CN110573619A - 产品和组合物 - Google Patents

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U.舍佩尔
J.豪普特曼
C.弗劳恩多夫
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Abstract

本发明涉及产品和组合物及其用途。特别地，本发明涉及干扰TMPRSS6基因表达或抑制其表达的核酸产品和治疗用途，例如用于治疗血色素沉着病、卟啉症和血液病症，例如β‑地中海贫血、镰状细胞病和输血性铁超负荷或骨髓增生异常综合征。

Description

产品和组合物
本发明涉及产品和组合物及其用途。特别地，本发明涉及干扰TMPRSS6基因表达或抑制其表达的核酸产品和治疗用途，例如用于治疗血色素沉着病、卟啉症和血液病症，例如β-地中海贫血、镰状细胞病和输血性铁超负荷（transfusional iron overload）。
背景
能够互补结合表达的mRNA的双链RNA（dsRNA）已显示能够通过一种已被称为RNA干扰（RNAi）的机制阻断基因表达（Fire等人，1998，Nature. 1998年2月19日；391（6669）：806-11和Elbashir等人，2001，Nature. 2001年5月24日；411（6836）：494-8）。短dsRNAs在许多生物（包括脊椎动物）中指导基因特异性的转录后沉默，并已成为用于研究基因功能的有用工具。RNAi由RNA-诱导性沉默复合物（RISC）介导，所述RISC是一种序列特异性的多组分核酸酶，其破坏与装载到RISC复合物中的沉默触发物同源的信使RNAs。干扰RNA（iRNA）如siRNAs、反义RNA和微RNA是通过基因沉默阻止蛋白质形成的寡核苷酸，即通过mRNA分子的降解抑制蛋白质的基因翻译。基因沉默剂对于医学中的治疗应用变得越来越重要。
根据Watts和Corey在Journal of Pathology（2012；第226卷，第365-379页）中，存在可用于设计核酸沉默触发物的算法，但所有这些都有严重的局限性。因为算法没有考虑诸如靶mRNA的三级结构或RNA结合蛋白的牵涉的因素，所以其可能需要各种实验方法来鉴定有效的siRNAs。因此，发现具有最小脱靶（off-target）效应的有效核酸沉默触发物是一个复杂的过程。对于这些高度带电分子的药物开发，它们能够经济地合成、分配到靶组织、进入细胞并在可接受的毒性限度内发挥作用是必需的。
间质蛋白酶（Matriptase）-2（MT-2）是TMPRSS6基因的产物。MT-2是II型跨膜丝氨酸蛋白酶，其在铁稳态的调节中起关键作用。MT-2是肽激素铁调素（hepcidin）的基因表达的负调节物。铁调素主要由肝产生和分泌。铁调素通过充当胃肠铁吸收和从细胞贮藏所释放铁的负调节物来调节体内的铁平衡。铁调素的上调导致体内铁的可用性降低（McDonald等人，American Journal of Physiology，2015，第08卷第7期, C539-C547）。患有铁超负荷的患者中铁调素水平低。因此，用于降低铁超负荷的可能靶是通过沉默肝中的TMPRSS6基因表达来增加铁调素。
TMPRSS6主要在肝中表达，尽管在肾中也发现了高水平的TMPRSS6 mRNA，子宫中的水平较低，而在许多其他组织中检测到的量小得多（Ramsay等人，Haematologica（2009），94（*6），84-849）。
各种疾病与特征在于升高的血液和组织铁水平的状况铁超负荷有关，如遗传性血色素沉着病、迟发性皮肤卟啉症和血液病症，如· -地中海贫血、先天性铁粒幼红细胞性贫血（CSA）、先天性红细胞生成不良性贫血（CDA）、骨髓衰竭综合征、脊髓发育不良和镰状细胞病（SCD）。此外，所有接受经常输血的患者群体都处于发展输血性铁超负荷的危险之中（Coates，Free Rad Biol Med 2014，第72卷,23-40，Bulaj等人，Blood 2000，第95卷,1565-71）。Nai等人（Blood，2012，第119卷，第21期，第5021-5027页）和Guo等人（TheJournal of Clinical Investigation，2013，第123卷，第4期，第1531-1541页）的论文都显示TMPRSS6表达的缺失或减少如何在治疗小鼠的β-地中海贫血中有效。Schmidt（2013，Blood，第121卷，7，第1200-1208页）的论文仔细研究了TMPRSS6核酸在遗传性血色素沉着病和β-地中海贫血的小鼠模型中降低铁超负荷的用途。在两个模型中，作者确定脂质纳米颗粒-TMPRSS6核酸处理诱导铁调素并且减低组织和血清铁水平达最多到21天。此外，Schmidt等人（American Journal of Hematology，2015，第90卷，第4期，第310-313页）的论文证明LNP-TMPRSS6核酸加口服铁螯合剂去铁酮（deferiprone）疗法降低β-地中海贫血小鼠模型中的继发性铁超负荷。
因此，目前需要有效治疗与铁超负荷有关的病症的方法，并且本发明解决了这种需要。
本发明的第一方面涉及用于抑制TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NOs: 317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440或442，或所述第一链包含选自SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、67、69、71、73、74、76、77、78、79、80、81、82、83、85、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、270、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、309、311、312、313、314或315的序列，例如SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213或215。
本发明的进一步相关方面是用于抑制TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第二链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NOs 318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、357、359. 361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441或443，或所述第二链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、68、70、72、75、84、86、89、100、101、102、103、104、105、106、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、226、228、230、232、234、236、238、240、242、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、310、312、314或316，例如选自以下的序列：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214或216。
某些核酸在本发明的所有方面都是优选的。特别地：
第一链可包含SEQ ID NO：333的核苷酸序列和/或第二链可包含SEQ ID NO：334的核苷酸序列。
第一链可包含SEQ ID NO：17的核苷酸序列和/或第二链可包含SEQ ID NO：18的核苷酸序列，即：
第一链可包含SEQ ID NO：422的核苷酸序列和/或第二链可包含SEQ ID NO：423的核苷酸序列。
第一链可包含SEQ ID NO：199的核苷酸序列和/或第二链可包含SEQ ID NO：200的核苷酸序列。
第一链可包含SEQ ID NO：429的核苷酸序列和/或第二链可包含SEQ ID NO：430的核苷酸序列。
第一链可包含SEQ ID NO：207的核苷酸序列和/或第二链可包含SEQ ID NO：208的核苷酸序列。
本文可以与特定接头和/或配体结合在序列表中公开核酸，但是在序列表的上下文中对接头或配体的任何提及是任选的，尽管这些特征是优选的。某些优选的接头与某些核酸序列共同公开。
第一链和/或所述第二链各自的长度可以为17-35个核苷酸，并且至少一个双链体区的长度可以为10-25个核苷酸。双链体可包含两条分开的链或其可包含单链，所述单链包含第一链和第二链。
核酸可以：a）在两端都是平端的；b）在一端具有突出端而在另一端具有平端；或c）在两端都具有突出端。
可以修饰第一和/或第二链上的一个或多个核苷酸，以形成修饰的核苷酸。可以修饰第一链的奇数核苷酸中的一个或多个。第一链的偶数核苷酸中的一个或多个可以通过至少第二修饰进行修饰，其中所述至少第二修饰不同于一个或多个奇数核苷酸上的修饰。一个或多个修饰的偶数核苷酸中的至少一个可以与一个或多个修饰的奇数核苷酸中的至少一个相邻。
可以在本发明的核酸中修饰第一链中的多个奇数核苷酸。第一链中的多个偶数核苷酸可以通过第二修饰进行修饰。第一链可包含通过共同修饰修饰的相邻核苷酸。第一链还可以包含通过第二不同修饰修饰的相邻核苷酸。
第二链的奇数核苷酸中的一个或多个可以通过与第一链上的奇数核苷酸的修饰不同的修饰进行修饰和/或第二链的偶数核苷酸中的一个或多个可以通过与第一链上的奇数核苷酸相同的修饰进行修饰。第二链的一个或多个修饰的偶数核苷酸中的至少一个可以与一个或多个修饰的奇数核苷酸相邻。第二链的多个奇数核苷酸可以通过共同修饰进行修饰和/或多个偶数核苷酸可以通过存在于第一链奇数核苷酸上的相同修饰进行修饰。第二链上的多个奇数核苷酸可以通过第二修饰进行修饰，其中所述第二修饰不同于第一链奇数核苷酸的修饰。
第二链可以包含通过共同修饰修饰的相邻核苷酸，其可以是不同于第一链的奇数核苷酸的修饰的第二修饰。
在本发明的核酸中，第一链中的每个奇数核苷酸和第二链中的每个偶数核苷酸可以用共同修饰进行修饰，并且每个偶数核苷酸可以在第一链中用第二修饰进行修饰，且每个奇数核苷酸可以在第二链中用第二不同修饰进行修饰。
相对于第二链的未修饰或不同修饰的核苷酸，本发明的核酸可以使第一链的修饰的核苷酸移动至少一个核苷酸。
修饰和/或多种修饰可以各自和单独地选自3'-末端脱氧胸腺嘧啶、2'-O-甲基、2'-脱氧-修饰、2'-氨基-修饰、2'-烷基-修饰、吗啉代修饰、氨基磷酸酯修饰、5'-硫代磷酸酯基团修饰、5'磷酸或5'磷酸模拟物修饰和胆甾烯基衍生物或十二烷酸双癸酰胺（bisdecylamide）基团修饰和/或修饰的核苷酸可以是锁定核苷酸、无碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任何一种。
至少一种修饰可以是2'-O-甲基和/或至少一种修饰可以是2'-F。
作为第二方面，本发明进一步提供了用于抑制TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第一链包含选自以下序列：
或者选自
例如
其中第一链的核苷酸在奇数核苷酸上通过第一修饰进行修饰，并在偶数核苷酸上通过第二修饰进行修饰，并且第二链的核苷酸在偶数核苷酸上通过第三修饰进行修饰，并在奇数核苷酸上通过第四修饰进行修饰，其中至少所述第一修饰与所述第二修饰不同，且所述第三修饰与所述第四修饰不同。
作为相关的第二方面，本发明进一步提供了用于抑制TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第二链可包含选自以下序列：SEQ ID no’s 318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、357、359. 361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441或443，
或选自
例如选自以下的序列：SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214或216，
其中第一链的核苷酸在奇数核苷酸上通过第一修饰进行修饰，并在偶数核苷酸上通过第二修饰进行修饰，并且第二链的核苷酸在偶数核苷酸上通过第三修饰进行修饰，并在奇数核苷酸上通过第四修饰进行修饰，其中至少所述第一修饰与所述第二修饰不同，且所述第三修饰与所述第四修饰不同。
第三修饰和第一修饰可以是相同的和/或第二修饰和第四修饰可以是相同的。
第一修饰可以是2'OMe，且第二修饰可以是2'F。
在任何方面的核酸中，例如第二方面，第一链可包含SEQ ID NO：17的核苷酸序列，且第二链可包含SEQ ID NO：18的核苷酸序列。序列和修饰可以如下表所示：
其中具体修饰由下列数字描述
如上文所教导的，这些是优选的序列，以及其他优选的序列。
本发明的核酸可以在第一和/或第二链的末端一个、两个或三个3'核苷酸和/或一个两个或三个5'核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。它可以在第一链上的三个末端3'的每一个之间和三个末端5'核苷酸的每一个之间包含两个硫代磷酸酯键，并且在第二链的3'端的三个末端核苷酸之间包含两个硫代磷酸酯键。
这种核酸可以与配体缀合。
作为第三方面，本发明进一步提供了用于抑制TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第一链包含选自以下序列，
或者选自
例如
且其中所述核酸与配体缀合。
作为进一步相关的方面，本发明进一步提供了用于抑制TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第二链包含选自以下序列的核苷酸序列，
或所述第二链包含选自以下序列的核苷酸序列：
例如选自以下的序列：
且其中所述核酸与配体缀合。
配体可包含（i）一种或多种N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）部分及其衍生物，和（ii）接头，其中所述接头将所述GalNAc部分与任何前述方面中定义的序列缀合。接头可以是二价或三价或四价分支结构。可以如本文所定义的修饰核苷酸。
配体可包含式I：
[S-X1-P-X2]3-A-接头- （I）
其中：
S代表糖，其中所述糖是N-乙酰半乳糖胺；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m为1、2或3；
P是磷酸或改性磷酸（优选硫代磷酸）；
X2为亚烷基或式(-CH2)n-O-CH2-的亚烷基醚，其中n = 1-6；
A是分支单元；
X3代表桥连单元；
其中根据本发明的核酸通过磷酸或改性磷酸（优选硫代磷酸）与X3缀合。
因此，本发明另外提供具有以下结构之一的缀合的核酸
其中Z代表如前文所定义的核酸。
另一方面，根据本发明的核酸可以与具有以下结构的配体缀合
本发明还提供了包含如本文所定义的核酸和包含以下物质的制剂的组合物：
i）阳离子脂质或其药学上可接受的盐；
ii）类固醇；
iii）磷脂酰乙醇胺磷脂；
iv）加入聚乙二醇的脂质。
制剂中阳离子脂质组分的含量可以是脂质制剂的总脂质含量的约55摩尔％至约65摩尔％，优选脂质制剂的总脂质含量的约59摩尔％。
制剂可包含具有以下结构的阳离子脂质
具有以下结构的类固醇；
具有以下结构的磷脂酰乙醇胺磷脂；
和具有以下结构的加入聚乙二醇的脂质；
本发明还提供了包含本发明任何方面的核酸或缀合的核酸和生理学上可接受的赋形剂的组合物。
还提供了根据本发明任一方面的核酸或缀合的核酸，其用于治疗疾病或病症和/或制备用于治疗疾病或病症的药物。
本发明提供了治疗或预防疾病或病症的方法，包括向需要治疗的个体施用包含根据本发明任一方面的核酸或缀合的核酸的组合物。核酸或缀合的核酸可以皮下、静脉内或使用任何其他应用途径（例如口服、直肠或腹膜内）施用给主体。
所述疾病或病症可选自血色素沉着病、迟发性皮肤卟啉症和血液病症，例如β-地中海贫血或镰状细胞病、先天性红细胞生成不良性贫血、骨髓衰竭综合征、脊髓发育不良和输血性铁超负荷。该病症可能与铁超负荷有关，且与铁超负荷有关的病症可能是帕金森病、阿尔茨海默病或弗里德赖希共济失调。
还包括制备根据本发明的核酸或缀合的核酸的方法。
发明详述
本发明涉及一种双链且指向TMPRSS6的表达的RNA转录物的核酸及其组合物。这些核酸可用于治疗多种疾病和病症，其中降低的TMPRSS6基因产物的表达是期望的。
本发明的第一方面涉及用于抑制细胞中TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第一链包含选自以下序列：
或选自
例如
核酸的意思是包含两条包含核苷酸的链的核酸，其能够干扰基因表达。抑制可以是完全的或部分的，并且导致靶向方式的基因表达的下调。核酸包含两条分开的多核苷酸链；第一链，其也可以是指导链；和第二链，其也可以是过客链。第一链和第二链可以是自身互补的相同多核苷酸分子的一部分，其‘折叠’以形成双链分子。核酸可以是siRNA分子。
核酸可包含核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、脱氧核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核苷酸类似物。核酸可以进一步包含由第一链（在本领域中也称为指导链）的全部或一部分和第二链（在本领域中也称为过客链）的全部或一部分形成的双链核酸部分或双链体区。双链体区定义为以在第一链和第二链之间形成的第一个碱基对开始，并以在第一链和第二链之间形成的最后一个碱基对结束，包括第一个碱基对和最后一个碱基对。
双链体区的意思是两个互补或基本上互补的寡核苷酸中的区域，所述寡核苷酸通过Watson-Crick碱基配对或允许在互补或基本上互补的寡核苷酸链之间形成双链体的任何其他方式彼此形成碱基对。例如，具有21个核苷酸单元的寡核苷酸链可与另一个21个核苷酸单元的寡核苷酸碱基配对，但每条链上仅19个核苷酸互补或基本上互补，从而使得“双链体区”由19个碱基对组成。剩余的碱基对可以作为5·和3·突出端存在，或作为单链区存在。进一步地，在双链体区内，不需要100％的互补性；在双链体区内允许相当大的互补性。相当大的互补性是指这样的链之间的互补性，以致使得它们能够在生物条件下退火。用于根据经验确定两条链是否能够在生物条件下退火的技术是本领域众所周知的。另一方面，可以合成两条链并在生物条件下一起添加以确定它们是否彼此退火。
形成至少一个双链体区的第一链和第二链的部分可以是完全互补的并且彼此至少部分互补。
取决于核酸的长度，不一定需要在第一链和第二链之间的碱基互补性方面的完美匹配。然而，第一和第二链必须能够在生理条件下杂交。
由于在任一链中都没有核苷酸错配或额外/缺失的核苷酸，至少一个双链体区中第一链和第二链之间的互补性可以是完美的。另一方面，互补性可能不完美。互补性可以是至少70％、75％、80％、85％、90％或95％。
第一链和第二链各自可包含互补性区，其包含与表1中列出的任一序列相差不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸。
本发明的相关方面涉及用于抑制细胞中TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第二链包含选自以下序列：
或者选自
例如选自以下的序列：
适当地，在本发明的任何方面，第二和第一链在一起是本文公开的互补核酸对的任一种，例如SEQ ID 1和2、3和4等的那些。
由SEQ ID 17和18组成的核酸的组合是优选的组合，SEQ 199和200以及SEQ ID207和208也是这样。
核酸涉及在第一链的全部或部分与靶核酸TMPRSS6的部分之间形成双链体区。靶核酸与第一链形成双链体区的部分是靶核酸序列或简称靶序列，其定义为以在第一链和靶序列之间形成的第一个碱基对开始并且以在第一链和靶序列之间形成的最后一个碱基对结束，包括第一个碱基对和最后一个碱基对。在第一链和第二链之间形成的双链体区不需要与在第一链和靶序列之间形成的双链体区相同。也就是说，第二链可以具有与靶序列不同的序列，然而，第一链必须能够与第二链和靶序列两者形成双链体结构。
第一链和靶序列之间的互补性可以是完美的（在每一种核酸中都没有核苷酸错配或额外/缺失的核苷酸）。
第一链和靶序列之间的互补性可能不完美。互补性可以为约70％至约100％。更具体地，互补性可以是至少70％、80％、85％、90％或95％，或中间值。
第一链和靶序列的互补序列之间的同一性可以为约75％至约100％。更具体地，互补性可以是至少75％、80％、85％、90％或95％，或中间值，只要核酸能够降低或抑制TMPRSS6的表达。
