要的作用，对重组蛋白表达和纯化的需求也日益增加。当前，固定化金属离子亲和色谱(IMAC)是一种最为普遍的蛋白纯化方法，它利用蛋白表面暴露的组氨酸和基质表面固载的金属离子之间的螯合作用实现对重组蛋白的选择性分离。由于磁性材料兼具良好的生物相容性、易修饰性、磁性可控性，它已被广泛应用在药物运输、磁共振成像、酶的固载、蛋白分离等领域。同时，具有磁性的IMAC材料也应运而生。作为普遍使用的螯合配基，氮川三乙酸和亚氨基二乙酸通常会经由复杂的合成步骤修饰在材料的表面，限制了它们的广泛应用。此外，氮川三乙酸的衍生修饰是比较昂贵的，降低了此类材料的实用性。材料制备过程越繁杂得到的核壳材料的壳层越厚，降低了它的磁可控性。因此，通过一种更为简便的制备方法来合成IMAC磁性材料用于融合蛋白的选择性分离是必要的。
层层自组装通过交替沉积聚阴、阳离子电解质到基质表面，是一种简单的修饰基质的方法。由层层自组装技术制备的多种材料已经应用到生物传感、组织工程、载药系统等领域。羧甲基化的聚乙烯亚胺(CMPEI)在一个较宽的pH范围内可以作为聚阴离子电解质，通过静电相互作用沉积在带正电的基质表面上。CMPEI作为螯合配基不仅用于金属离子Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+等的吸附，还用于对融合蛋白的分离。同时结合层层自组装制备方法的简易性和CMPEI的优越性制备磁性IMAC材料还尚未报道。
发明内容
本发明针对现有方法的局限性，建立了一种制备工艺简单，能从生物样品细菌裂解粗提液中特异性捕集重组组氨酸标签视黄醇类X受体的羧甲基化的聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米材料的制备方法及应用。
本发明的技术路线如下：
第一步采用溶剂热法合成Fe3O4磁球：以1-5g的FeCl3·6H2O为铁源，添加0.4-1.2g的二水合柠檬酸三钠，1-4g的乙酸钠，20-80mL的乙二醇，反应温度在200-220℃，反应时间为5-12h，材料粒径为80-400nm；
第二步采用溶胶-凝胶法合成磁性核壳材料Fe3O4@SiO2：取由第一步制得的Fe3O4磁球100-400mg，先后用水、乙醇清洗三次。之后再分散在100-600mL的体积比为4：1的乙醇-水体系中，加入1-6mL 25％的氨水。机械搅拌条件下，待温度为25-60℃时，滴加1-5mL的正硅酸乙酯，反应2-12小时，产物用磁场收集，得到核壳结构的磁球Fe3O4@SiO2；
第三步合成磁性材料Fe3O4@SiO2-NH2：取第二步制得的磁球Fe3O4@SiO20.2-0.6g,分别经过乙醇、水、异丙醇清洗后分散在50-200mL的异丙醇中。滴加1.0-4.0mL的APTMS，反应温度为20-30℃，反应时间为12-24小时，水洗后真空干燥得到Fe3O4@SiO2-NH2；
第四步合成聚合物羧甲基化的聚乙烯亚胺(CMPEI)：在N2氛围下，取20.0-30.0g的氯乙酸钠加入到25-40mL的水中，混合物在30-50℃条件下搅拌10-20分钟。取50％的PEI溶液10.0-15.0g，加入到100-150mL的水中，机械搅拌条件下，待温度达到50-60℃后，向其中缓慢加入上述的氯乙酸钠水溶液，50-60℃反应1小时。水浴加热升温至90-95℃，在反应体系中滴加3-5％(W/V)NaOH溶液使体系的pH值维持在9.0-10.0，90-95℃反应2小时。之后停止水浴加热，机械搅拌条件下室温反应8-12小时。待反应完成后，向体系中添加浓盐酸至pH值为1-2。弃上清，沉淀用3-5％(W/V)NaOH溶液溶解，之后再加浓盐酸至pH值为1-2，弃上清，加入甲醇，产物白色沉淀真空干燥，得到CMPEI；
第五步合成磁性固定化金属离子亲和色谱材料Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+：取第三步得到的Fe3O4@SiO2-NH2材料20-40mg分散在2-5mL的包含1-3mg/mL CMPEI、0.1-0.15M NaCl，pH为4-5的溶液中，振荡孵育15-30min，水洗后得到磁性材料Fe3O4@SiO2-CMPEI。最后将材料分散在3-6mL浓度为0.1-0.2M的Ni(NO3)2溶液中，室温振荡孵育2-3小时，水洗后得到材料Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+。
由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下优点：通过采用层层自组装的制备技术将聚阴离子电解质CMPEI沉积在带有正电表面的磁性核壳材料Fe3O4@SiO2-NH2上，不仅简化了固定化金属离子亲和色谱材料的制备过程，中间磁核的磁响应性还实现了材料在选择性捕获重组组氨酸标签蛋白过程中的外磁场可控分离，在蛋白分离等领域具有良好的应用前景。
附图说明：
图1是(A)材料的制备流程图，(B)材料纯化重组组氨酸标签蛋白的流程示意图。