第一链和靶序列之间具有小于100％互补性的核酸可能能够将TMPRSS6的表达降低至与第一链和靶序列之间具有完全互补性的核酸相同的水平。另一方面，它可能能够将TMPRSS6的表达降低至通过具有完美互补性的核酸实现的表达水平的15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的水平。
核酸可包含第一链和第二链，其每一种的长度为19-25个核苷酸。第一链和第二链可以具有不同的长度。
核酸的长度可以是15-25个核苷酸对。核酸的长度可以是17-23个核苷酸对。核酸的长度可以是17-25个核苷酸对。核酸的长度可以是23-24个核苷酸对。核酸的长度可以是19-21个核苷酸对。核酸的长度可以是21-23个核苷酸对。
核酸可包含由19-25个核苷酸碱基对组成的双链体区。双链体区可以由17、18、19、20、21、22、23、24或25个碱基对组成，它们可以是邻接的。
核酸可包含SEQ ID NO：17的第一链序列。核酸可包含SEQ ID NO：18的第二链序列。本发明的核酸可包含SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。
在进一步的方面，与在没有抑制剂（其可以是核酸）的情况下观察到的水平相比，本文所述的核酸可以将细胞中TMPRSS6的表达降低至少15％。任何前述方面的所有优选特征也适用于这个方面。特别地，比起在没有抑制剂（其可以是核酸）的情况下所观察到的来，细胞中TMPRSS6的表达可以降低至90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%或更低，以及中间值。
本发明还涉及本文公开的核酸的任何第一链或任何第二链，其当与所提供的具体序列ID相比时包含不多于2个碱基变化。例如，可以在任何序列内改变一个碱基。
在一个实施方案中，可以对反义（第一）链的最5'核苷酸进行改变。在一个实施方案中，可以对反义（第一）链的最3'核苷酸进行改变。在一个实施方案中，可以对有义（第二）链的最5'核苷酸进行改变。在一个实施方案中，可以对有义（第二）链的最3'核苷酸进行改变。
在一个实施方案中，对反义（第一）链的最5'核苷酸进行改变。5'核苷酸的碱基可以改变为任何其他核苷酸。优选5'端的A或U，并且本文教导A或U作为本文公开的所有反义（第一链）序列的潜在5'末端碱基。
突出端
核酸可以在两端都是平端的；在一端具有有突出端而在另一端具有平端；或者在两端都具有突出端。
本文使用的“突出端”具有其在本领域中的正常和通常含义，即，延伸超出双链核酸中互补链的末端核苷酸的核酸的单链部分。术语“平端”包括双链核酸，由此两条链终止于相同位置，而不管一个或多个末端核苷酸是否是碱基配对的。平端的第一链和第二链的末端核苷酸可以是碱基配对的。平端的第一链和第二链的末端核苷酸可以不配对。平端的第一链和第二链的末端两个核苷酸可以是碱基配对的。平端的第一链和第二链的末端两个核苷酸可以不配对。
核酸可以在一端具有突出端而在另一端具有平端。核酸可以在两端都具有突出端。核酸可以在两端都是平端的。核酸可以在第一链的5'-端和第二链的3'-端或在第一链的3'-端和第二链的5'-端是平端的。
核酸可以在3'-或5'-端包含突出端。核酸可以在第一链上具有3'-突出端。核酸可以在第二链上具有3'-突出端。核酸可以在第一链上具有5'-突出端。核酸可以在第二链上具有5'-突出端。核酸可以在第一链的5'-端和3'-端都具有突出端。核酸可以在第二链的5'-端和3'-端都具有突出端。核酸可以在第一链上具有5'突出端，且在第二链上具有3'突出端。核酸可以在第一链上具有3'突出端，且在第二链上具有5'突出端。核酸可以在第一链上具有3'突出端，且在第二链上具有3'突出端。核酸可以在第一链上具有5'突出端，且在第二链上具有5'突出端。
第二链或第一链的3'-端或5'端的突出端的长度可选自1、2、3、4和5个核苷酸。任选地，突出端可以由1或2个核苷酸组成，其可以被修饰或不被修饰。
修饰
未修饰的多核苷酸，特别是核糖核苷酸，可能易于被细胞核酸酶降解，且因此，修饰/修饰的核苷酸可包括在本发明的核酸中。
可以修饰本发明核酸的第二和/或第一链上的一个或多个核苷酸。
本发明核酸的修饰通常提供克服潜在局限性的有力工具，包括但不限于天然RNA分子固有的体外和体内稳定性和生物利用率。可以通过化学修饰来修饰根据本发明的核酸。修饰的核酸还可以将在人中诱导干扰素活性的可能性减至最小。修饰可以进一步增强核酸向靶细胞的功能性递送。本发明的修饰的核酸可包含第一链或第二链中的任一者或两者的一种或多种化学修饰的核糖核苷酸。核糖核苷酸可包含碱基、糖或磷酸部分的化学修饰。可以通过用核酸或碱基的类似物取代或插入来修饰核糖核酸。
将理解的是，修饰的核酸，特别是例如修饰的RNA的公开内容既提供了“一级”核酸序列的公开内容，且也提供了该序列的修饰。因此，序列表提供了关于一级核酸序列以及修饰的序列的信息。为避免疑惑，且本发明涉及未修饰的核酸序列、部分修饰的和任何已完全定义修饰的序列。
可以修饰本发明核酸的一个或多个核苷酸。核酸可包含至少一个修饰的核苷酸。修饰的核苷酸可以在第一链上。修饰的核苷酸可以在第二链中。修饰的核苷酸可以在双链体区中。修饰的核苷酸可以在双链体区之外，即，在单链区中。修饰的核苷酸可以在第一链上，并且可以在双链体区外。修饰的核苷酸可以在第二链上，并且可以在双链体区外。第一链的3'-末端核苷酸可以是修饰的核苷酸。第二链的3'-末端核苷酸可以是修饰的核苷酸。第一链的5'-末端核苷酸可以是修饰的核苷酸。第二链的5'-末端核苷酸可以是修饰的核苷酸。
本发明的核酸可具有1个修饰的核苷酸或本发明的核酸可具有约2-4个修饰的核苷酸，或核酸可具有约4-6个修饰的核苷酸、约6-8个修饰的核苷酸、约8- 10个修饰的核苷酸、约10-12个修饰的核苷酸、约12-14个修饰的核苷酸、约14-16个修饰的核苷酸、约16-18个修饰的核苷酸、约18-20个修饰的核苷酸、约20-22个修饰的核苷酸、约22-24个修饰的核苷酸、24-26个修饰的核苷酸或约26-28个修饰的核苷酸。在每种情况下，与相同但没有所述修饰的核苷酸的核酸相比，包含所述修饰的核苷酸的核酸保留其活性的至少50％。与相同但没有所述修饰的核苷酸的核酸相比，核酸可以保留其活性的55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100％或中间值，或者可以具有相同但没有所述修饰的核苷酸的核苷酸的活性的超过100％。
修饰的核苷酸可以是嘌呤或嘧啶。至少一半的嘌呤可以被修饰。至少一半的嘧啶可以被改性。可以修饰所有嘌呤。可以修饰所有嘧啶。修饰的核苷酸可以选自3'-末端脱氧胸腺嘧啶（dT）核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁定核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含5'磷酸或5'磷酸模拟物的核苷酸和与胆甾烯基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。
核酸可包含核苷酸，包含修饰的核苷酸，其中碱基选自2-氨基腺苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、吡啶-4-酮（pyridin-4-one）、吡啶-2-酮（pyridin-2-one）、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷（如5-甲基胞苷）、5-烷基尿苷（如胸腺嘧啶核糖核苷）、5-卤代尿苷（5-halouridine）（如5-溴尿苷）、6-氮嘧啶、6-烷基嘧啶（如6-甲基尿苷）、丙炔、quesosine、2-硫尿苷、4-硫尿苷、怀丁苷、wybutoxosine、4-乙酰胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、5'-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、beta-D-galactosylqueosine、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲基氧尿苷（5-methyloxyuridine）、5-甲基-2-硫尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、beta-D-mannosylqueosine、尿苷-5-羟基乙酸和2-硫胞苷。
本文讨论的核酸包括未修饰的RNA以及已被修饰的RNA，例如，以提高功效，以及核苷替代物的聚合物。未修饰的RNA指这样的分子，其中核酸的组分（即，糖、碱基和磷酸部分）与天然存在的（例如天然存在于人体中的）组分相同或基本相同。本文所用的修饰的核苷酸指其中核酸的一种或多种组分（即，糖、碱基和磷酸部分）不同于天然存在的组分的核苷酸。虽然它们被称为修饰的核苷酸，但它们当然会因为修饰而包括不是核苷酸的分子，例如其中核糖磷酸（ribophosphate）主链被非核糖磷酸构建体置换的多核苷酸分子，其允许链之间的杂交，即，修饰的核苷酸模拟核糖磷酸主链。
下文描述的在核酸内发生的许多修饰将在多核苷酸分子内重复，例如碱基、或磷酸部分、或磷酸部分的非连接O的修饰。在一些情况下，修饰将发生在多核苷酸中的所有可能位置/核苷酸处，但在许多情况下它将不这样。修饰可以仅发生在3·或5·末端位置，可以仅发生在末端区域，例如末端核苷酸上的位置或链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。修饰可以在双链区、单链区或两者中发生。修饰可以仅在本发明的核酸的双链区中发生，或者可以仅在本发明的核酸的单链区中发生。在非连接O位置的硫代磷酸酯修饰可以仅发生在一个或两个末端，可以仅发生在末端区，例如，在末端核苷酸上的位置或链的最后2、3、4或5个核苷酸中，或可以在双链体和/或单链区中发生，特别是在末端。5·端或3'端可以被磷酸化。
本发明的核酸的稳定性可以通过在突出端中包含特定碱基，或通过在单链突出端例如在5·或3·突出端或两者中包含修饰的核苷酸来增加。嘌呤核苷酸可包括在突出端中。可以修饰3·或5·突出端中的全部或一些碱基。修饰可以包括使用在核糖糖的2·OH基团的修饰，使用脱氧核糖核苷酸代替核糖核苷酸，以及在磷酸基团中的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。突出端不需要与靶序列同源。
可以磷酸化本发明的dsRNA试剂的有义链、反义链或两条链上的5'-或3'-突出端。在一些实施方案中，突出端区含有两个核苷酸，其在两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯，其中两个核苷酸可以相同或不同。在一个实施方案中，突出端存在于有义链、反义链或两条链的3'-端。在一个实施方案中，这个3'-突出端存在于反义链中。在一个实施方案中，这个3'-突出端存在于有义链中。
核酸酶可以水解核酸磷酸二酯键。然而，对核酸的化学修饰可赋予改善的性质，并且可使寡核糖核苷酸对核酸酶更稳定。
如本文所用的，修饰的核酸可包括以下一种或多种：
（i）改变，例如，置换一个或两个非连接磷酸氧和/或一个或多个连接磷酸氧（即使在本发明的核酸的5'和3'末端也称为连接）；
（ii）改变，例如，置换核糖糖的成分，例如，核糖糖上的2·羟基；
（iii）用“脱磷酸”接头置换磷酸部分；
（iv）修饰或置换天然存在的碱基；
（v）置换或修饰核糖-磷酸主链；
（vi）RNA的3·端或5·端的修饰，例如，末端磷酸基团的去除、修饰或置换或部分（例如荧光标记的部分）与RNA的3·或5·端的缀合。
术语置换、修饰、改变表示与天然存在的分子的差异。
下面更详细地讨论具体的修饰。
改性磷酸基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯（phosphoroselenates）、硼烷磷酸（borano phosphate）、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯（phosphoroamidates）、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯具有被硫置换的非连接氧。磷酸基团中的一个、每个或两个非连接氧可以独立地是S、Se、B、C、H、N或OR中的任何一个（R是烷基或芳基）。
也可以通过用氮（桥连氨基磷酸酯）、硫（桥连硫代磷酸酯）和碳（桥连亚甲基膦酸酯）置换连接氧来修饰磷酸接头。置换可以在末端氧处进行。用氮置换非连接氧是可能的。
修饰的核苷酸可包括糖基团的修饰。2·羟基（OH）可以用许多不同的“氧”或“脱氧”取代基修饰或置换。
“氧”-2·羟基修饰的实例包括烷氧基或芳氧基（OR，例如，R·H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖）；聚乙二醇（PEG），O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；“锁定”核酸（LNA），其中2·羟基例如通过亚甲桥连接到相同核糖糖的4·碳；O-AMINE（AMINE=NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环、芳氨基、二芳氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基）和氨基烷氧基（aminoalkoxy），O(CH2)nAMINE，（例如，AMINE=NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环、芳氨基、二芳氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基）。
“脱氧”修饰包括氢卤；氨基（例如，NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环、芳氨基、二芳氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸）；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE（AMINE=NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环、芳氨基、二芳氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基），
—NHC(O)R（R =烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖），氰基；巯基；烷基-硫代-烷基；硫代烷氧基；和烷基、环烷基、芳基、链烯基和炔基，其可任选地被例如氨基官能团（functionality）取代。某些实施方案的其他取代基包括2·-甲氧基乙基，2·-OCH3、2·-O-烯丙基、2·-C-烯丙基和2·-氟。
糖基团还可含有一个或多个碳，其具有与核糖中相应碳相反的立体化学构型。因此，修饰的核苷酸可含有糖，例如阿拉伯糖。
修饰的核苷酸还可以包含“无碱基”糖，其在C-I·缺乏核碱基（nucleobase）。这些无碱基糖可以进一步含有在一个或多个成分糖原子处的修饰。
2·修饰可以与一种或多种磷酸接头修饰（例如硫代磷酸酯）组合使用。
磷酸基团可以用不含磷的连接剂（connectors）置换。
可以置换磷酸基团的部分的实例包括硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、氨磺酰、硫代甲缩醛（thioformacetal）、甲缩醛（formacetal）、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基1,2-亚肼基、亚甲基二甲基1,2-亚肼基和亚甲氧基甲基亚氨基。在某些实施方案中，置换可包括亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基基团。
磷酸接头和核糖糖可以被核酸酶抗性核苷酸置换。
实例包括吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸（PNA）核苷替代物。在某些实施方案中，可以使用PNA替代物。
可以修饰寡核苷酸的3·和5·端。这种修饰可以在分子的3·端或5·端或两端。它们可包括修饰或置换整个末端磷酸或磷酸基团的一个或多个原子。例如，寡核苷酸的3·和5·端可以与其他功能性分子实体缀合，例如标记部分，例如荧光团（例如，芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料）或保护基团（基于例如硫、硅、硼或酯）。功能性分子实体可以通过磷酸基团和/或接头与糖附着。接头的末端原子可连接到或置换磷酸基团的连接原子或糖的C-3·或C-5·O、N、S或C基团。另一方面，接头可连接到或置换核苷酸替代物（例如，PNAs）的末端原子。这些间隔基或接头可包括例如—(CH2)n—、—(CH2)nN—、—(CH2)nO—、—(CH2)nS—、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH（例如，n=3或6）、无碱基糖、酰胺、羧基、胺、羟基胺、氧亚胺（oxyimine）、硫醚、二硫化物、硫脲、氨磺酰或吗啉代，或生物素和荧光素试剂。3·端可以是—OH基团。
末端修饰的其他实例包括染料、嵌入剂（例如，吖啶）、交联剂（例如，补骨脂内酯、丝裂霉素C）、卟啉（TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin）、多环芳烃（例如，吩嗪、二氢吩嗪）、人工内切核酸酶（例如，EDTA）、亲脂性载体（例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、双氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧己基（geranyloxyhexyl group）、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩 嗪）和肽缀合物（例如，触角足（antennapedia）肽、Tat肽）、烷化剂、磷酸、氨基、巯基、PEG（例如，PEG-40K）、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标记、酶、半抗原（例如，生物素）、转运/吸收促进剂（facilitators）（如，阿司匹林、维生素E、叶酸）、合成核糖核酸酶（例如，咪唑、双咪唑（bisimidazole）、组胺、咪唑簇（imidazole clusters）、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+络合物）。
可以出于多种原因添加末端修饰，包括调节活性或调节对降解的抗性。用于调节活性的末端修饰包括用磷酸或磷酸类似物修饰5·端。在第一或第二链上的本发明的核酸可以是5·磷酸化的或在5·'末端包含磷酰基类似物。5·-磷酸修饰包括与RISC介导的基因沉默相容的那些修饰。合适的修饰包括：5·-单磷酸（(HO)2(O)P—O-5·）；5·-二磷酸（(HO)2(O)P—O—P(HO)(O)—O-5·）；5·-三磷酸（(HO)2(O)P—O—(HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5·）；5·-鸟苷帽（7-甲基化的或非甲基化的）（7m-G-O-5·-(HO)(O)P—O—(HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5·）；5·-腺苷帽（Appp），以及任何修饰或未修饰的核苷酸帽结构（N—O-5·-(HO)(O)P—O—(HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5·）；5·-单硫代磷酸酯（硫代磷酸酯；(HO)2(S)P—O-5·）；5·-单二硫代磷酸酯（二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P—O-5·），5·-硫代磷酸酯（(HO)2(O)P—S-5·）；任何额外的氧/硫置换的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的组合（例如，5·-α-硫代三磷酸酯、5·-γ-硫代三磷酸酯等），5·-氨基磷酸酯（(HO)2(O)P—NH-5·、(HO)(NH2)(O)P—O-5·），5·-烷基膦酸酯（R =烷基=甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如，RP(OH)(O)—O-5·-、(OH)2(O)P-5·-CH2-），5'乙烯基膦酸酯，5·-烷基醚膦酸酯（R =烷基醚=甲氧基甲基（MeOCH2-）、乙氧基甲基等，例如，RP(OH)(O)—O-5·-）。
本发明的核酸可包括在第一和/或第二链的一个或多个末端上的一个或多个硫代磷酸酯修饰。任选地，第一链的每个或任一端可包含一个或两个或三个硫代磷酸酯修饰的核苷酸。任选地，第二链的每个或任一末端可包含一个或两个或三个硫代磷酸酯修饰的核苷酸。任选地，第一链的两端和第二链的5'端可包含两个硫代磷酸酯修饰的核苷酸。硫代磷酸酯修饰的核苷酸的意思是指核苷酸和相邻核苷酸之间的键包含硫代磷酸酯基团而不是标准磷酸基团。
末端修饰也可用于监控分布，并且在这种情况下，待添加的基团可包括荧光团，例如荧光素或Alexa染料。末端修饰也可用于增强摄取，对此有用的修饰包括胆固醇。末端修饰也可用于将RNA试剂交联到另一部分。
核苷酸
腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶是RNA中最常见的碱基。可以修饰或置换这些碱基以提供具有改善的性质的RNA。例如，核酸酶抗性寡核糖核苷酸可以用这些碱基或用合成和天然核碱基（例如，肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、巴豆苷（isoguanisine）或杀结核菌素（tubercidine））和任何一种上述修饰制备。另一方面，可以使用任何上述碱基和“通用碱基”的取代或修饰的类似物。例子包括2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，5-卤尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶（假尿嘧啶），4-硫尿嘧啶，5-卤尿嘧啶，5-(2-氨丙基)尿嘧啶，5-氨基烯丙基尿嘧啶，8-卤，氨基，硫羟，硫代烷基，羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤，5-取代的嘧啶，6-氮嘧啶和N-2，N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶，二氢尿嘧啶，3-脱氮-5-氮胞嘧啶，2-氨基嘌呤，5-烷基尿嘧啶，7-烷基鸟嘌呤，5-烷基胞嘧啶，7-脱氮腺嘌呤，N6,N6-二甲基腺嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，5-氨基-烯丙基-尿嘧啶，N3-甲基尿嘧啶，取代的1,2,4-三唑，2-吡啶酮（2-pyridinone），5-硝基吲哚，3-硝基吡咯，5-甲氧基尿嘧啶，尿嘧啶-5-羟基乙酸，5-甲氧羰基甲基尿嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，5-甲氧羰基甲基-2-硫尿嘧啶，5-甲氨基甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧啶，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N<4>-乙酰胞嘧啶，2-硫胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，N6-异戊基腺嘌呤，2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤，N-甲基鸟嘌呤或O-烷基化的碱基。
如本文所用的，术语“非配对核苷酸类似物”是指包含非碱基配对部分的核苷酸类似物，包括但不限于：6脱氨腺苷（烟云杯伞素（Nebularine）），4-Me-吲哚，3-硝基吡咯，5-硝基吲哚，Ds，Pa，N3-Me ribo U，N3-Me riboT，N3-Me dC，N3-Me-dT，N1-Me-dG，N1-Me-dA，N3-乙基-dC，N3-Me DC。在一些实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物是核糖核苷酸。在其他实施方案中，它是脱氧核糖核苷酸。
如本文所用的，术语“末端官能团”包括但不限于卤素、醇、胺、羧基（carboxylic）、酯、酰胺、醛、酮、醚基团。
某些部分可以与第一链或第二链的5'末端连接，并且包括无碱基核糖部分，无碱基脱氧核糖部分，修饰无碱基核糖和无碱基脱氧核糖部分，包括2·O烷基修饰；反向无碱基核糖和无碱基脱氧核糖部分及其修饰，C6-亚氨基-Pi；包括L-DNA和L-RNA的镜像核苷酸；5·OMe核苷酸；和核苷酸类似物，包括4·,5·-亚甲基核苷酸；1-(·-D-赤式呋喃糖基)核苷酸；4·-硫代核苷酸，碳环核苷酸；5·-氨基烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯，3-氨丙基磷酸酯；6-氨己基磷酸酯；12-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1,5-脱水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏-戊呋喃糖基(threo-pentofuranosyl)核苷酸；无环3·,4·- 裂环（seco）核苷酸；3,4-二羟丁基核苷酸；3,5-二羟戊基核苷酸，5·-5·-反向无碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；5·-氨基；和桥连或非桥连甲基膦酸酯和5·-巯基部分。
本发明的核酸可以包括一种或多种反向核苷酸，例如反向胸苷或反向腺嘌呤（例如参见Takei等人，2002. JBC 277（26）：23800-06）。
如本文所用的，关于基因表达的术语“抑制”、“下调”或“降低”是指基因的表达，或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子（例如，mRNA）的水平，或一种或多种蛋白质、蛋白质亚基或肽的活性，降低至低于在没有本发明核酸的情况下或关于与人转录物没有已知同源性的siRNA分子（本文称为非沉默对照）观察到的那些。这种对照可以以与本发明的分子类似的方式缀合和修饰，并通过相同的途径递送到靶细胞中；例如，表达可以降低至在没有本发明的核酸或缀合的核酸的情况下，或在有非沉默对照的情况下的90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%或中间值。
本发明的核酸可包含无碱基核苷酸。如本文所用的术语“无碱基”是指缺乏碱基或具有其他化学基团代替1'位碱基的部分，例如3',3'-连接的或5',5'-连接的脱氧无碱基核糖衍生物。
核酸可以包含修饰的第二和/或第一链上的一个或多个核苷酸。可以修饰交替核苷酸，以形成修饰的核苷酸。
如本文所述的交替意味着以有规律的方式一个接一个地发生。换句话说，交替意味着反复依次发生。例如，如果修饰一个核苷酸，则不修饰下一个邻接核苷酸，并修饰后面的邻接核苷酸，以此类推。可以用第一修饰修饰一个核苷酸，可以用第二修饰修饰下一个邻接核苷酸，并且用第一修饰修饰后面的邻接核苷酸，以此类推，其中第一和第二修饰是不同的。
可以修饰本发明核酸的第一链的一个或多个奇数核苷酸，其中第一链编号为5'至3'。如本文所述的术语“奇数”是指不能被2除尽的数字。奇数的示例是1、3、5、7、9、11等。可以修饰本发明核酸的第一链的一个或多个偶数核苷酸，其中第一链编号为5'至3'。如本文所述的术语“偶数”是指可均匀地被2除尽的数字。偶数的例子是2、4、6、8、10、12、14等。可以修饰本发明核酸的第二链的一个或多个奇数核苷酸，其中第二链编号为3'至5'。可以修饰本发明核酸的第二链的一个或多个偶数核苷酸，其中第二链编号为3'至5'。
可以修饰第一和/或第二链上的一个或多个核苷酸，以形成修饰的核苷酸。可以修饰第一链的一个或多个奇数核苷酸。第一链的偶数核苷酸中的一个或多个可以通过至少第二修饰进行修饰，其中所述至少第二修饰不同于一个或多个附加核苷酸上的修饰。一个或多个修饰的偶数核苷酸中的至少一个可以与一个或多个修饰的奇数核苷酸中的至少一个相邻。
可以在本发明的核酸中修饰第一链中的多个奇数核苷酸。第一链中的多个偶数核苷酸可以通过第二修饰进行修饰。第一链可包含通过共同修饰修饰的相邻核苷酸。第一链还可以包含通过第二不同修饰修饰的相邻核苷酸。
第二链的一个或多个奇数核苷酸可以通过与第一链上的奇数核苷酸的修饰不同的修饰进行修饰和/或第二链的一个或多个偶数核苷酸可以通过第一链的奇数核苷酸的相同修饰进行修饰。第二链的一个或多个修饰的偶数核苷酸中的至少一个可以与一个或多个修饰的奇数核苷酸相邻。第二链的多个奇数核苷酸可以通过共同修饰进行修饰和/或多个偶数核苷酸可以通过存在于第一链奇数核苷酸上的相同修饰进行修饰。第二链上的多个奇数核苷酸可以通过第二修饰修饰，其中所述第二修饰不同于第一链奇数核苷酸的修饰。
第二链可以包含通过共同修饰修饰的相邻核苷酸，其可以是不同于第一链的奇数核苷酸的修饰的第二修饰。
在本发明的核酸中，第一链中的每个奇数核苷酸和第二链中的每个偶数核苷酸可以用共同的修饰进行修饰，并且每个偶数核苷酸可以在第一链中用第二修饰进行修饰，且每个奇数核苷酸可以在第二链中用第二修饰进行修饰。
相对于第二链的未修饰或不同修饰的核苷酸，本发明的核酸可以使第一链的修饰的核苷酸移动至少一个核苷酸。
可以在第一链中修饰一个或多个或每个奇数核苷酸，并且可以在第二链中修饰一个或多个或每个偶数核苷酸。可以通过第二修饰修饰任一条链或两条链上的一个或多个或每个交替核苷酸。可以在第一链中修饰一个或多个或每个偶数核苷酸，并且可以在第二链中修饰一个或多个或每个偶数核苷酸。可以通过第二修饰修饰任一条链或两条链上的一个或多个或每个交替核苷酸。可以在第一链中修饰一个或多个或每个奇数核苷酸，并且可以通过共同修饰在第二链中修饰一个或多个奇数核苷酸。可以通过第二修饰修饰任一条链或两条链上的一个或多个或每个交替核苷酸。可以在第一链中修饰一个或多个或每个偶数核苷酸，并且可以通过共同修饰在第二链中修饰一个或多个或每个奇数核苷酸。可以通过第二修饰修饰任一条链或两条链上的一个或多个或每个交替核苷酸。
本发明的核酸可包含单链或双链构建体，其在一条或两条链中包含至少两个交替修饰的区域。这些交替区域可包含最多到约12个核苷酸，但优选包含约3至约10个核苷酸。交替核苷酸的区域可位于本发明核酸的一条链或两条链的末端。核酸可以在每个末端（3'和5'）包含4至约10个核苷酸的交替核苷酸，并且这些区域可以由约5至约12个邻接的未修饰或不同或共同修饰的核苷酸分开。
可以修饰第一链的奇数核苷酸，并且可以用第二修饰修饰偶数核苷酸。第二链可以包含用共同修饰修饰的相邻核苷酸，其可以与第一链的奇数核苷酸的修饰相同。第二链的一个或多个核苷酸也可以用第二修饰进行修饰。具有第二修饰的一个或多个核苷酸可以彼此相邻并且与具有与第一链的奇数核苷酸的修饰相同的修饰的核苷酸相邻。第一链还可以在3'端和5'端的两个核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。第二链可以在5'端的两个核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。第二链也可以在5'端与配体缀合。
本发明的核酸可以包含第一链，所述第一链包含用共同修饰修饰的相邻核苷酸。一个或多个这种核苷酸可以与一个或多个可以用第二修饰修饰的核苷酸相邻。具有第二修饰的一个或多个核苷酸可以是相邻的。第二链可以包含用共同修饰修饰的相邻核苷酸，其可以与第一链的一个或多个核苷酸的修饰之一相同。第二链的一个或多个核苷酸也可以用第二修饰进行修饰。具有第二修饰的一个或多个核苷酸可以是相邻的。第一链还可以在5'端和3'端的两个核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。第二链可以在3'端的两个核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。第二链也可以在5'端与配体缀合。
核苷酸在第一链上编号为5'至3'，且在第二链上编号为3'至5'，在第一链上可以通过修饰来修饰1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25。在第一链上可以通过第二修饰来修饰编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸。在第二链上可以通过修饰来修饰编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸。在第二链上可以通过第二修饰来修饰编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸。为了本发明的核酸起见在第一链上从5'至3'且在第二链上从3'至5'编号核苷酸。
在第一链上可以通过修饰来修饰编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸。在第一链上可以通过第二修饰来修饰编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸。在第二链上可以通过修饰来修饰编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸。在第二链上可以通过第二修饰来修饰编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸。
显然，如果第一和/或第二链的长度短于25个核苷酸，例如长度为19个核苷酸，则没有待修饰的编号为20、21、22、23、24和25的核苷酸。因此，技术人员理解以上描述以适用于较短的链。
第一链上的一个或多个修饰的核苷酸可以与具有共同修饰的第二链上的修饰的核苷酸配对。第一链上的一个或多个修饰的核苷酸可以与具有不同修饰的第二链上的修饰的核苷酸配对。第一链上的一个或多个修饰的核苷酸可以与第二链上的未修饰的核苷酸配对。第二链上的一个或多个修饰的核苷酸可以与第一链上的未修饰的核苷酸配对。换句话说，交替核苷酸可以在两条链上排列，如例如，第二链的交替区域中的所有修饰都与第一链中的相同修饰配对，或者另一方面，修饰可以被具有与另一条链中的不同修饰（即，第二或进一步修饰）配对的一条链的交替区域中的共同修饰的一个核苷酸抵消。另一种选择是在每条链中具有不同的修饰。
第一链上的修饰可相对于第二链上的修饰的核苷酸移动一个核苷酸，从而使得共同修饰的核苷酸不彼此配对。
修饰和/或多种修饰可以各自和单独地选自3'-末端脱氧胸腺嘧啶、2'-O-甲基、2'-脱氧-修饰、2'-氨基-修饰、2'-烷基-修饰、吗啉代修饰、氨基磷酸酯修饰、5'-硫代磷酸酯基团修饰、5'磷酸或5'磷酸模拟物修饰和胆甾烯基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团修饰和/或修饰的核苷酸可以是锁定核苷酸、无碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任何一种。
至少一种修饰可以是2'-O-甲基和/或至少一种修饰可以是2'-F。如本文所述的进一步修饰可以存在于第一和/或第二链上。
在本发明的整个说明书中，“相同或共同的修饰”是指对任何核苷酸的相同修饰，即用诸如甲基或氟基的基团修饰的A、G、C或U。其不意味着在同一核苷酸上的相同添加。例如，2'F-dU、2'F-dA、2'F-dC、2'F-dG都被认为是相同或共同的修饰，2'-OMe-rU、2'-OMe-rA、2'-OMe-rC、2'-OMe-rG也是如此。2'F修饰是与2'OMe修饰不同的修饰。
在实施例中显示了本发明的一些代表性修饰的核酸序列。这些实施例意思是代表性的而非限制性的。
优选地，核酸可以包含修饰和第二或进一步修饰，其各自和单独地选自2'-O-甲基修饰和2'-F修饰。核酸可以包含作为2'-O-甲基（2'OMe）的修饰，其可以是第一修饰，和作为2'-F的第二修饰。本发明的核酸还可以包含硫代磷酸酯修饰和/或脱氧修饰，其可以存在于每条链或两条链的每一或任一端的末端1、2或3个核苷酸之中或之间。
作为进一步的方面，本发明提供了用于抑制TMPRSS6表达的核酸，其包含SEQ ID317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440或442，
或
例如
其中第一链的核苷酸在奇数核苷酸上通过第一修饰进行修饰，并在偶数核苷酸上通过第二修饰进行修饰，并且第二链的核苷酸在偶数核苷酸上通过第三修饰进行修饰，并在奇数核苷酸上通过第四修饰进行修饰，其中至少所述第一修饰与所述第二修饰不同，且所述第三修饰与所述第四修饰不同。第三和第一修饰可以相同或不同，第二和第四修饰可以相同或不同。第一和第二修饰可以彼此不同，并且第三和第四修饰可以彼此不同。
在另一方面，提供了用于抑制TMPRSS6表达的核酸，其中第二链包含SEQ ID NO318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、357、359. 361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441或443的核苷酸序列，或SEQ ID no 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、68、70、72、75、84、86、89、100、101、102、103、104、105、106、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、226、228、230、232、234、236、238、240、242、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、310、312、314或316的核苷酸序列，例如SEQID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214或216的核苷酸序列
其中第一链的核苷酸在奇数核苷酸上通过第一修饰进行修饰，并在偶数核苷酸上通过第二修饰进行修饰，并且第二链的核苷酸在偶数核苷酸上通过第三修饰进行修饰，并在奇数核苷酸上通过第四修饰进行修饰，其中至少所述第一修饰与所述第二修饰不同，且所述第三修饰与所述第四修饰不同。第三和第一修饰可以相同或不同，第二和第四修饰可以相同或不同。第一和第二修饰可以彼此不同，并且第三和第四修饰可以彼此不同。合适地，第二链的核苷酸序列与第一链互补。第一链的核苷酸可以在奇数核苷酸上通过第一修饰进行修饰，且在偶数核苷酸上用第二修饰进行修饰，并且第二链可以在奇数核苷酸上用第二修饰进行修饰，且在偶数核苷酸上用第一修饰进行修饰。第一修饰可以是2'OMe，且第二修饰可以是2'F。第一链可以包含SEQ ID NO：17的核苷酸序列和/或第二链可以包含SEQ ID NO：18的核苷酸序列。修饰可以是表1中陈述的那些。
本发明的核酸可以与配体缀合。
一些配体可具有内体裂解（endosomolytic）性质。内体裂解配体促进内体的裂解和/或本发明组合物或其组分从细胞的内体到细胞质的转运。内体裂解配体可以是聚阴离子肽或肽模拟物（peptidomimetic），其显示pH-依赖性膜活性和促融性（fusogenicity）。内体裂解组分可含有化学基团，该化学基团响应于pH的变化而经历电荷或质子化的变化。内体裂解组分可以是线性或支链的。
配体可包括治疗调节物，例如用于增强摄取；诊断化合物或报道基团，例如用于监控分布；交联剂；和核酸酶抗性赋予部分。一般实例包括脂质、类固醇、维生素、糖、蛋白质、肽、多胺和肽模拟物。配体可包括天然存在的物质，例如蛋白质、碳水化合物或脂质。配体可以是重组或合成分子。
配体还可以包括靶向基团，例如细胞或组织靶向剂。靶向配体可以是凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质。
配体的其他实例包括染料、嵌入剂、交联剂、卟啉、多环芳烃、人工内切核酸酶或螯合剂、亲脂性分子、烷化剂、磷酸、氨基、巯基、PEG、MPEG、烷基、取代的烷基、放射性标记的标记、酶、半抗原、转运/吸收促进剂、合成核糖核酸酶或咪唑簇。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白或肽。配体也可以是激素或激素受体。它们还可以包括非肽种类，例如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素或辅因子。