图2是材料制备过程中不同阶段的透射电镜图。(A)溶剂热法合成的四氧化三铁磁球，(B)核壳结构磁球Fe3O4@SiO2-NH2，(C)沉积一层聚合物的Fe3O4@SiO2-CMPEI，(D)沉积三层聚合物的Fe3O4@SiO2-CMPEI3。从图中可以观测到材料具有较好的分散性，随着包覆物质的增加，材料的壳层不断加厚。
图3是材料的多种表征图：(A)(a)Fe3O4@SiO2-NH2,(b)Fe3O4@SiO2-CMPEI,(c)Fe3O4@SiO2-CMPEI-CS和(d)Fe3O4@SiO2-CMPEI2的ζ电势。由图可知材料的ζ电势随外层交替沉积羧甲基化的聚乙烯亚胺(CMPEI)和壳聚糖(CS)合理变化。(B)(a)Fe3O4@SiO2-CMPEI和(b)CMPEI的红外光谱。1750cm-1和1650cm-1的特征峰表明CMPEI的成功合成和包覆。(C)(a)Fe3O4@SiO2-NH2,(b)Fe3O4@SiO2-CMPEI和(c)Fe3O4@SiO2-CMPEI3的热重曲线。从图中可以观测到，失重随沉积物的增加而增加。(D)(a)Fe3O4,(b)Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+和(c)Fe3O4@SiO2-CMPEI3-Ni2+的磁滞回线。由图可知，高的饱和磁矩值保证了材料的磁场可控。
图4是Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+对Hexa His tag Peptide的吸附热力学曲线。
图5是Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+对Hexa His tag Peptide的吸附动力学曲线。
图6是Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+的重复使用情况。由图可知，材料在重复使用六次后，对Hexa His tag Peptide的固载仍能保持在75％以上，具有良好的重复使用性。
图7是SDS-PAGE分析Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+捕获大肠杆菌菌体裂解液中的重组组氨酸标签的视黄醇类X受体的纯度及重复使用情况。泳道M：标准蛋白Marker，泳道L和S：经材料处理前后的菌体裂解上清液，泳道1-6：与菌体裂解液孵育后的材料经0.5mM的咪唑处理得到的洗脱成分，材料共重复使用六次。SDS-PAGE表明Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+可以选择性捕获His-tagged RXR，且具有良好的重复使用性。
该方法不仅制备工艺简便，避免了繁复的修饰步骤，而且磁核的磁响应特性简化了材料在菌体裂解液中选择性捕获重组组氨酸标签蛋白的处理过程，此类型的磁性材料在蛋白纯化等领域具有良好的应用前景。
具体实施方式
通过具体实例对本发明聚阴离子电解质羧甲基化的聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米材料的制备和应用进行细致阐述。
实施例1.聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米材料的制备。
第一步用溶剂热法合成磁球Fe3O4：依次称取4.32g FeCl3·6H2O、1.0g二水合柠檬酸三钠、4.0g乙酸钠到250mL的烧杯中，加入80mL乙二醇，室温磁力搅拌至溶液均匀。将溶液转移至200mL的反应釜中，在200℃下反应10h。待温度冷却至室温，收集材料，水洗、乙醇洗各三次后，室温真空干燥。
第二步用溶胶-凝胶法合成Fe3O4@SiO2核壳磁球：取300mg的上述Fe3O4超声分散在400mL体积比为4：1的乙醇-水体系中，在机械搅拌条件下加入4.0mL的质量浓度25％NH3·H2O。在水浴温度达到40℃后，向反应体系中滴加3.0mL的正硅酸乙酯。机械搅拌条件下，40℃持续反应3小时，收集制得的材料Fe3O4@SiO2。
第三步合成磁性材料Fe3O4@SiO2-NH2：步骤(2)得到的材料Fe3O4@SiO2经乙醇、水、异丙醇洗后，分散在100mL异丙醇中。机械搅拌条件下，缓慢滴加2.0mL APTMS，室温反应24小时，水洗后室温真空干燥得到Fe3O4@SiO2-NH2。
第四步合成羧甲基化的聚乙烯亚胺：在N2氛围下，将20.0g的氯乙酸钠加入到25mL的水中，在30℃条件下搅拌10分钟。取50％的PEI溶液10.0g，加入到100mL的水中，机械搅拌条件下，待温度达到50℃后，向其中缓慢加入上述的氯乙酸钠水溶液，50℃反应1h。水浴加热升温至90℃，在反应体系中滴加3％(W/V)NaOH溶液使体系的pH值维持在10.0，90℃反应2h。之后停止水浴加热，机械搅拌条件下室温反应12h。待反应完成后，向体系中添加浓盐酸至pH值为1。弃上清，沉淀用3％(W/V)NaOH溶液溶解，之后再加浓盐酸至pH值为1，弃上清，加入甲醇，产物白色沉淀真空干燥，得到CMPEI。