配体可以是诸如药物的物质，其可以增加核酸到细胞内的摄取，例如，通过破坏细胞的细胞骨架。
配体可以通过激活炎症反应来增加核酸到细胞内的摄取。这种配体包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-1β或γ干扰素。
配体可以是脂质或基于脂质的分子。脂质或基于脂质的分子优选结合血清蛋白质。优选地，基于脂质的配体结合人血清清蛋白（HSA）。脂质或基于脂质的分子可以增加对缀合物降解的抗性，增加靶向或转运到靶细胞中，和/或可以调节与血清蛋白质的结合。基于脂质的配体可用于调节缀合物与靶组织的结合。
配体可以是类固醇。优选地，配体是胆固醇或胆固醇衍生物。
配体可以是例如维生素的部分，其被靶细胞吸收。示例性维生素包括维生素A、E、K和B族维生素。维生素可被增殖细胞吸收，其可用于将核酸递送至细胞，例如恶性或非恶性肿瘤细胞。
配体可以是细胞渗透剂（cell-permeation agent），例如螺旋细胞渗透剂。优选地，这种试剂是两亲性的。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物是能够折叠成类似于天然肽的确定的三维结构的分子。肽或模拟物配体可包括天然存在的或修饰的肽，或两者。肽或肽模拟物可以是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水性肽。肽部分可以是树状聚体肽、受约束的肽（constrained peptide）或交联的肽。肽部分可包括疏水膜易位序列。肽部分可以是能够携带大的极性分子的肽，例如穿过细胞膜的肽、寡核苷酸和蛋白质，例如来自HIV Tat蛋白（GRKKRRQRRRPPQ）和果蝇触角足蛋白（RQIKIWFQNRRMKWKK）的序列。优选地，肽或肽模拟物是细胞靶向肽，例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）-肽。
配体可以是能够渗透例如微生物细胞或哺乳动物细胞的细胞渗透肽。
配体可以是药物代谢动力学调节剂。药物代谢动力学调节剂可以是亲脂体、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。
当存在两个或更多个配体时，配体可以全部具有相同的性质，全部具有不同的性质，或者一些配体具有相同的性质，而其他配体具有不同的性质。例如，配体可具有靶向性质、具有内体裂解活性或具有PK调节性质。在优选的实施方案中，所有配体都具有不同的性质。
配体可以在3'-端、5'-端和/或内部位置与核酸偶联。优选地，配体通过间插系链（tether）或接头与核酸偶联。
在一些实施方案中，核酸是双链核酸。在双链核酸中，配体可以附着到一条或两条链。在一些实施方案中，双链核酸含有与有义链缀合的配体。在其他实施方案中，双链核酸含有与反义链缀合的配体。
配体可以与核酸分子的核碱基、糖部分或核苷间键缀合。与嘌呤核碱基或其衍生物的缀合可发生在包括内环和外环原子的任何位置。与嘧啶核苷酸或其衍生物的缀合也可以在任何位置发生。与核苷的糖部分的缀合可以发生在任何碳原子上。与核苷间键的缀合可以发生在含磷键的磷原子上或与磷原子键合的氧、氮或硫原子上。对于含胺或酰胺的核苷间键，缀合可以发生在胺或酰胺的氮原子上或邻近的碳原子上。
配体一般是碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖或多糖。配体可以通过接头与核酸缀合。接头可以是单价、二价或三价分支接头。
体内将寡核苷酸，特别是本发明的双链核酸有效递送至细胞是重要的，并且需要特异性靶向和免受细胞外环境特别是血清蛋白质的相当大保护。实现特异性靶向的一种方法是将配体与核酸缀合。配体帮助将核酸靶向所需的靶位点。对于所期望的受体分子需要缀合适当的配体，以便缀合的分子被靶细胞通过诸如不同受体介导的胞吞作用途径或功能类似过程的机制吸收。靶向部分或配体可以是能够靶向具体受体的任何部分或配体。
例如，脱唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）是高容量受体，其在肝细胞上高度丰富。三分支簇糖苷的首次公开之一是在美国专利号US 5,885,968中。具有三个GalNAc配体并包含磷酸基团的缀合物是已知的并且在Dubber等人（2003, Bioconjug. Chem. 2003年1月至2月；14（1）：239-46）中描述。ASGP-R对N-乙酰-D-半乳糖基胺（GalNAc）的亲和力为对D-Gal的50-倍。
表达凝集素（脱唾液酸糖蛋白受体；ASGPR）的肝细胞可用于通过半乳糖或半乳糖胺（galactoseamine）与药物物质的共价偶联将药物靶向肝（Ishibashi, S.等人，J Biol.Chem. 1994年11月11日；269(45):27803-6）），所述凝集素特异性识别糖基化蛋白质或其他寡糖的末端·-半乳糖基亚基（Weigel, P.H.等人，Biochim. Biophys. Acta. 2002年9月19日；1572（2-3）：341-63）。此外，通过重复靶向单元实现的多价效应可以显着提高结合亲和力（E. A. L. Biessen等人，1995）。
ASGPR是含有末端·-半乳糖基的糖蛋白的主动内体转运的介质，因此ASGPR高度适合于药物候选物如核酸的靶向递送，其必须被递送到细胞中（Akinc等人）。
配体可以通过接头与本发明的核酸附着，所述接头可以是二价或三价或四聚体分支接头。
可以选择糖（其也可以称为配体）以对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲和力。特别地，受体位于哺乳动物肝细胞的表面上，例如肝脱唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）。
糖可以选自N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺（glucosamone）和岩藻糖。糖可以是N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）。
因此，用于本发明的配体可以包含（i）一个或多个N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）部分及其衍生物，和（ii）接头，其中所述接头将所述GalNAc部分与如在任何前面的方面中定义的序列缀合。接头可以是二价或三价或四价分支结构。可以如本文所定义的修饰核苷酸。
“GalNAc”指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，在文献中通常称为N-乙酰半乳糖胺。提及“GalNAc”或“N-乙酰半乳糖胺”包括·-形：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-·-D-吡喃半乳糖和·-形：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-·-D-吡喃半乳糖两者。·-形：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-·-D-吡喃半乳糖和·-形：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-·-D-吡喃半乳糖两者可互换使用。优选地，本发明的化合物包含·-形，2-(乙酰氨基)-2-脱氧-·-D-吡喃半乳糖。
配体可包含GalNAc。
配体可包含式I的化合物：
[S-X1-P-X2]3-A-X3- （I）
其中：
S代表糖，其中所述糖是N-乙酰半乳糖胺；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m为1、2或3；
P是磷酸或改性磷酸（优选硫代磷酸）；
X2为亚烷基或式(-CH2)n-O-CH2-的亚烷基醚，其中n = 1-6；
A是分支单元；
X3代表桥连单元；
其中根据本发明的核酸通过磷酸或改性磷酸（优选硫代磷酸）与X3缀合。
在式I中，分支单元“A”分支为三个以容纳三个糖部分。分支单元与配体和核酸的剩余束缚部分共价附着。分支单元可包含支链脂族基团，包含选自烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟氨基的基团。分支单元可包含选自烷基和醚基的基团。
分支单元A可具有选自以下的结构：
和
其中每个A1独立地代表O、S、C=O或NH；和
每个n独立地代表1至20的整数。
分支单元可具有选自以下的结构：
和
其中每个A1独立地代表O、S、C=O或NH；和
每个n独立地代表1至20的整数。
分支单元可以具有选自以下的结构：
和
其中A1是O、S、C=O或NH；和
每个n独立地代表1至20的整数。
分支单元可具有以下结构：
。
分支单元可具有以下结构：
。
分支单元可具有以下结构：
。
任选地，分支单元仅由碳原子组成。
式I化合物的“X3”部分是桥连单元。桥连单元是线性的并且与分支单元和核酸共价结合。
X3可以选自-C1-C20亚烷基-、-C2-C20亚链烯基（alkenylene）-、式-(C1-C20亚烷基)–O–(C1-C20亚烷基)-的亚烷基醚、-C(O)-C1-C20亚烷基-、-C0-C4亚烷基(Cy)C0-C4亚烷基-，其中Cy代表取代或未取代的5或6元亚环烷基（cycloalkylene）、亚芳基、亚杂环基（heterocyclylene）或亚杂芳基（heteroarylene）环、-C1-C4亚烷基-NHC(O)-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-C(O)NH-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-SC(O)-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-C(O)S-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-OC(O)-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-C(O)O-C1-C4亚烷基-和-C1-C6亚烷基-S-S-C1-C6亚烷基-。
X3可以是式-(C1-C20亚烷基)–O–(C1-C20亚烷基)-的亚烷基醚。X3可以是式-(C1-C20亚烷基)–O–(C4-C20亚烷基)-的亚烷基醚，其中所述(C4-C20亚烷基)与Z连接。X3可以选自-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-和-CH2-O-C8H16-，尤其-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-和-CH2-O-C8H16-，其中在每种情况下-CH2-基团与A连接。
配体可包含式（II）的化合物：
[S-X1-P-X2]3-A-X3- （II）
其中：
S代表糖；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m为1、2或3；
P是磷酸或改性磷酸（优选硫代磷酸）；
X2为C1-C8亚烷基；
A是选自以下的分支单元：
X3是桥连单元；
其中根据本发明的核酸通过磷酸或改性磷酸（优选硫代磷酸）与X3缀合。
分支单元A可以具有以下结构：
。
分支单元A可以具有以下结构：
，
其中X3附着到氮原子。
X3可以是C1-C20亚烷基。优选地，X3选自-C3H6-、-C4H8-、-C6H12-和-C8H16-，尤其-C4H8-、-C6H12-和-C8H16-。
配体可包含式（III）的化合物：
[S-X1-P-X2]3-A-X3- （III）
其中：
S代表糖；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m为1、2或3；
P是磷酸或改性磷酸（优选硫代磷酸）；
X2为式-C3H6-O-CH2-的亚烷基醚；
A是分支单元；
X3是选自以下的亚烷基醚：-CH2-O-CH2-、-CH2-O-C2H4-、-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-和-CH2-O-C8H16-，其中在每种情况下-CH2-基团与A连接，
Z是核酸；
且其中X3和Z之间的键是磷酸或硫代磷酸
分支单元可包含碳。优选地，分支单元是碳。
X3可以选自 -CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-和-CH2-O-C8H16-。优选地，X3选自-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-和-CH2-O-C8H16。
对于任何上述方面，当P代表改性磷酸基团时，P可以由以下代表：
其中Y1和Y2各自独立地代表=O、=S、-O-、-OH、-SH、-BH3、-OCH2CO2、-OCH2CO2Rx、-OCH2C(S)ORx和–ORx，其中Rx代表C1-C6烷基，并且其中表示与化合物的剩余部分附着。
改性磷酸的意思是指其中一个或多个氧被置换的磷酸基团。改性磷酸基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯具有被硫置换的两个非连接氧。磷酸基团中的一个、每个或两个非连接氧可以独立地是S、Se、B、C、H、N或OR中的任何一个（R是烷基或芳基）。
也可以通过用氮（桥连氨基磷酸酯）、硫（桥连硫代磷酸酯）和碳（桥连亚甲基膦酸酯）置换连接氧来修饰磷酸接头。置换可以在末端氧处进行。用氮置换非连接氧是可能的。
例如，Y1可以代表-OH且Y2可以代表=O或=S；或
Y1可以代表-O-且Y2可以代表=O或=S；
Y1可以代表=O且Y2可以代表–CH3、-SH、-ORx或–BH3
Y1可以代表=S且Y2可以代表–CH3、ORx或–SH。
本领域技术人员将理解，在某些情况下，Y1和Y2之间将存在离域作用。
优选地，改性磷酸基团是硫代磷酸基团。硫代磷酸基团包括二硫代磷酸（即，其中Y1代表=S且Y2代表–S-）和一硫代磷酸（即，其中Y1代表-O-且Y2代表=S，或其中Y1代表=O且Y2代表–S-）。优选地，P是一硫代磷酸。发明人已经发现具有置换磷酸基团的硫代磷酸基团的缀合物在体内具有改善的效力和作用持续时间。
P也可以是乙基磷酸酯（ethylphosphate）（即，其中Y1代表=O且Y2代表OCH2CH3）。
可以选择糖以对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲和力。特别地，受体位于哺乳动物肝细胞的表面上，例如肝脱唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）。
对于任何上述方面，糖可以选自具有半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和果糖中的一种或多种的N-乙酰。优选地，糖是两分子的N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）。本发明化合物可具有3个配体，其各自优选为N-乙酰半乳糖胺。
“GalNAc”指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，在文献中通常称为N-乙酰半乳糖胺。提及“GalNAc”或“N-乙酰半乳糖胺”包括·-形：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-·-D-吡喃半乳糖和·-形：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-·-D-吡喃半乳糖两者。在某些实施方案中，·-形：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-·-D-吡喃半乳糖和·-形：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-·-D-吡喃半乳糖两者可互换使用。优选地，本发明的化合物包含·-形，2-(乙酰氨基)-2-脱氧-·-D-吡喃半乳糖。
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-·-D-吡喃半乳糖
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-·-D-吡喃半乳糖
对于任何上述式（III）的化合物，X1可以是(-CH2-CH2-O)(-CH2)2-。X1可以是(-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-。X1可以是(-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-。优选地，X1是(-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-。另一方面，X1代表C3-C6亚烷基。X1可以是亚丙基。X1可以是亚丁基。X1可以是亚戊基（pentylene）。X1可以是亚己基（hexylene）。优选地，烷基是直链亚烷基。特别地，X1可以是亚丁基。
对于式（III）的化合物，X2代表式 -C3H6-O-CH2-的亚烷基醚，即 C3烷氧基亚甲基，或–CH2CH2CH2OCH2-。
本发明提供了具有以下结构之一的缀合的核酸
其中Z是如前文所定义的核酸。
作为另一方面，本发明提供了用于抑制细胞中TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第一链包含选自以下序列：
或选自
例如选自
其中所述核酸通过接头间接或直接缀合至配体。第二链可包含
或选自
例如选自
核酸可以与如本文所述的配体缀合。
如本文所述的，可修饰第一和/或第二链的核苷酸。
优选地，核酸包含与式I的配体（如上文所陈述的）缀合的SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18，并且其中第一链在奇数核苷酸上用2'OMe修饰进行修饰，且在偶数核苷酸上用2'F进行修饰，并且第二链在偶数核苷酸上用2'OMe进行修饰，且在奇数核苷酸上用2'F进行修饰。
更优选地，核酸包含SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，其中核酸与式I的配体（如上文所陈述的）缀合，并且此外其中核酸具有如下所示的修饰模式，其是如本文所提供的表1的摘录。
其中具体修饰由数字描述
配体可包含GalNAc，且图8a或图8b进一步举例说明本发明。
其他优选的核酸在上文列举。
可切割的连接基团是在细胞外稳定但在进入靶细胞时被切割的接头。切割释放接头保持在一起的两个部分。
在优选的实施方案中，本发明的核酸包含可切割的连接基团，其在靶细胞中或在第一参考条件下（其例如可以被选择以模拟或代表细胞内条件）的切割速度为在主体的血液中或在第二参考条件下（其例如可以被选择以模拟或代表血液或血清中发现的条件）的至少10倍或更多，优选至少100-倍。
可切割的连接基团易受切割剂的影响，例如，pH、氧化还原电位或降解分子的存在。降解分子包括氧化或还原酶、还原剂（如硫醇）、酯酶、内体或可以产生酸性环境的试剂、可以通过充当普通酸水解或降解酸可切割的连接基团的酶、肽酶和磷酸酶。
可切割的连接基团可以是二硫键，其易受pH影响。
接头可包括可被特定酶切割的可切割的连接基团。掺入接头中的可切割的连接基团的类型可取决于靶细胞。例如，当肝细胞是靶时，优选包含酯基团的接头。当靶向富含肽酶的细胞（例如肝细胞和滑膜细胞（synoviocytes））时，可以使用含有肽键的接头。
通常，可以通过测试降解剂（或条件）切割候选连接基团的能力来评价候选可切割的连接基团的适合性。还将期望也测试候选可切割的连接基团在血液中或当与其他非靶组织接触时的抗切割能力。在优选的实施方案中，与血液或血清（或在选择用于模拟细胞外条件的体外条件下）相比，有用的候选化合物在细胞中（或在选择用于模拟细胞内条件的体外条件下）的切割速度为至少2倍、4倍、10倍或100倍。
在一个方面，可切割的连接基团可以是氧化还原可切割的连接基团。氧化还原可切割的连接基团可以是二硫化物连接基团。
在一个方面，连接基团可以是基于磷酸的可切割的连接基团。优选的实施方案是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-·(O)(·)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。优选的实施方案是-O-P(O)(OH)-O-。
在一个方面，可切割的连接基团可以是酸可切割的连接基团。优选地，酸可切割的连接基团在pH为6.5或更低的环境中切割，或者被诸如可以充当普通酸的酶的试剂切割。酸可切割的连接基团的实例包括但不限于腙、酯和氨基酸酯。酸可切割的基团可具有通式-C=NN-；C(O)O，或-OC(O)。优选的实施方案是这样的连接基团，其中与酯的氧（烷氧基）附着的碳是芳基、取代的烷基或叔烷基，如二甲基戊基或叔丁基。
在一个实施方案中，可切割的连接基团可以是基于酯的可切割的连接基团。基于酯的可切割的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚链烯基和亚炔基（alkynylene）的酯。
在一个实施方案中，可切割的连接基团可以是基于肽的可切割的连接基团。基于肽的可切割的连接基团是在氨基酸之间形成的肽键，以产生寡肽（例如，二肽、三肽等）和多肽。基于肽的切割基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键（即，酰胺键），并且不包括完整的酰胺官能团。基于肽的可切割的连接基团具有通式–NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基团。
如本文所述的核酸可以与脂质体形式的脂质一起配制。这种制剂可以在本领域中描述为阳离子脂质体/DNA复合物（lipoplex）。具有脂质/脂质体的制剂可用于帮助将本发明的核酸递送至靶细胞。本文所述的脂质递送系统可用作缀合配体的替换物。当将本发明的核酸与脂质递送系统或与配体缀合物递送系统一起使用时，可以存在本文所述的修饰。
这种阳离子脂质体/DNA复合物可包含脂质制剂，其包含：
i）阳离子脂质或其药学上可接受的盐；
ii）类固醇；
iii）磷脂酰乙醇胺磷脂；
iv）加入聚乙二醇的脂质。
阳离子脂质可以是氨基阳离子脂质。
阳离子脂质可具有式（I）：
或其药学上可接受的盐，其中：
X代表O、S或NH；
R1和R2各自独立地代表具有一个或多个双键的C4-C22直链或支链烷基链或C4-C22直链或支链链烯基链，其中烷基或链烯基链任选地含有间插酯、酰胺或二硫化物；
当X代表S或NH时，R3和R4各自独立地代表氢、甲基、乙基、单-或多胺部分，或R3和R4一起形成杂环基环；
当X代表O时，R3和R4各自独立地代表氢、甲基、乙基、单-或多胺部分，或R3和R4一起形成杂环基环，或R3代表氢，且R4代表C(NH)(NH2)。
阳离子脂质可以具有式（IA）：
或其药学上可接受的盐。
阳离子脂质可以具有式（IB）：
或其药学上可接受的盐。
阳离子脂质组分的含量可以是制剂总脂质含量的约55摩尔％至约65摩尔％。特别地，阳离子脂质组分为制剂总脂质含量的约59摩尔％。
制剂进一步包含类固醇。类固醇可以是胆固醇。类固醇的含量可以是脂质制剂的总脂质含量的约26摩尔％至约35摩尔％。更特别地，类固醇的含量可以是脂质制剂的总脂质含量的约30摩尔％。
磷脂酰乙醇胺磷脂可以选自1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DPhyPE）、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DLPE）、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DMPE）、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺（DPPE）、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DLoPE）、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（POPE）、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DEPE）、1,2-二角鲨烯酰基（Disqualeoyl）-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSQPE）和1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（SLPE）。磷脂的含量可以是制剂总脂质含量的约10摩尔％。
加入聚乙二醇的脂质可选自1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇（DMG-PEG）和C16-神经酰胺-PEG。加入聚乙二醇的脂质的含量可以是制剂总脂质含量的约1至5摩尔％。
组合物中阳离子脂质组分的含量可以是脂质制剂的总脂质含量的约55摩尔％至约65摩尔％，优选脂质制剂的总脂质含量的约59摩尔％。
制剂可以具有选自55:34:10:1、56:33:10:1、57:32:10:1、58:31:10:1、59:30:10:1、60:29:10:1、61:28:10:1、62:27:10:1、63:26:10:1、64:25:10:1和65:24:10:1的i）：ii）：iii）：iv）的组分摩尔比。
该组合物可包含具有以下结构的阳离子脂质
具有以下结构的类固醇
具有以下结构的磷脂酰乙醇胺磷脂；
和具有以下结构的加入聚乙二醇的脂质；
中性脂质体组合物可以由例如二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱（DMPC）或二棕榈酰基磷脂酰胆碱（DPPC）形成。阴离子脂质体组合物可以由二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油形成，而阴离子促融脂质体可以主要由二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）形成。另一种类型的脂质体组合物可以由磷脂酰胆碱（PC）形成，如例如大豆PC和蛋PC。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
带阳电荷的合成阳离子脂质N-[l-(2,3-二油氧基）丙基]-·,·,·-三甲基氯化铵（DOTMA）可用于形成小脂质体，其与核酸自发相互作用，以形成脂质-核酸复合物，其能够与组织培养细胞的细胞膜的带阴电荷的脂质融合。DOTMA类似物也可用于形成脂质体。
本文描述的脂质的衍生物和类似物也可用于形成脂质体。
含有核酸的脂质体可通过多种方法制备。在一个实例中，脂质体的脂质组分溶解在去污剂中，从而使得由脂质组分形成微团。例如，脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。去污剂可具有高临界微团浓度并且可以是非离子型的。示例性去污剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰基肌氨酸。然后将核酸制剂添加到包含脂质组分的微团中。脂质上的阳离子基团与核酸相互作用并在核酸周围缩合以形成脂质体。缩合后，例如通过透析除去去污剂，以得到核酸的脂质体制剂。
如果必要，可以在缩合反应过程中添加帮助缩合的载体化合物，例如通过受控添加。例如，载体化合物可以是除核酸以外的聚合物（例如，精胺或亚精胺）。还可以调节pH以有利于缩合。
核酸制剂可包含表面活性剂。在一个实施方案中，将核酸配制为包含表面活性剂的乳剂。
未离子化的表面活性剂是非离子型表面活性剂。实例包括非离子型酯，例如乙二醇酯，丙二醇酯，甘油酯等，非离子型链烷醇酰胺，和醚，例如脂肪醇乙氧基化物，丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物。
当溶解或分散在水中时带有阴电荷的表面活性剂是阴离子表面活性剂。实例包括羧酸酯，如皂，酰基乳酰乳酸酯（acyl lactylates），氨基酸的酰胺，硫酸酯如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯，磺酸酯如烷基苯磺酸酯，酰基羟乙基磺酸酯，酰基牛磺酸酯和磺基琥珀酸酯，和磷酸酯。
当溶解或分散在水中时带有阳电荷的表面活性剂是阳离子表面活性剂。实例包括季铵盐和乙氧基化胺。
具有带阳电荷或阴电荷能力的表面活性剂是兼性表面活性剂。实例包括丙烯酸衍生物，取代的烷基酰胺，N-烷基甜菜碱和磷脂。
“微团”在本文中定义为特定类型的分子组合，其中两亲性分子以球形结构排列，从而使得分子的所有疏水部分朝向内部，从而使亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水的，则存在相反的排列。可以通过混合核酸的水溶液，碱金属烷基硫酸盐和至少一种微团形成化合物来形成微团。
示例性的微团形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸（glycolic acid）、乳酸、春黄菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、甘油一油酸酯、一油酸、单月桂酸酯（monolaurates）、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆烷基甘氨酸（trihydroxy oxo cholanyl glycine）及其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油精、聚氧乙烯醚及其类似物、PEG-9月桂醇烷基醚（polidocanolalkyl ethers）及其类似物、鹅脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐及其混合物。
可以将酚和/或间甲酚添加到混合的微团组合物中以充当稳定剂和防腐剂。可以添加等渗剂如甘油。
核酸制剂可以掺入颗粒如微粒中。微粒可以通过喷雾干燥、冷冻干燥、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些方法的组合来生产。
本发明还提供了包含本发明的核酸或缀合的核酸的药物组合物。药物组合物可单独或与其他试剂组合用作药物或诊断剂。例如，本发明的核酸或缀合的核酸可以与递送载体（例如脂质体）和赋形剂，例如载体，稀释剂组合。还可以添加其他试剂，例如防腐剂和稳定剂。用于递送核酸的方法是本领域已知的并且在本领域技术人员的知识范围内。
本发明的核酸或缀合的核酸也可以与其他治疗用化合物组合施用，或者分开施用或者同时施用，例如作为组合的单位剂量。本发明还包括药物组合物，其包含在生理学/药学上可接受的赋形剂，例如稳定剂，防腐剂，稀释剂，缓冲剂等中的本发明的核酸或缀合的核酸。
药物组合物可以特别配制用于以固体或液体形式施用。组合物可以配制用于口服施用，肠胃外施用（包括，例如，皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射），局部应用，阴道内或直肠内施用，舌下施用，眼施用，经皮施用或鼻施用。优选使用皮下或静脉内方法递送。
本发明药物和药物组合物的剂量水平可由本领域技术人员通过常规实验确定。在一个实施方案中，单位剂量可含有约0.01 mg/kg至约100 mg/kg体重的核酸或缀合的核酸。另一方面，剂量可以是10 mg/kg至25 mg/kg体重，或1 mg/kg至10 mg/kg体重，或0.05 mg/kg至5 mg/kg体重，或0.1 mg/kg至5 mg/kg体重，或0.1 mg/kg至1 mg/kg体重，或0.1 mg/kg至0.5 mg/kg体重，或0.5 mg/kg至1 mg/kg体重。剂量水平也可以通过其他参数计算，如例如体表面积。
药物组合物可以是无菌可注射的水性悬浮液或溶液，或者是冻干形式。在一个实施方案中，药物组合物可包含冻干的阳离子脂质体/DNA复合物或阳离子脂质体/DNA复合物的水性悬浮液。阳离子脂质体/DNA复合物优选包含本发明的核酸。这种阳离子脂质体/DNA复合物可用于在体外或体内将本发明的核酸递送至靶细胞。
本发明的药物组合物和药物可以以药学有效剂量施用给哺乳动物主体。哺乳动物可选自人，非人灵长类动物，猿猴或原猴（prosimian），狗，猫，马，牛，猪，山羊，绵羊，小鼠，大鼠，仓鼠，刺猬和豚鼠，或其他相关物种。在此基础上，本文所用的措辞“TMPRSS6”表示任何上述物种中的核酸或蛋白质，但优选该措辞表示人核酸或蛋白质。
本发明的进一步的方面涉及本发明的核酸或包含本发明的核酸的药物组合物，其用于治疗或预防疾病或病症。所述疾病或病症可选自血色素沉着病、迟发性皮肤卟啉症和血液病症，例如β-地中海贫血或镰状细胞病、先天性红细胞生成不良性贫血、骨髓衰竭综合征、脊髓发育不良和输血性铁超负荷。该病症可能与铁超负荷有关，且与铁超负荷有关的病症可能是帕金森病、阿尔茨海默病或弗里德赖希共济失调。
特别地，本发明的优选方面包括：
如本文所公开的任何核酸，其用于以下一种或多种或全部：
（i）贫血的治疗，任选地如通过本文方法所公开的通过血红蛋白或血细胞比容的增加或网织红细胞的减少来适当确定的；和/或
（ii）脾大的减少，任选地如通过本文方法所公开的通过按重量计算脾大小的减少来确定的：和/或
（iii）脾中的无效红细胞生成的改善，任选如本文所述的通过由FACS分析测定的脾中未成熟类红细胞的相对比例的降低来确定的；和/或
（iv）骨髓中红细胞成熟/红细胞生成的改善，任选如本文所述的通过由FACS分析测定的祖红细胞的相对比例的降低和去核的类红细胞的增加来确定的。
本发明包括药物组合物，其包含在生理学/药学上可接受的赋形剂，例如稳定剂，防腐剂，稀释剂，缓冲剂等中的一种或多种根据本发明的RNAi分子。
药物组合物可以是无菌可注射的水性悬浮液或溶液，或者是冻干形式。
在任何根据本发明的实施方案中，药学上可接受的组合物可包含治疗有效量的一种或多种核酸，其单独服用或与一种或多种药学上可接受的载体，赋形剂和/或稀释剂一起配制。
可用作药学上可接受的载体的材料的实例包括：（1）糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；（2）淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；（3）纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；（4）粉状西黄蓍胶；（5）麦芽；（6）明胶；（7）润滑剂，例如镁态（magnesium state）、十二烷基硫酸钠和滑石；（8）赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；（9）油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；（10）甘醇，如丙二醇；（11）多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；（12）酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；（13）琼脂；（14）缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；（15）藻酸；（16）无致热原水；（17）等渗盐水；（18）林格液；（19）乙醇；（20）pH缓冲的溶液；（21）聚酯，聚碳酸酯和/或聚酸酐；（22）膨胀剂，例如多肽和氨基酸（23）血清组分，如血清清蛋白、HDL和LDL；和（22）药物制剂中使用的其他无毒性相容物质。
稳定剂可以是稳定核酸试剂的试剂，例如可以与核酸复合的蛋白质、螯合剂（例如， EDTA）、盐、RNA酶抑制剂和DNA酶抑制剂。
在一些情况下，期望减慢来自皮下或肌内注射的药物的吸收，以延长药物的作用。这可以通过使用水溶性差的晶态或非晶态材料的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，所述溶解速率转而取决于晶体大小和晶形。另一方面，通过将药物溶解或悬浮在油载体中来实现肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。
本文描述的核酸可能能够抑制TMPRSS6的表达。本文描述的核酸可能能够部分抑制细胞中TMPRSS6的表达。抑制可以是完全的，即，在没有本发明核酸的情况下TMPRSS6表达的表达水平的0％。TMPRSS6表达的抑制可能是部分的，即，它可能是在没有本发明的核酸的情况下TMRPSS6表达的15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%。当用于主体，例如人主体中时，抑制可持续2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、11周、12周、13周、14周或最多到6个月。本发明的核酸或缀合的核酸或包含其的组合物可供在包括每周一次或两次、每周、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周，每七周或每八周的治疗的用药法中，或在具有不同给药频率（例如前述间隔的组合）的用药法中使用。核酸可以供皮下、静脉内或使用任何其他应用途径如口服、直肠或腹膜内使用。
在用本发明的核酸治疗或接受本发明的核酸的细胞和/或主体中，与未治疗的细胞和/或主体相比，TMPRSS6表达可被抑制15％至最多到100％但至少约30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或100％。抑制水平可以允许治疗与TMPRSS6表达或超表达有关的疾病，或者可以允许进一步研究TMPRSS6基因产物的功能。
与未治疗的细胞和/或主体相比，由于TMPRSS6基因表达的完全或部分抑制，用本发明的核酸或缀合的核酸治疗的细胞和/或主体中的铁调素基因表达可以增加到至少约1.2倍、约1.5-倍、约2-倍、约3-倍、约4-倍或约5-倍。与未治疗的主体相比，这可导致本发明的核酸或缀合的核酸治疗的主体中的血清铁调素浓度可增加至少约10％、约25％、约50％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％或约500％。
与未治疗的主体相比，用本发明的核酸或缀合的核酸治疗的主体中的血清或血浆铁浓度可以降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％。铁传递蛋白饱和度是一种医学实验室测试，其测量与铁结合的铁传递蛋白的量。以百分比测量的铁传递蛋白饱和度是医学实验室值，其测量血清铁的值除以总的铁传递蛋白铁结合能力。与未治疗的主体相比，用本发明的核酸或缀合的核酸治疗的主体中的铁传递蛋白饱和度可降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％。
本发明的进一步的方面涉及在制备用于治疗或预防诸如如上文所列举的疾病或病症的疾病或病症的药物中的本发明的核酸。
本发明还包括治疗或预防疾病或病症的方法，例如上面列举的那些，包括向需要治疗的个体施用包含本发明的核酸或缀合的核酸的药物组合物。该组合物可以每周两次、每周一次、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周或每八周施用。核酸或缀合的核酸可以供皮下或静脉内或其他应用途径使用，例如口服、直肠或腹膜内。
在一个实施方案中，向主体施用核酸试剂的初始剂量和一种或多种维持剂量。维持剂量或多种维持剂量可以与初始剂量相同或更低，例如，初始剂量的一半更少。维持剂量例如每2、5、10或30天施用不多于一次。治疗方案可持续一段时间，该时间段将依赖于特定疾病的特性、其严重程度和患者的总体状况而变化。
在一个实施方案中，组合物包含多种核酸试剂种类。在另一个实施方案中，核酸试剂种类具有就天然存在的靶序列而论与另一种类非重叠且非相邻的序列。在另一个实施方案中，多种核酸试剂种类对不同的天然存在的靶基因是特异性的。在另一个实施方案中，核酸试剂是等位基因特异性的。
本发明的核酸或缀合的核酸也可以与其他治疗用化合物组合施用或用于与其他治疗用化合物组合，或者分开施用或者同时施用，例如作为组合的单位剂量。
本发明的核酸或缀合的核酸可以使用本领域的常规方法产生，包括化学合成或在体外（例如，失控转录）或体内表达核酸。例如，使用固相化学合成或使用基于核酸的表达载体，包括病毒衍生物或部分或完全合成的表达系统。在一个实施方案中，表达载体可用于在体外、在中间宿主生物或细胞类型内、在中间或最终生物内或在所期望的靶细胞内产生本发明的核酸。用于产生（合成或酶促转录）本文所述核酸的方法是本领域技术人员已知的。
在本发明的进一步实施方案中，本发明涉及根据本文任何公开内容的任何核酸、缀合的核酸、用于使用的核酸、方法、组合物或用途，其中所述核酸包含乙烯基-(E)-膦酸酯修饰，例如5'乙烯基-(E)-膦酸酯修饰，优选5'乙烯基-(E)-膦酸酯修饰与第一链第二位置的2'-F修饰组合。