第五步合成羧甲基化的聚乙烯亚胺修饰的磁性材料：取30mg的Fe3O4@SiO2-NH2超声分散在3.6mL的3mg/mL CMPEI、0.1M NaCl、pH＝5的聚电解质溶液中，振荡孵育20min，水洗后得到磁性材料Fe3O4@SiO2-CMPEI。将材料再分散在4mL浓度为0.1M的Ni(NO3)2溶液中，室温振荡孵育2小时，水洗后得到材料Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+。合成示意图见图1(A)。
实施例2.磁性固定化金属离子亲和色谱材料对Hexa His tag Peptide固载。
(1)实施例1制备获得的材料Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+吸附Hexa His tag Peptide的热力学进行研究：取500μg的Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+材料，分散在100μL初始浓度为40μg/mL到300μg/mL的Hexa His tag Peptide的溶液中，振荡孵育2小时。磁性分离材料，收集上清液，用于LC-MS分析。相应浓度下的饱和吸附量由Hexa His tag Peptide的特征峰面积在初始溶液与上清溶液中的差值计算。热力学结果见图4。
(2)实施例1制备获得的材料Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+吸附Hexa His tag Peptide的动力学进行研究：500μg的Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+材料分散在100μL浓度为100μg/mL的HexaHis tag Peptide的溶液中，振荡孵育不同时间后，磁性分离材料，收集上清液，用于LC-MS分析。动力学结果见图5。
(3)材料Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+的重复使用情况：500μg的Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+材料与100μL浓度为100μg/mL的Hexa His tag Peptide的溶液振荡孵育2小时，收集上清液，用于LC-MS分析。磁性分离的材料Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+用200μL的0.5M的咪唑洗脱六次，并用大量的水冲洗。再生的磁性材料Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+用于下一次的吸附-洗脱实验，共重复六次。材料的重复使用情况见图6。
(4)LC-MS检测Hexa His tag Peptide：采用液相色谱-质谱联用的多反应监测模式对Hexa His tag Peptide分析。液相色谱条件：色谱柱为BEH C8column(2.1×100mm,1.7μm,Waters,Ireland)。流动相A相为含有0.1％的甲酸水，B相为含有0.1％的甲酸乙腈，梯度条件(min,B)为：(0，15％)(1.0，15％)(2.0，50％)(4.0，100％)(5.0，100％)(5.01，15％)(7.0，15％)，柱温为30℃，流速为0.2mL/min，进样量为5μL。质谱条件：ESI源，喷雾电压为4.0kV，干燥气温度为290℃，鞘气温度为350℃，雾化气压力为50psi。
实施例3.选择性分离细菌裂解液中的带有组氨酸标签的视黄醇类X受体(His-tagged RXR)。
(1)重组组氨酸视黄醇类X受体的表达及提取：将可表达His-tagged RXR的大肠杆菌接种在含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm条件下培养。待OD值达到0.4-0.6之间时，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，20℃，220rpm条件下，诱导表达12小时。4℃，6000rpm离心10min收集菌体，再重悬在上样缓冲液中(20mMPB，10mM咪唑，150mM NaCl，pH7.4)，并补加1.0mM的PMSF。冰水浴条件下，用超声破碎仪对细菌进行裂解(30％功率，10min，5s on，10s off)。4℃，12000g，离心25min，收集含有His-tagged RXR的大肠杆菌的粗提上清液。
(2)选择性分离细菌裂解液中的His-tagged RXR：取实施例1制备获得的5mg的Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+，用100μL的上样缓冲液(20mM PB，10mM咪唑，150mM NaCl，pH7.4)冲洗一次，加入200μL的上述细菌裂解液，4℃条件下振荡孵育2小时。磁性分离材料，收集上清液。材料先用100μL的上样缓冲液洗涤一次，再用40μL的洗涤缓冲液(20mM PB，20mM咪唑，150mM NaCl，pH7.4)于4℃条件下清洗两次，每次10min。最后，用40μL的洗脱缓冲液(20mMPB，500mM咪唑，150mM NaCl，pH7.4)于4℃条件下洗脱两次，每次10min，洗脱His-taggedRXR。利用SDS-PAGE对蛋白纯化产物进行分析。具体纯化结果见图7。