在本发明的进一步实施方案中，本发明涉及根据本文任何公开内容的任何核酸、缀合的核酸、用于使用的核酸、方法、组合物或用途，其中第一链和第二链的至少一个的3'端的末端核苷酸是反向核苷酸，并通过末端核苷酸的3'碳和相邻核苷酸的3'碳附着到相邻核苷酸和/或第一链和第二链的至少一个的5'端的末端核苷酸是反向核苷酸，并通过末端核苷酸的5'碳和相邻核苷酸的5'碳附着到相邻核苷酸，
任选其中
a. 第一和/或第二链的3'和/或5'反向核苷酸通过磷酸二酯键经由磷酸基团与相邻核苷酸附着；或
b. 第一和/或第二链的3'和/或5'反向核苷酸通过硫代磷酸酯基团与相邻核苷酸附着或
c. 第一和/或第二链的3'和/或5'反向核苷酸通过二硫代磷酸酯基团与相邻核苷酸附着。
在本发明的进一步实施方案中，本发明涉及根据本文任何公开内容的任何核酸、缀合的核酸、用于使用的核酸、方法、组合物或用途，其中所述核酸包含二硫代磷酸酯键，
任选地，其中所述键位于第二链的2个最5'核苷酸和/或2个最3'核苷酸之间，和/或
任选地，其中所述核酸另外不包含任何内部硫代磷酸酯键。
在本发明的进一步实施方案中，本发明涉及本文公开的核酸序列，其中核酸的第一链和/或第二链包含至少第一和第二类型的修饰的核糖核苷酸，并且其中存在的第一类型的修饰的核糖核苷酸比第二类型的修饰的核苷酸多（例如，2'O甲基修饰比2'氟修饰更多），或者在每条链上单独计数，或者遍及第一和第二链两者计数。
为避免疑惑，核酸可具有超过两种类型的修饰。
本发明的另一个实施方案涉及本文公开的任何核酸序列，其中第一和/或第二链的大于50％的核苷酸包含2'O-甲基修饰，例如第一和/或第二链的大于55%、60%、65%、70%、75%、80%或85％或更多包含2'O-甲基修饰，优选作为第一和第二链两者的总核苷酸的百分比测量。
本发明的另一个实施方案涉及本文公开的任何核酸序列，其中第一和/或第二链的大于50％的核苷酸包含天然存在的RNA修饰，例如其中第一和/或第二链的大于55%、60%、65%、70%、75%、80%或85％或更多包含这种修饰，优选作为第一和第二链两者的总核苷酸的百分比测量。合适的天然存在的修饰除2-O'甲基之外包括其他2'糖修饰，特别是结果产生DNA核苷酸的2'-H修饰。
本发明的另一个实施方案涉及本文公开的任何核酸序列，其在第一和/或第二链上包含不多于20％，例如不多于15％，例如不多于10％的具有不是2'O甲基修饰的2'修饰的核苷酸，优选作为第一和第二链两者的总核苷酸的百分比。
本发明的另一个实施方案涉及本文公开的任何核酸序列，其在第一和/或第二链上包含不多于20％，（例如不多于15％或不多于10％）的2'氟修饰，优选作为两条链的总核苷酸的百分比。
本发明的另一个实施方案涉及用于抑制TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第一链包含如下的HC18A的核苷酸序列；且任选地，其中所述第二链包含如下的HC18b的核苷酸序列：
任选地，核酸序列是如下的TMPRSS6-hc-18A，或TMPRSS6-hc-18A和18B两者：
任选地，核酸序列是下文列举的序列之一或两者。
所有序列均5'-3'排列。用于抑制TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第一链包含如下的HC23A的核苷酸序列；且任选地，其中所述第二链包含如下的HC23B的核苷酸序列：
任选地，核酸序列是如下的TMPRSS6-hc-23A，或TMPRSS6-hc-23A和23B两者：
任选地，核酸序列是下文列举的序列之一或两者。
本发明的另一个实施方案是用于抑制细胞中TMPRSS表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS基因转录的RNA的至少部分互补，其中细胞中TMPRSS的表达降低至比在相同的测试条件但没有核酸或缀合的核酸的情况下或有非沉默对照的情况下观察到的表达水平低至少15％的水平。
核酸可以是本文公开的任何核酸。
下面列举了本发明的某些优选特征：
发明陈述
1. 用于抑制TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：
2. 陈述1的核酸，其中所述第二链包含以下的核苷酸序列
3. 陈述1或陈述2的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO：17的核苷酸序列。
4. 陈述1至3中任一项的核酸，其中所述第二链包含SEQ ID NO：18的核苷酸序列。
5. 根据陈述1至4中任一项所述的核酸，其中所述第一链和/或所述第二链各自的长度为17-35个核苷酸。
6. 陈述1至5中任一项的核酸，其中所述至少一个双链体区由19-25个连续的核苷酸碱基对组成。
7. 任何前述陈述的核酸，其
a）在两端都是平端的；或
b）在一端具有突出端而在另一端具有平端；或
c）在两端都具有突出端。
8. 根据任何前述陈述的核酸，其中所述第一和/或第二链上的一个或多个核苷酸被修饰，以形成修饰的核苷酸。
9. 陈述8的核酸，其中所述第一链的奇数核苷酸中的一个或多个被修饰。
10. 根据陈述9的核酸，其中所述第一链的偶数核苷酸中的一个或多个被至少第二修饰修饰，其中所述至少第二修饰不同于陈述9的修饰。
11. 陈述10的核酸，其中所述一个或多个修饰的偶数核苷酸中的至少一个与所述一个或多个修饰的奇数核苷酸中的至少一个相邻。
12. 陈述9至11中任一项的核酸，其中多个奇数核苷酸被修饰。
13. 陈述10至12的核酸，其中多个偶数核苷酸通过第二修饰进行修饰。
14. 陈述8至13中任一项的核酸，其中所述第一链包含通过共同修饰修饰的相邻核苷酸。
15. 陈述9至14中任一项的核酸，其中所述第一链包含通过与陈述9的修饰不同的第二修饰修饰的相邻核苷酸。
16. 陈述9至15中任一项的核酸，其中所述第二链的奇数核苷酸中的一个或多个通过与陈述9的修饰不同的修饰进行修饰。
17. 根据陈述9至15中任一项的核酸，其中所述第二链的偶数核苷酸中的一个或多个通过陈述9的修饰进行修饰。
18. 陈述16或17的核酸，其中所述第二链的一个或多个修饰的偶数核苷酸中的至少一个与所述第二链的一个或多个修饰的奇数核苷酸相邻。
19. 陈述16至18中任一项的核酸，其中所述第二链的多个奇数核苷酸通过共同修饰进行修饰。
20. 陈述16至19中任一项所述的核酸，其中多个偶数核苷酸通过根据陈述9的修饰进行修饰。
21. 陈述16至20中任一项所述的核酸，其中所述第二链上的多个奇数核苷酸通过第二修饰进行修饰，其中所述第二修饰不同于陈述9的修饰。
22. 陈述16至21中任一项的核酸，其中所述第二链包含通过共同修饰修饰的相邻核苷酸。
23. 陈述16至22中任一项的核酸，其中所述第二链包含通过第二修饰修饰的相邻核苷酸，所述第二修饰不同于陈述9的修饰。
24. 根据陈述8至23中任一项的核酸，其中所述第一链中的每个奇数核苷酸和所述第二链中的每个偶数核苷酸用共同修饰进行修饰。
25. 陈述24的核酸，其中每个偶数核苷酸在第一链中用第二修饰进行修饰，并且每个奇数核苷酸在第二链中用第二修饰进行修饰。
26. 根据陈述8至25中任一项的核酸，其中相对于所述第二链的未修饰或不同修饰的核苷酸，所述第一链的修饰的核苷酸移动至少一个核苷酸。
27. 根据陈述8至26中任一项的核酸，其中所述修饰和/或多种修饰各自和单独地选自3'-末端脱氧胸腺嘧啶、2'-O-甲基、2'-脱氧-修饰、2'-氨基-修饰、2'-烷基-修饰、吗啉代修饰、氨基磷酸酯修饰、5'-硫代磷酸酯基团修饰、5'磷酸或5'磷酸模拟物修饰和胆甾烯基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团修饰。
28. 根据陈述8至27中任一项所述的核酸，其中所述修饰是锁定核苷酸、无碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任何一种。
29. 根据陈述8至28中任一项的核酸，其中所述至少一个修饰是2'-O-甲基。
30. 根据陈述8至29中任一项的核酸，其中所述至少一个修饰是2'-F。
31. 用于抑制细胞中TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID Nos：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213或215，其中第一链的核苷酸在奇数核苷酸上通过第一修饰进行修饰，并在偶数核苷酸上通过第二修饰进行修饰，并且第二链的核苷酸在偶数核苷酸上通过第三修饰进行修饰，并在奇数核苷酸上通过第四修饰进行修饰，其中至少所述第一修饰与所述第二修饰不同，且所述第三修饰与所述第四修饰不同。
32. 陈述31的核酸，其中第二序列包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214或216的核苷酸序列。
33. 陈述31或32的核酸，其中所述第四修饰和所述第二修饰是相同的。
34. 陈述31至33中任一项所述的核酸，其中所述第一修饰和所述第三修饰是相同的。
35. 陈述31至34中任一项的核酸，其中所述第一修饰是2'O-Me，且所述第二修饰是2'F。
36. 陈述31至35中任一项的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO：17的核苷酸序列，且所述第二链包含SEQ ID NO：18的核苷酸序列。
37. 陈述31至36中任一项的核酸，包含如下表中所示的序列和修饰：
其中，具体修饰由数字描述，
38. 根据陈述1至37中任一项的核酸，其与配体缀合。
39. 根据陈述1至38中任一项所述的核酸，其在所述第一和/或第二链的末端一个、两个或三个3'核苷酸和/或5'核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。
40. 根据陈述1至39中任一项所述的核酸，其在所述第一链上的三个末端3'的每一个之间和三个末端5'核苷酸的每一个之间包含两个硫代磷酸酯键，并且在所述第二链的3'端的三个末端核苷酸之间包含两个硫代磷酸酯键。
41. 用于抑制细胞中TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213或215，其中所述核酸与配体缀合。
42. 根据陈述41所述的核酸，其中所述配体包含（i）一种或多种N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）部分及其衍生物，和（ii）接头，其中所述接头将所述GalNAc部分与如在陈述41中定义的核酸缀合。
43. 根据陈述41或42的核酸，其中所述接头可以是二价或三价或四价分支结构。
44. 陈述41至43的核酸，其中核苷酸如任何前述陈述中所定义的那样被修饰。
45. 任何前述陈述的核酸，其中所述配体包含式I：
[S-X1-P-X2]3-A-X3- （I）
其中：
S代表糖，其中所述糖是N-乙酰半乳糖胺；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m为1、2或3；
P是磷酸或改性磷酸（优选硫代磷酸）；
X2为亚烷基或式(-CH2)n-O-CH2-的亚烷基醚，其中n = 1-6；
A是分支单元；
X3代表桥连单元；
其中根据本发明的核酸通过磷酸或改性磷酸（优选硫代磷酸）与X3缀合。
46. 具有以下结构之一的缀合的核酸
其中Z是根据陈述1至40中任一项的核酸。
47. 根据陈述1至40中任一项所述的核酸，其与以下结构的配体缀合
48. 任何前述陈述的核酸或缀合的核酸，其中所述双链体包含分开的链。
49. 任何前述陈述的核酸或缀合的核酸，其中所述双链体包含单链，所述单链包含第一链和第二链。
50. 组合物，其包含如任何前述陈述中限定的核酸或缀合的核酸和包含以下物质的制剂：
i）阳离子脂质或其药学上可接受的盐；
ii）类固醇；
iii）磷脂酰乙醇胺磷脂；
iv）加入聚乙二醇的脂质。
51. 根据陈述50的组合物，其中在所述制剂中，阳离子脂质组分的含量可以是脂质制剂的总脂质含量的约55摩尔％至约65摩尔％，优选脂质制剂的总脂质含量的约59摩尔％。
52. 如陈述50所述的组合物，其中所述制剂包含；
具有以下结构的阳离子脂质；
具有以下结构的类固醇；
具有以下结构的磷脂酰乙醇胺磷脂：
以及具有以下结构的加入聚乙二醇的脂质
53. 包含任何前述陈述的核酸或缀合的核酸和生理学上可接受的赋形剂的组合物。
54. 根据任何前述陈述的核酸或缀合的核酸，其用于治疗疾病或病症。
55. 根据任何前述陈述的核酸或缀合的核酸在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。
56. 一种治疗疾病或病症的方法，包括向需要治疗的个体施用包含根据任一前述陈述的核酸或缀合的核酸的组合物。
57. 陈述55的方法，其中所述核酸或缀合的核酸皮下或静脉内施用于主体。
58. 根据陈述54至56中任一项所述的用途或方法，其中所述疾病或病症选自血色素沉着病、生血性卟啉症、输血性铁超负荷和血液病症。
59. 根据陈述58的用途或方法，其中所述血液病症是β-地中海贫血、镰形细胞贫血、先天性铁粒幼红细胞性贫血、再生障碍性贫血或骨髓增生异常综合征。
60. 根据陈述54至59中任一项所述的用途或方法，其中所述病症与铁超负荷有关。
61. 根据陈述60的用途或方法，其中所述与铁超负荷有关的病症是帕金森病、阿尔茨海默病或弗里德赖希共济失调。
62. 制备根据陈述1至49中任一项所述的核酸或缀合的核酸的方法。
现在将参考以下非限制性图和实施例来描述本发明，其中：
图1显示了用于抑制人Hep3B细胞中TMPRSS6表达的RNAi分子筛选的结果；
图2显示了人Hep3B细胞中TMPRSS6 RNAi分子的剂量反应；
图3显示了由不同剂量的GalNAc siRNA分子在小鼠肝组织中降低TMPRSS6表达；
图4显示了由TMPRSS6 siRNA分子对TMPRSS6靶基因的抑制持续时间和小鼠中HAMPmRNA表达的诱导；
图5显示通过用TMPRSS6 siRNA分子处理对TMPRSS6表达的抑制降低了血清中的铁水平达延长的时间；
图6显示通过受体介导的GalNAc缀合的RNAi分子的摄取，1°小鼠肝细胞中TMRPSS6表达的降低；
图7显示了实施例1、3、4、26至31和34至38中使用的GalNAc缀合的RNAi分子；
图8a、8b和8c显示了寡核苷酸与之缀合的在本文中分别称为GN、GN2和GN3的GalNAc配体的结构（也参见下文实施例中的该命名法，其中TMPRSS6 hcm-9与GN、GN2和GN3的每一个缀合）；
图9显示了人Hep3B细胞中由不同siRNA修饰变体对TMPRSS6表达的降低；
图10显示了通过受体介导的摄取由不同GalNAc-siRNA缀合物降低TMPRSS6表达；
图11显示了小鼠中不同GalNAc-siRNA缀合物对TMPRSS6的降低和对HAMP表达的诱导；
图12显示了实施例8、9和10的GalNAc-siRNA分子的序列和修饰；
图13显示了单次注射siRNA缀合物后不同时间点小鼠中肝组织中TMPRSS6表达的降低和血清铁水平的降低；
图14显示了小鼠中由不同剂量的GalNAc缀合的siRNA分子在肝中对TMPRSS6 mRNA水平的降低和对血清铁水平的降低；
图15显示了不同修饰模式对人Hep3B细胞中siRNA分子活性的影响；
图16显示了GalNAc缀合的siRNA分子的不同修饰变体对人Hep3B细胞中TMPRSS6表达的抑制的影响；
图17显示了GalNAc缀合的siRNA的修饰变体对通过受体介导的摄取的原代小鼠肝细胞中TMPRSS6表达的抑制的影响；
图18显示了人Hep3B细胞中由不同siRNA修饰变体对TMPRSS6表达的降低；
图19显示了反向A和G核苷酸对人Hep3B细胞中RNAi活性的影响；
图20显示了反向RNA核苷酸对siRNA稳定性的影响；
图21显示了反向RNA核苷酸对人Hep3B细胞中siRNA活性的影响；
图22显示了反向RNA核苷酸对人Hep3B细胞中RNAi活性的影响；
图23显示了反向RNA核苷酸对通过受体介导的摄取的原代小鼠肝细胞中GalNAc缀合的siRNA活性的影响；
图24显示了二硫代磷酸酯键对GalNAc缀合的siRNA分子稳定性的影响；
图25显示了二硫代磷酸酯键对GalNAc缀合的siRNA分子对小鼠原代肝细胞中TMPRSS6表达的活性的影响；
图26显示了二硫代磷酸酯键对GalNAc缀合的siRNA分子稳定性的影响；
图27显示了由含有二硫代磷酸酯键的GalNAc siRNA缀合物对小鼠原代肝细胞中TMPRSS6表达的抑制；
图28显示了在遗传性血色素沉着病的动物模型中由不同剂量的GalNAc siRNAs对TMPRSS6表达的降低；
图29显示了在遗传性血色素沉着病的动物模型中由不同剂量的GalNAc siRNAs对血清铁调素水平的增加；
图30显示了在遗传性血色素沉着病的动物模型中由不同剂量的GalNAc siRNAs对血清铁水平的降低；
图31显示了在遗传性血色素沉着病的动物模型中由不同剂量的GalNAc siRNAs对铁传递蛋白饱和度的降低；
图32显示了在遗传性血色素沉着病的动物模型中由不同剂量的GalNAc siRNAs对未饱和铁结合力的增加；
图33显示了在遗传性血色素沉着病的动物模型中由GalNAc siRNAs对组织铁水平的降低；
图34显示了通过脂质体递送另外43种siRNAs对Hep3B细胞中人TMPRSS6 mRNA水平的降低；
图35显示了用于Hep3B细胞中TMPRSS6表达抑制的不同siRNAs的剂量反应曲线；
图36显示了通过受体介导的不同浓度GalNAc siRNA缀合物的摄取对原代人肝细胞中TMPRSS6表达的降低；
图37显示了通过用GalNAc siRNA缀合物治疗对中间型·-地中海贫血（thalassemiaintermedia）的啮齿类动物模型中血细胞比容值的增加；
图38显示了通过用GalNAc siRNA缀合物治疗对中间型·-地中海贫血的啮齿类动物模型中红细胞分布宽度的降低。
图39显示了通过用GalNAc siRNA缀合物治疗对中间型·-地中海贫血的啮齿类动物模型血液中网织红细胞比例的降低；
图40显示了通过用GalNAc siRNA缀合物治疗对中间型·-地中海贫血的啮齿类动物模型的红细胞中活性氧类别的减少。
图41显示GalNAc TMPRSS6 siRNA在中间型·-地中海贫血的啮齿类动物模型中提高血红蛋白水平。
图42显示GalNAc TMPRSS6减少中间型·-地中海贫血的啮齿类动物模型中的脾大。
图43显示GalNAc TMPRSS6改善骨髓中的红细胞成熟。
图44显示GalNAc TMPRSS6减少脾中无效的红细胞生成。
图45a和b显示了在原代人肝细胞中siRNA缀合物对TMPRSS6的剂量-反应曲线。
图46显示了原代人肝细胞中由siRNA缀合物对TMPRSS6 mRNA表达的抑制。
图47显示了对于抑制原代人肝细胞中TMPRSS6表达的抑制所测试的GalNAc siRNA缀合物的序列和修饰模式。
图48显示实施例44中使用的核酸的具体序列。
图49显示了含有不同末端稳定化学（硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯）的靶向TMPRSS6的GalNAc siRNA缀合物在原代小鼠肝细胞中的受体介导的摄取。
图50显示了在末端位置和GalNAc部分中具有硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和磷酸二酯的GalNAc-siRNA缀合物的血清稳定性。
图51显示在所示浓度用在反义链的5'-位置携带乙烯基-(E)-膦酸酯2'OMe-尿嘧啶且在前三个核苷酸之间携带两个硫代磷酸酯键（X0204）、在反义链的5'-位置携带乙烯基-(E)-膦酸酯2'OMe-尿嘧啶且在前三个核苷酸之间携带磷酸二酯键（X0205）、（X0139）或四聚体（X0140））的TMPRSS6-siRNA或树样三聚体GalNAc-簇（X0004）或非靶向GalNAc-siRNA（X0028）治疗或未经治疗（UT）后24小时对原代鼠肝细胞中TMPRSS6基因表达的抑制。
图52显示siRNA-缀合物与对于核酸酶降解的较不稳定的阳性对照比较的血清稳定性。
实施例
实施例1
使用如下表中陈述的寡核苷酸（oligos）合成根据本发明的核酸。
合成方法如下，使用本发明的序列之一作为例子：
第一链
第二链
fN（N = A、C、G、U）表示2'氟，2'脱氧核苷
mN（N = A、C、G、U）表示2'O甲基核苷
（ps）表示硫代磷酸酯键
ST23是GalNAc C4亚磷酰胺（结构组分如下）
Long trebler（STKS）
进一步的例子是GN2-TMPRSS6-hcm-9（STS12009L4）：
第一链
第二链
fN（N = A、C、G、U）表示2'氟，2'脱氧核苷
mN（N = A、C、G、U）表示2'O甲基核苷
（ps）表示硫代磷酸酯键
ST23如上。
ST41如下（并且如WO2017/174657中所述）：
所有寡核苷酸或者从商业寡核苷酸制造商（Eurogentech，比利时；Biospring，德国）获得，或者使用标准亚磷酰胺化学在AKTA oligopilot合成仪上合成。使用可商购的固相支持体和2'O-甲基RNA亚磷酰胺（phosphoramidtes），2'氟DNA亚磷酰胺（所有标准保护）和可商购的long trebler亚磷酰胺（Glen research）。使用0.1 M亚磷酰胺在无水乙腈中的溶液进行合成，并使用苄硫基四唑（benzylthiotetrazole）（BTT）作为激活剂（在乙腈中0.3M）。所有其他试剂均为可商购的标准试剂。
根据制造商（Glen Research，AM Biotech）的说明书进行含有PS2的寡核苷酸的合成。根据文献公开的方法合成乙烯基-(E)-膦酸酯2'OMe-尿嘧啶亚磷酰胺（phosphoamidite），并用于寡核苷酸合成（Haraszti等人，Nuc. Acids Res.，45（13），2017，7581-7592）。
通过在标准亚磷酰胺偶联条件下将相应的亚磷酰胺偶联到寡链（oligochain）的5'端来实现GalNAc合成子（ST23）的缀合。使用标准可商购的巯化试剂（EDITH，Linktechnologies）引入硫代磷酸酯。
通过使用甲胺将单链从CPG上切下。在使用TBDMS保护的RNA核苷的情况下，进行用TEA * 3HF的额外处理以除去甲硅烷基保护。使用氯化钠梯度，在AKTA Pure HPLC系统上通过离子交换层析（Resource Q，6mL，GE Healthcare）纯化得到的粗寡核苷酸。合并含有产物的级分，在尺寸排阻柱（Zetadex，EMP Biotech）上脱盐并冻干。
对于退火，将等摩尔量的各单链溶解在水中并加热至80℃进行5分钟。冷却后，将得到的双链体（Duplex）冻干。
所得核酸（siRNAs）的序列在表1中陈述。
表1
表1：对于TMPRSS6表达的抑制所测试的核酸序列。核酸由Biospring, Frankfurt合成。核苷酸修饰由以下数字描述（第4列），1=2´F-dU、2=F`-dA、3=2´F-dC、4=2´F-dG、5=2'-OMe-dU；6=2'-OMe-rA；7=2'-OMe-dC；8=2'-OMe-dG。
表2
表2-每个核酸序列在TMPRSS6 mRNA序列Ref NM_001289000.1内的起始位置。
对于抑制人Hep3B细胞中TMPRSS6表达的筛选。
将细胞以每6孔皿80,000个细胞的细胞密度平板接种。第二天，用20 nM核酸（在表1中列举）和1μg/ml AtuFECT（阳离子脂质Atufect01和促融脂质DPhyPE的50:50制剂）转染细胞。转染后两天，裂解细胞，并使用表3中的扩增子通过q-RT-PCR测定TMPRSS6 mRNA水平。将TMPRSS6 mRNA水平相对于持家基因PTEN的表达水平归一化。萤光素酶和PTEN的核酸用作非靶向对照核酸。结果示于图1中。
表3
表3：用于测量各基因的mRNA水平的TMPRSS6、肌动蛋白、PTEN和HAMP扩增子组的序列。
实施例2
用于抑制人Hep3B细胞中TMPRSS6表达的TMPRSS6核酸的剂量反应。
将细胞以每6孔皿150,000个细胞的细胞密度平板接种。第二天，用1μg/mlAtuFECT（阳离子脂质Atufect01和促融脂质DPhyPE的50:50制剂）和如图2中的图解的X-轴所描述的不同量的TMPRSS6核酸（分别为30、10、3、1、0.3、0.1、0.003 nM）转染细胞。对于非靶向对照样品，用30和10 nM萤光素酶的核酸转染细胞。转染后两天，裂解细胞，并通过q-RT-PCR测定mRNA水平。将TMPRSS6 mRNA水平相对于持家基因PTEN的表达水平归一化。通过TMPRSS6-hcm9核酸观察到TMPRSS6 mRNA表达的最高降低。用萤光素酶核酸转染不影响TMPRSS6 mRNA水平。结果示于图2中。RNAi分子的序列描述于表1中。
实施例3
通过不同剂量的GalNAc核酸抑制肝组织中的TMPRSS6表达。
通过皮下施用，用单剂的10、3或1 mg/kg GalNAc核酸缀合物治疗C57/BL6小鼠。各种siRNA缀合物的序列和修饰示于图7中。siRNA与图8a中描述并在其中记载的GalNAc接头（GN）缀合。对照组分别用等渗盐水或非靶向对照缀合物GN-TTR-hc治疗。在皮下注射缀合物后3天通过qRT PCR评估肝组织中的靶基因表达。从骤冷组织样品中分离总RNA，并进行qRT-PCR，如之前所述的（Kuhla等人，2015，Apoptosis 第4卷，500-11）。使用的TaqMan探针示于表3中。结果示于图3中。
实施例4
由TMPRSS6 RNAi分子抑制靶基因的持续时间。
通过皮下注射用3 mg/kg GalNAc-TMPRSS6 RNAi分子治疗小鼠。各siRNA缀合物的序列和修饰示于图7中。在治疗后第7、14、21、27、34或41天（注射后数天，dpi）在肝组织中评估靶mRNA表达。直到注射后第41天都观察到肝中TMPRSS6表达的降低。在用GN-TMPRSS6RNAi分子治疗的小鼠的肝中HAMP（铁调素）mRNA表达上调。结果示于图4中。
实施例5
通过用TMPRSS6 siRNA治疗抑制TMPRSS6表达降低血液中的铁水平。
在用3 mg/kg GalNAc核酸缀合物皮下治疗小鼠后7、14、21、27、34和41天在血清中分析铁水平。一直到注射后41天（dpi 41）血清铁水平都降低。各siRNA缀合物的序列和修饰示于图7中。结果示于图5中。
实施例6
通过受体介导的摄取抑制TMPRSS6表达。
将原代小鼠肝细胞平板接种在胶原包被的皿上，并与于如所示的100nM至0.03nM的浓度在细胞培养基中稀释的siRNA缀合物一起温育。在将细胞暴露于siRNA缀合物后24小时，提取总RNA并通过Taqman qRT-PCR定量TMPRSS6表达。将TMPRSS6 mRNA水平相对于肌动蛋白mRNA水平归一化。通过两种GalNAc-TMPRSS6 siRNA缀合物均观察到TMPRSS6表达的剂量依赖性抑制。GN2-Luc-siRNA1 GalNAc缀合物（GN2-Luc）用作非靶向对照，并且不影响TMPRSS6 mRNA表达。各siRNA缀合物的序列和修饰描述于图7中。结果示于图6中。
实施例7
根据上述方法合成进一步的TMPRSS6 siRNAs。序列和修饰示于下表4中：
靶向TMPRSS6的siRNA的修饰变体（序列ID 17和ID18）。对于每个双链体，第一序列（A链）列在顶部，且第二序列（B链）列在下面。所有序列对应于SEQ ID NO：17（顶部）和SEQ IDNO：18（底部）。修饰代码在表4的末尾列举。
表4
表4：修饰由表底部的行中显示的数字描述，并且对于每个双链体，第一链在顶部而第二链在下面。
在人Hep3B细胞中测试了一种靶向TMPRSS6的siRNA的不同修饰变体。靶向PTEN和萤光素酶的siRNAs分别用作非相关和非靶向对照。所有siRNA于1 nM用1μg/ml Atufect转染（当指出时为0.1 nM）。转染后48小时提取总RNA，并通过Taqman qRT-PCR定量TMPRSS6mRNA水平。将TMPRSS6 mRNA水平相对于肌动蛋白mRNA水平归一化。每个条代表三次技术重复的平均值+/-SD。结果示于图9中。
实施例8
合成靶向TMPRSS6的GalNAc-缀合的siRNA的修饰变体，并显示在图12中。对于每个双链体，第一链序列列在顶部，且第二链序列列在下面。修饰被描述为数字并且如下：GN表示与根据图8a的GalNAc接头的缀合。STS12（GN-TMPRSS6-hcm9）的序列和修饰也在图7中描述。
实施例9
靶向TMPRSS6的一种GalNAc缀合的序列（STS012）的不同修饰变体降低小鼠原代肝细胞中的TMPRSS6表达。对于受体介导的摄取，将细胞与100、10、1和0.1 nM siRNA缀合物一起温育24小时。提取总RNA并通过Taqman qRT-PCR定量TMPRSS6 mRNA水平。将TMPRSS6 mRNA水平相对于肌动蛋白mRNA水平归一化。每个三次技术重复的平均值+/-SD显示在图10中。
实施例10
在体内测试了靶向TMPRSS6的一种GalNAc-缀合的序列（STS012，GN-TMPRSS6-hcm9）的不同修饰变体。将1 mg/kg和3 mg/kg GalNAc-siRNA缀合物皮下注射到雄性C57BL/6JOlaHsd小鼠中。治疗后14天，通过Taqman qRT-PCR分析肝中的TMPRSS6（A）和HAMP（B）mRNA水平。条代表至少4只动物的平均值+/-SD。结果显示在图11中。
实施例11
在体内测试了靶向TMPRSS6的一种GalNAc-缀合的序列（STS012）的两种不同的修饰变体。将1 mg/kg GalNAc-siRNA缀合物皮下注射到雄性C57BL/6JOlaHsd小鼠中。治疗后14和28天，通过Taqman qRT-PCR分析肝中的TMPRSS6 mRNA水平（A）。此外，分析血清铁水平（B）。结果显示在图13中。框图代表4只动物的中位数。统计学分析基于包括相对于PBS组的Dunn氏多重比较检验（Dunn‘s multiple comparison test）在内的Kruskal-Wallis检验。
序列如实施例10中那样。
实施例12
在体内测试了靶向TMPRSS6的一种GalNAc-缀合的序列（STS12009L4，GN2-TMPRSS6-hcm9）的两种不同的修饰变体。将1 mg/kg和0.3 mg/kg GalNAc-siRNA缀合物皮下注射到雄性C57BL/6JOlaHsd小鼠中。治疗后14天，通过Taqman qRT-PCR分析肝中的TMPRSS6 mRNA水平（A）。此外，分析血清铁水平（B）。结果显示在图14中。框图代表4只动物的中位数。统计学分析基于包括相对于PBS组的Dunn氏多重比较检验在内的Kruskal-Wallis检验。
使用的双链体如下示于表5中。所有序列对应于SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18
表5
表5：靶向TMPRSS6的GalNAc-缀合的序列的修饰变体。
实施例13
在人Hep3B细胞中测试了一种靶向TMPRSS6的siRNA的不同修饰变体。靶向萤光素酶的siRNA用作非靶向对照。所有siRNA于1 nM和0.1 nM用1μg/ml Atufect转染。转染后48小时提取总RNA，并通过Taqman qRT-PCR定量TMPRSS6 mRNA水平。将TMPRSS6 mRNA水平相对于PTEN mRNA水平归一化。结果示于图15中。每个条代表三次技术重复的平均值+/-SD。
序列示于下表6中。所有序列对应于SEQ ID NO：17（顶部）和SEQ ID NO：18（底部）。
表6
表6：靶向TMPRSS6的一种siRNA的不同修饰变体。
实施例14
在人Hep3B细胞中测试了靶向TMPRSS6的GalNAc-缀合的siRNA的修饰变体。每6孔接种150,000个细胞。24小时后，siRNA缀合物于10、1、0.1、0.01和0.001 nM（A）或5、0.5、0.05、0.005 nM（B）用1μg/ml Atufect转染。针对萤光素酶的GalNAc-siRNA用作非靶向对照。转染后72小时提取总RNA，并通过Taqman qRT-PCR定量TMPRSS6 mRNA水平。将TMPRSS6 mRNA水平相对于PTEN mRNA水平（A）或肌动蛋白mRNA水平（B归一化。结果示于图16中。每个条代表三次技术重复的平均值+/-SD。
序列显示在下表7中
表7
表7：靶向TMPRSS6的GalNAc-缀合的siRNA的修饰变体
实施例15
在小鼠原代肝细胞中测试了靶向TMPRSS6的GalNAc-缀合的序列（STS12009L4）的修饰变体。对于受体介导的摄取，将细胞与100、25、5、1、0.25和0.05 nM siRNA缀合物一起温育24小时。靶向无关序列的GalNAc-siRNA（GN-TTR）和非靶向GalNAc-siRNA（GN-Luc）用作对照。提取总RNA并通过Taqman qRT-PCR定量TMPRSS6 mRNA水平。将TMPRSS6 mRNA水平相对于PTEN mRNA水平归一化。结果示于图17中。显示了每个三次技术重复的平均值+/-SD。
序列显示在上表7中。
实施例16
在人Hep3B细胞中测试了一种靶向TMPRSS6的siRNA的不同的含DNA和LNA的变体。因此，每6-孔接种150,000个细胞。24小时后，siRNAs于0.1 nM siRNA用1μg/ml Atufect转染。转染后48小时提取总RNA，并通过Taqman qRT-PCR定量TMPRSS6 mRNA水平。将TMPRSS6 mRNA水平相对于肌动蛋白mRNA水平归一化。结果显示在图18中。每个条代表三次技术重复的平均值+/-SD。
序列显示在下表8中。所有序列对应于SEQ ID NO：17（顶部）和SEQ ID NO：18（底部）。
表8
表8：一种靶向TMPRSS6的siRNA的不同的含DNA和LNA的变体。
实施例17
使用针对TMPRSS6的siRNA分析在末端3'位置的反向A和G RNA核苷酸的影响。TMP70在所有末端都含有硫代磷酸酯，而TMP82和TMP83在反义的3'-端和有义的3'-端含有ivA（TMP82）和ivG（TMP83）。除了各链的末端核苷酸外，存在两种反向核苷酸，并通过硫代磷酸酯键连接。包括非相关siRNA（PTEN）和非靶向siRNA（Luci）作为对照。所有测试的变体在测试条件下都显示出类似的活性。
该实验在Hep3B细胞中进行。将细胞以每6-孔150,000个细胞的密度接种，24小时后用1 nM和0.1 nM siRNA和1μg/ml Atufect转染，且48小时后裂解。提取总RNA并通过Taqman qRT-PCR测定TMPRSS6和肌动蛋白mRNA水平。结果示于图19中。每个条代表来自三次技术重复的平均值±SD。
序列示于下表9中。序列对应于SEQ ID NO：17（顶部）或SEQ ID NO：18（底部）。
表9
表9：在不同位置包括反向RNA核苷酸的针对TMPRSS6的siRNA。
实施例18
测试在两个3'-端含有反向RNA核苷酸的不同siRNA双链体的血清稳定性。TMP84-TMP87除有义链中的最后一个核苷酸外并代替反义链中的最后一个核苷酸含有反向RNA。TMP88-TMP91除反义链中的最后一个核苷酸外并代替有义链中的最后一个核苷酸含有反向RNA。所有反向RNA核苷酸替代末端使用的硫代磷酸酯。在TMP84-TMP87的设计中，ivA和ivG赋予测试的序列比ivU和ivC更高的稳定性（A部分）。在TMP88-TMP91的设计中，碱基同一性对双链体稳定性没有影响（B部分）。
结果示于图20中。“UT”表示未处理的样品。“FBS”表示siRNA双链体，其于5μM终浓度与50％FBS温育3天，酚/氯仿提取并用乙醇沉淀。在天然凝胶电泳中在20％TBE聚丙烯酰胺凝胶上分析样品。
序列显示在下表10中，并且对应于SEQ ID NO：17（顶部）和SEQ ID NO：18（底部）。
表10
表10：在两个3'-端含有反向RNA核苷酸的不同siRNA双链体。
实施例19
使用针对TMPRSS6的siRNA分析在末端3'位置的反向RNA核苷酸的影响。TMP70在所有末端都含有硫代磷酸酯，而TMP84-TMP87在有义链的3'-端含有ivG。除最后一个核苷酸外存在反向RNA核苷酸，并替代两个硫代磷酸酯。在反义3'-端，测试了ivA（TMP84）、ivU（TMP85）、ivC（TMP86）和ivG（TMP87）。这些反向RNA核苷酸是代替末端核苷酸并替代硫代磷酸酯添加的。包括非相关siRNA（PTEN）和非靶向siRNA（Luci）作为对照。所有测试的变体在测试条件下都显示出类似的活性。
该实验在Hep3B中进行。将细胞以每6-孔150,000个细胞的密度接种，24小时后用1nM和0.1 nM siRNA和1μg/ml Atufect转染，且48小时后裂解。提取总RNA并通过TaqmanqRT-PCR测定TMPRSS6和肌动蛋白mRNA水平。结果示于图21中。每个条代表来自三次技术重复的平均值±SD。
序列如上表10中那样。
实施例20
使用针对TMPRSS6的siRNA分析在末端3'位置的反向RNA核苷酸的影响。TMP70在所有末端都含有硫代磷酸酯，而TMP88-TMP91在反义链的3'-端含有ivG。除最后一个核苷酸外存在反向RNA核苷酸，并替代两个硫代磷酸酯。在有义3'-端，测试了ivA（TMP88）、ivU（TMP89）、ivC（TMP90）和ivG（TMP91）。这些反向RNA核苷酸是代替末端核苷酸并替代硫代磷酸酯添加的。包括非相关siRNA（PTEN）和非靶向siRNA（Luci）作为对照。所有测试的变体在测试条件下都显示出类似的活性。
该实验在Hep3B中进行。将细胞以每6-孔150,000个细胞的密度接种，24小时后用1nM和0.1 nM siRNA和1μg/ml Atufect转染，且48小时后裂解。提取总RNA并通过TaqmanqRT-PCR测定TMPRSS6和肌动蛋白mRNA水平。结果示于图22中。每个条代表来自三次技术重复的平均值±SD。
序列如上表10中所示那样。
实施例21
在脂质体转染中使用靶向TMPRSS6的GalNAc-siRNA缀合物分析在末端3'位置的反向RNA核苷酸的影响。STS12009-L4在所有非缀合的末端都含有硫代磷酸酯，而测试的变体在有义和反义链两者的3'-端含有反向RNA核苷酸。除最后一个核苷酸外存在反向RNA，并替代两个末端硫代磷酸酯（STS12009V10-L4和-V11-L4），或者除了末端硫代磷酸酯之外使用反向RNA（STS12009V29-L4和STS12009V30-L4）。使用反向A（STS12009V10-L4和-V29-L4）和反向G（STS12009V11-L4和-V30-L4）。所有测试的变体在测试条件下都显示出类似的活性。
该实验在Hep3B中进行。将细胞以每6-孔150,000个细胞的密度接种，24小时后用5nM至0.0016 nM siRNA和1μg/ml Atufect转染，且48小时后裂解。提取总RNA并通过TaqmanqRT-PCR测定TMPRSS6和肌动蛋白mRNA水平。结果示于图23中。每个条代表三次技术重复的平均值±SD。
序列在下表11中陈述，并对应于SEQ ID NO：17（顶部）和SEQ ID NO：18（底部）。
表11
表11：在3'端包含反向RNA核苷酸的siRNA序列
实施例22
在个别末端含有一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物的血清稳定性测定。将GalNAc与有义链的5'-端缀合，并通过四个PS内部稳定化。将二硫代磷酸酯修饰置于5'-反义（STS12009V37L4）、3'-反义（STS12009V36L4）和3'-有义（STS12009V34L4）端。STS12009L4在5'-反义、3'-反义和3'-有义端各含有两个末端PS，GalNAc附着到有义5'-端并通过四个内部PS稳定化。将5μM GalNAc-siRNA缀合物与50％FBS于37℃温育3天。提取RNA并在20％TBE聚丙烯酰胺凝胶上分析。结果示于图24中。“UT”表示未处理的样品，“FBS”表示FBS处理。“对照”表示较低稳定化的不同序列的GalNAc-siRNA缀合物。
序列显示在下表12中，并且对应于SEQ ID NO：17（顶部）和SEQ ID NO：18（底部）。
表12
表12：在个别末端含有一个PS2（二硫代磷酸酯）的GalNAc-siRNA缀合物。
实施例23
在个别末端含有一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物的活性。将GalNAc与有义链的5'-端缀合，并通过四个PS内部稳定化。将二硫代磷酸酯修饰置于5'-反义（STS12009V37L4）、3'-反义（STS12009V36L4）和3'-有义（STS12009V34L4）端。该实验在小鼠原代肝细胞中进行。将细胞以每6-孔250,000个细胞的密度接种，并用100 nM、10 nM和1 nM GalNAc-siRNA处理。用10 nM GalNAc-siRNA和1μg/ml Atufect的转染充当对照。24小时后裂解细胞，提取总RNA并通过Taqman qRT-PCR测定TMPRSS6和PTEN mRNA水平。结果示于图25中。每个条代表来自三次技术重复的平均值±SD。
序列如上表12中所陈述的那样。
实施例24