Claims (3)

1.羧甲基化的聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米材料，其特征在于，按如下方法制备获得：先通过溶剂热法合成四氧化三铁磁球，再利用溶胶-凝胶法将正硅酸乙酯包覆在磁球表面合成Fe3O4@SiO2的核壳结构，之后将3-氨丙基三甲基氧基硅烷沉积在Fe3O4@SiO2上形成表面在水溶液中带正电的Fe3O4@SiO2-NH2，随后利用聚阴离子电解质羧甲基化的聚乙烯亚胺CMPEI与Fe3O4@SiO2-NH2之间的静电相互作用生成Fe3O4@SiO2-CMPEI，最后将二价镍离子通过螯合作用固载在核壳材料的最外层，得到磁性固定化金属离子亲和色谱材料Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+;其中，核四氧化三铁的粒径为80-400 nm，顺序沉积正硅酸乙酯、3-氨丙基三甲基氧基硅烷、羧甲基化的聚乙烯亚胺后，壳层的厚度为5-20 nm;材料Fe3O4@SiO2-NH2在水溶液中的ζ 电势为25-40 mV，外层包覆羧甲基化的聚乙烯亚胺后 ζ 电势为-20 ~-40 mV；
所述的羧甲基化的聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米材料的制备方法，包括以下具体步骤：
第一步 采用溶剂热法合成Fe3O4磁球：用1-5 g的FeCl3·6H2O做铁源，0.4 -1.2 g的二水合柠檬酸三钠为稳定剂，1- 4 g的乙酸钠为碱源，加入20-80 mL乙二醇，反应温度在200-220 ℃，反应时间为5-12 h，得到粒径为80-400 nm的Fe3O4磁球；
第二步 采用溶胶-凝胶法合成核壳结构的Fe3O4@ SiO2磁性材料：先将第一步制得的Fe3O4磁球依次用水、乙醇清洗后干燥，再取真空干燥的Fe3O4磁球100-400 mg超声分散在体积比为4/1的100-600 mL的乙醇/水体系中，加入1-6mL 质量浓度25-28%的氨水;机械搅拌条件下，待温度为25-60 ℃时，滴加1-5 mL的正硅酸乙酯，反应2-12小时，产物用磁场收集，得到核壳结构的磁球Fe3O4@SiO2；
第三步 合成磁性材料Fe3O4@SiO2-NH2：取第二步制得的0.2-0.6 g的Fe3O4@ SiO2 磁球,依次分别经过乙醇、水、异丙醇清洗后分散在50-200mL的异丙醇中;滴加1.0-4.0 mL的APTMS,反应温度为20-30 ℃，反应时间为12-24小时，水洗后真空干燥得到Fe3O4@SiO2-NH2；
第四步 合成聚合物羧甲基化的聚乙烯亚胺CMPEI：在N2氛围下，取20.0-30.0 g的氯乙酸钠加入到25-40mL的水中，混合物在30-50 ℃条件下搅拌10-20分钟;取质量浓度50%的PEI溶液10.0-15.0 g，加入到100-150 mL的水中，机械搅拌条件下，待温度达到50-60 ℃后，向其中滴加上述的氯乙酸钠水溶液，50-60 ℃反应1小时;水浴加热升温至90-95 ℃，在反应体系中滴加3-5%W/V NaOH溶液使体系的pH值维持在9.0 - 10.0，90-95 ℃反应2小时；之后停止水浴加热，机械搅拌条件下室温反应8-12小时;待反应完成后，向体系中添加质量分数为36-38%的浓盐酸至pH值为1-2;弃上清，沉淀用3-5%W/V NaOH溶液溶解，之后再加浓盐酸至pH值为1-2，弃上清，加入甲醇，产物白色沉淀真空干燥，得到CMPEI；
第五步 合成磁性固定化金属离子亲和色谱材料Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+：取第三步得到的Fe3O4@SiO2-NH2 材料20-40 mg分散在2-5 mL的包含1-3 mg/mL CMPEI、0.1 -0.15 MNaCl，pH为4-5的溶液中，振荡孵育15-30 min，水洗后得到磁性材料Fe3O4@SiO2-CMPEI;最后将材料分散在3-6 mL浓度为0.1-0.2 M的Ni(NO3)2溶液中，室温振荡孵育2-3小时，水洗后得到材料Fe3O4@SiO2-CMPEI-Ni2+。
2.一种权利要求1所述的羧甲基化的聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米材料作为亲和色谱吸附材料的应用。
3.根据权利要求2所述的羧甲基化的聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米材料作为亲和色谱吸附材料的应用，其特征在于：直接将上述磁性材料加入到大肠杆菌的菌体裂解液中，进行重组组氨酸标签蛋白的选择性捕获。
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Title
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