在第二链5'-端和第二链3'-端各含有一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物（STS12009V40L4）的血清稳定性测定。将GalNAc与第二链的5'-端缀合，并且不通过任何内部PS稳定化。STS12009L4在5'-反义、3'-反义和3'-有义端各含有两个末端PS，GalNAc附着到有义5'-端并通过四个内部PS稳定化。将5μM GalNAc-siRNA缀合物与50％FBS于37℃温育3天。提取RNA并在20％TBE聚丙烯酰胺凝胶上分析。结果示于图26中。“UT”表示未处理的样品，“FBS”表示FBS处理。“对照”表示较低稳定化的不同序列的GalNAc-siRNA缀合物。
序列在下表13中陈述，并且是SEQ ID NO：17（顶部）和SEQ ID NO：18（底部）。
表13
表13：在第二链5'-端和第二链3'-端各含有一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物。
实施例25
在有义链5'-端和有义链3'-端各含有一个PS2的GalNAc-siRNA缀合物（STS12009V40L4）的活性。将GalNAc与有义链的5'-端缀合，并且不通过任何内部PS稳定化。STS12009L4在5'-反义、3'-反义和3'-有义端各含有两个末端PS，GalNAc附着到有义5'-端并通过四个内部PS稳定化。该实验在小鼠原代肝细胞中进行。将细胞以每6-孔250,000个细胞的密度接种，并用100 nM、10 nM和1 nM GalNAc-siRNA处理。针对萤光素酶的siRNA的GalNAc缀合物（“GalNAc-Luc”）充当对照。24小时后裂解细胞，提取总RNA并通过TaqmanqRT-PCR测定TMPRSS6和PTEN mRNA水平。结果示于图27中。每个条代表来自三次技术重复的平均值±SD。
序列如上表13中所陈述的那样。
实施例26
在遗传性血色素沉着病的动物模型中通过不同剂量的GalNAc siRNAs对TMPRSS6表达的抑制。HFE-/-雌性小鼠（Herrmann等人，J. Mol. Med (Berl)，2004 82，39-48）分别用单剂的1或3 mg/kg GalNAc siRNA缀合物皮下治疗。通过皮下注射用PBS或用非靶向对照GN2-Luc siRNA1（GN2-Luc）治疗对照组。在注射缀合物后三周通过qRT PCR评估肝组织中的靶基因表达。组平均值和+/-SD。统计学：包括未修正的Dunn在内的Kruskal-Wallis检验。siRNA缀合物的序列和修饰描述于图7中。结果示于图28中。P值：****P<.001；***P<0.005；**.01；*P<.05。
实施例27
在遗传性血色素沉着病的动物模型中通过不同剂量的GalNAc siRNAs增加血清铁调素水平。HFE-/-小鼠通过皮下注射用单剂的1或3 mg/kg GalNAc siRNA缀合物治疗。用PBS或用非靶向对照缀合物GN2-Luc siRNA 1（GN2-Luc）治疗对照组。使用ELISA试剂盒（IntrinsicLife Science）在注射缀合物后三周收集的血清样品中测定铁调素水平。具有SD的组平均值。包括相对于对照组（GN2-Luc siRNA）的未修正的Dunn氏检验在内的Kruskal-Wallis检验。结果示于图29中。P值：****P<.001；***P<0.005；**.01；*P<.05。
实施例28
在遗传性血色素沉着病的动物模型中通过不同剂量的GalNAc siRNAs降低血清铁水平。HFE-/-小鼠通过皮下施用用单剂的1或3 mg/kg GalNAc siRNA缀合物治疗。用PBS或用非靶向对照缀合物（GN2-Luc siRNA）治疗对照组。在治疗后三周测定血清铁水平。组平均值+/-SD。包括相对于对照组（GN2-Luc）的未修正的Dunn氏检验在内的Kruskal-Wallis检验。siRNA缀合物的序列和修饰描述于图7中。结果示于图30中。P值：****P<.001；***P<0.005；**.01；*P<.05。
实施例29
在遗传性血色素沉着病的动物模型中通过不同剂量的GalNAc siRNAs降低铁传递蛋白饱和度。HFE-/-小鼠通过皮下施用用单剂的1或3 mg/kg GalNAc siRNA缀合物治疗。用PBS或用非靶向对照缀合物GN2-Luc siRNA1（GN2-Luc）治疗对照组。在治疗后三周测定血液样品中的％铁传递蛋白饱和度。具有SD的组平均值。包括相对于对照组（GN2-Luc）的未修正的Dunn氏检验在内的Kruskal-Wallis检验。siRNA缀合物的序列和修饰描述于图7中。结果示于图31中。P值：****P<.001；***P<0.005；**.01；*P<.05。
实施例30
在遗传性血色素沉着病的动物模型中未饱和铁结合力（UIBC）的增加。HFE-/-小鼠通过皮下施用用单剂的1或3 mg/kg GalNAc siRNA缀合物治疗。用PBS或用非靶向对照缀合物GN2-Luc siRNA1（GN2-LUC）治疗对照组。在治疗后三周收集血清样品用于测定UIBC。具有SD的组平均值。包括相对于对照组（GN2-Luc）的未修正的Dunn氏检验在内的Kruskal-Wallis检验。结果示于图32中。P值：****P<.001；***P<0.005；**.01；*P<.05。
实施例31
在遗传性血色素沉着病的动物模型中通过GalNAc siRNAs降低组织铁水平。HFE-/-小鼠通过皮下施用用单剂的1或3 mg/kg GalNAc siRNA缀合物治疗。用PBS或用非靶向对照缀合物GN2-Luc siRNA1（GN2-Luc）治疗对照组。在治疗后三周评估肾组织中的铁水平。箱线（Boxand Wiskers）（Tukey，中位数值）包括相对于对照组（GN2-Luc）的未修正的Dunn氏检验在内的Kruskal-Wallis检验。结果示于图33中。
实施例32
在Hep3B细胞中通过不同siRNAs降低TMPRSS6 mRNA表达。
将每孔8000个细胞平板接种在96-孔平板中。第二天，用20 nM siRNA和1μg/mlAtuFECT转染细胞。转染后两天，裂解细胞并通过q-RT-PCR测定TMPRSS6 mRNA水平。将TMPRSS6 mRNA水平相对于持家基因ApoB的表达水平归一化。针对萤光素酶的siRNAs用作非靶向对照。相对于未处理的细胞的一式三份的值的平均抑制和标准差显示在图34中。siRNAs的序列显示在下表14中。
表14
表14：实施例32中测试的针对TMPRSS6的siRNAs的序列。fU，fA，fC，fG-2'F修饰的脱氧核苷酸。mU，mA，mC，mG-2'O-甲基修饰的核苷酸。
实施例33
在Hep3B细胞中针对TMPRSS6的siRNAs的剂量反应。
将每孔8000个细胞平板接种在96-孔平板中。第二天，用指示的浓度（100 nM-0.03nM）的siRNA和1μg/ml AtuFECT转染细胞。转染后两天，裂解细胞并通过q-RT-PCR测定TMPRSS6 mRNA水平。将TMPRSS6 mRNA水平相对于持家基因ApoB的表达水平归一化。相对于用100 nM非靶向萤光素酶对照siRNA处理的细胞的一式三份的值的平均抑制和标准差显示在图35中。下表15显示了根据图35中所示的剂量-反应曲线的最大抑制、IC50和95％置信区间。
表15
表15：根据图35中所示的剂量反应的最大抑制、IC50和95％置信区间。
实施例34
在1°人肝细胞中通过受体介导的摄取抑制TMPRSS6 mRNA表达。
将原代人肝细胞平板接种在胶原包被的皿上，并与于如所示的300 nM至1 nM的浓度在细胞培养基中稀释的siRNA缀合物一起温育。在将细胞暴露于siRNA缀合物后24小时，提取总RNA并通过Taqman qRT-PCR定量TMPRSS6表达。将TMPRSS6 mRNA水平相对于肌动蛋白mRNA水平并相对于用非靶向对照siRNA缀合物GN2-Luc siRNA 1（GN2-Luc）处理的细胞的靶mRNA水平归一化。通过GalNAc-TMPRSS6 siRNA缀合物观察到TMPRSS6表达的剂量依赖性抑制。缀合物的序列和修饰描述于图7中。结果示于图36中。
实施例35
GalNAc TMPRSS6 siRNA在中间型·-地中海贫血的啮齿类动物模型中提高了血细胞比容值。
Hbbth3/+小鼠（Yang等人，1995，PNAS 第92卷，11608-11612）在第1天和第15天分别用3 mg/kg GN2-TMPRSS6-hcm9（GN2-TMP）、作为非靶向对照或作为载体对照的GN2-LucsiRNA 1（GN2-Luc）或PBS皮下治疗。在第36天，将全血收集到肝素包被的管中用于全血检查。Hbbth3/+小鼠获自Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）并保持在C57BL/6背景上。收集来自未治疗的野生型（WT）小鼠（C57BL/6）的血液样品并进行分析用于比较。散点斑点印迹（Scatter dot blot），平均值+/-SD；n = 3-6。统计学：具有Welch氏校正的未配对t检验。结果示于图37中。
实施例36
GalNAc TMPRSS6 siRNA在中间型b-地中海贫血的啮齿类动物模型中降低了红细胞分布宽度。
Hbbth3/+小鼠（Yang等人，1995，PNAS 第92卷，11608-11612）在第1天和第15天分别用3 mg/kg GN2-TMPRSS6-hcm9（GN2-TMP）、作为非靶向对照或作为载体对照的GN2-LucsiRNA1（GN2-Luc）或PBS皮下治疗。在第36天，将全血收集到肝素包被的管中用于全血检查。Hbbth3/+小鼠获自Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）并保持在C57BL/6背景上。收集来自未治疗的野生型（WT）小鼠（C57BL/6）的血液样品并进行分析用于比较。散点斑点印迹，平均值+/-SD；n = 3-6。统计学：具有Welch氏校正的未配对t检验。结果示于图38中。
实施例37
GalNAc TMPRSS6 siRNA在中间型··地中海贫血的啮齿类动物模型中降低了网织红细胞的比例。
Hbbth3/+小鼠（Yang等人，1995，PNAS 第92卷，11608-11612）在第1天和第15天分别用3 mg/kg GN2-TMPRSS6 hcm9（GN2-TMP）、作为非靶向对照或作为载体对照的GN2-LucsiRNA 1（GN2-Luc）或PBS皮下治疗。在第36天，将全血收集到肝素包被的管中用于全血检查。Hbbth3/+小鼠获自Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）并保持在C57BL/6背景上。收集来自未治疗的野生型（WT）小鼠（C57BL/6）的血液样品并进行分析用于比较。散点斑点印迹，平均值+/-SD；n = 3-6。统计学：具有Welch氏校正的未配对t检验。结果示于图39中。
实施例38
GalNAc TMPRSS6 siRNA在中间型·-地中海贫血的啮齿类动物模型中减少了活性氧类别（ROS）的量。Hbbth3/+小鼠（Th3/+；Yang等人，1995，PNAS 第92卷，11608-11612）在第1天和第15天用3 mg/kg GN2-TMPRSS6 hcm9（GN2-TMP）或作为非靶向对照的GN2-Luc 1 siRNA（GN2-Luc）皮下治疗。在第36天，将全血收集到肝素包被的管中用于全血检查。在添加2'7'二氯-荧光黄作为指示物后5分钟，进行ROS测量（Siwaponanan等人，2017 Blood，129，3087-3099）。测量来自GN2-TMPRSS6 hcm9治疗的小鼠的血液样品两次。Hbbth3/+小鼠（Th3/+）获自Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）并保持在C57BL/6背景上。收集来自未治疗的野生型（WT）小鼠（C57BL/6）的血液样品并进行分析用于比较。散点斑点印迹，平均值+/-SD；n = 4-6。统计学：具有Welch氏校正的未配对t检验。结果示于图40中。
实施例39
GalNAc TMPRSS6 siRNA在中间型·-地中海贫血的啮齿类动物模型中提高了血红蛋白水平。Hbbth3/+小鼠（Yang等人，1995，PNAS 第92卷，11608-11612）在第1天和第15天分别用3mg/kg GN2-TMPRSS6-hcm9（GN2-TMP）、作为非靶向对照或作为载体对照的GN2-Luc-siRNA 1（GN2-Luc）或PBS皮下治疗。在第36天，将全血收集到肝素包被的管中用于全血检查。Hbbth3/+小鼠获自Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）并保持在C57BL/6背景上。收集来自未治疗的野生型（wt）小鼠（C57BL/6）的血液样品并进行分析用于比较。散点斑点印迹，平均值+/-SD；n = 5-7。统计学：对于多重比较未校正的Welch氏t-检验。结果示于图41中。siRNA缀合物描述于图7中。
实施例40
GalNAc TMPRSS6在中间型·-地中海贫血的啮齿类动物模型中降低了脾大。Hbbth3/+小鼠（Yang等人，1995，PNAS 第92卷，11608-11612）在第1天和第15天分别用3 mg/kg GN2-TMPRSS6-hcm9（GN2-TMP）、作为非靶向对照或作为载体对照的GN2-Luc-siRNA 1（GN2-Luc）或PBS皮下治疗。在第39天，评估脾重量。Hbbth3/+小鼠获自Jackson Laboratory（BarHarbor，ME）并保持在C57BL/6背景上。评估来自用PBS治疗的野生型（wt）小鼠（C57BL/6）的脾重量用于比较。散点斑点印迹，平均值+/-SD；n = 5-7。统计学：对于多重比较未校正的Welch氏t-检验。结果示于图42中。siRNA缀合物描述于图7中。
实施例41
GalNAc TMPRSS6改善了骨髓中的红细胞成熟。Hbbth3/+小鼠（Yang等人，1995，PNAS 第92卷，11608-11612）在第1天和第15天用3 mg/kg GN2-TMPRSS6-hcm9（GN2-TMP）、作为非靶向对照或作为载体对照的GN2-Luc-siRNA 1（GN2-Luc）或PBS皮下治疗，在第39天从骨髓收集细胞并通过FACS分析进行分析。基于CD71、Ter119和CD44染色将活的类红细胞分离成不同的群体。Hbbth3/+小鼠获自Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）并保持在C57BL/6背景上。评估来自用PBS治疗的野生型（wt）小鼠（C57BL/6）的骨髓的类红细胞用于比较。条形图，平均值+/-SD；n = 5-7。统计学：对于多重比较未校正的Welch氏t-检验。结果示于图43中。siRNA缀合物描述于图7中。
实施例42
GalNAc TMPRSS6 减少了脾中无效的红细胞生成。Hbbth3/+小鼠（Yang等人，1995，PNAS第92卷，11608-11612）在第1天和第15天分别用3 mg/kg GN2-TMPRSS6 hcm9（GN2-TMP）、作为非靶向对照或作为载体对照的GN2-Luc siRNA 1（GN2-Luc）或PBS皮下治疗。在第39天，从脾收集细胞并通过FACS分析进行分析。基于CD71、Ter119和CD44染色将活的类红细胞分离成不同的群体。Hbbth3/+小鼠获自Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）并保持在C57BL/6背景上。评估来自用PBS治疗的野生型（wt）小鼠（C57BL/6）的类红细胞用于比较。条形图，平均值+/-SD；n = 5-7。统计学：对于多重比较未校正的Welch氏t-检验。结果示于图44中。siRNA缀合物描述于图7中。
实施例43
通过GalNAc siRNA缀合物降低人肝细胞中的TMPRSS6表达。
将30,000 cpw人原代肝细胞接种在胶原包被的96-孔平板中。在平板接种后立即用指示量的siRNA缀合物处理细胞。处理后24小时裂解细胞，并通过TaqMan qRT-PCR分析TMPRSS6 mRNA表达。显示了相对于ApoB（持家）且相对于未处理细胞的平均值归一化的TMPRSS6的一式三份的值。
结果显示在图45a、45b和图46中，且序列显示在图47中。所描述的GN3接头示于图8C中。
实施例44
在末端位置和GalNAc部分中具有硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和磷酸二酯的GalNAc-siRNA缀合物的血清稳定性测定。将GalNAc与有义链的5'-端缀合，并通过四个PS内部稳定化（STS12009L4）或不这样，然后代之以使用磷酸二酯键（STS12009V54L50-V57L50）。将二硫代磷酸酯修饰置于除了第一链5'-端外的双链体的所有末端位置（-V54L50）、仅3'-端（-V55L50、-V57L50）或仅第二链的3'-端（-V56L50）。在某些设计中，磷酸二酯用于siRNA双链体的末端位置（-V56L50、-V57L50）。将5μM GalNAc-siRNA缀合物与50％FBS于37℃温育3天。提取RNA并在20％TBE聚丙烯酰胺凝胶上分析。“UT”表示未处理的样品，“FBS”表示FBS处理。“对照”表示较低稳定化的不同序列的GalNAc-siRNA缀合物。
在原代小鼠肝细胞中通过受体介导的摄取测试了含有不同末端稳定化学（硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯）的靶向TMPRSS6的siRNA的GalNAc缀合物。将GalNAc与第二链的5'-端缀合，并通过四个PS内部稳定化（STS12009L4）或不这样，然后代之以使用磷酸二酯键（STS12009V54L50-V57L50）。将二硫代磷酸酯修饰置于除了第一链5'-端外的双链体的所有末端位置（-V54L50）、仅3'-端（-V55L50、-V57L50）或仅第二链的3'-端（-V56L50）。在某些设计中，磷酸二酯用于siRNA双链体的末端位置（-V56L50、-V57L50）。该实验在小鼠原代肝细胞中进行。将细胞以每96-孔20,000个细胞的密度接种，并用125 nM至0.2 nM GalNAc-siRNA处理。24小时后裂解细胞，提取总RNA并通过Taqman qRT-PCR测定TMPRSS6和PTENmRNA水平。每个条代表三次技术重复的平均值±SD。
结果和相关序列显示在图48-50中。
实施例45
通过在第一链的5'位置具有置换2'-O-甲基腺嘌呤的2'-O-甲基-尿苷或5'-(E)-乙烯基膦酸酯-2'-O-甲基-尿苷的GalNAc siRNA缀合物在原代鼠肝细胞中降低TMPRSS6表达。
将小鼠原代肝细胞以每孔30,000个细胞的细胞密度接种到胶原预包被的96孔平板（Thermo Fisher Scientific，＃A1142803）中，并用浓度从100 nM到0.1 nM不等的siRNA-缀合物处理。处理后24小时，裂解细胞，并根据制造商的规程用InviTrap® RNACell HTS 96 Kit / C24 x 96 preps（Stratec＃7061300400）提取RNA。通过TaqMan分析定量TMPRSS6和持家mRNA（Ptenll）的转录物水平。
siRNA缀合物：
图例：
mN 2'-O-甲基核糖核苷酸（例如mU-2'-O-甲基尿嘧啶）
fN 2'-氟核糖核苷酸（例如fC-2'-氟胞苷）
（ps）硫代磷酸酯
乙烯基膦酸酯 乙烯基-(E)-膦酸酯
GN2 根据图8B的结构
TaqMan引物和探针
图例：
FAM - 6-羧基荧光素（荧光染料）
TAMRA - 四甲基罗丹明（猝灭剂）
BHQ1 - 黑洞（black hole）淬灭剂1（猝灭剂）
体外剂量反应
在所示浓度用在反义链的5'-位置携带乙烯基-(E)-膦酸酯2'OMe-尿嘧啶且在前三个核苷酸之间携带两个硫代磷酸酯键（STS12209V4L4）、在反义链的5'-位置携带乙烯基-(E)-膦酸酯2'OMe-尿嘧啶且在前三个核苷酸之间携带磷酸二酯键（STS12209V5L4）、在5'-位置的前三个核苷酸之间携带2'-O-甲基尿嘧啶和两个硫代磷酸酯键（STS12209L4）或在5'-位置的前三个核苷酸之间携带2'-O-甲基尿嘧啶和两个磷酸二酯键（STS12209V1L4）的TMPRSS6-siRNA或）或作为参考的（STS12009L4）或非靶向GalNAc-siRNA（STS18001）治疗或未经治疗（UT）后24小时原代鼠肝细胞中的靶基因表达。
结果示于图51中。
血清稳定性
于37℃在50％FCS中温育4小时（4h）或3天（3d）或未处理（0h）的siRNA缀合物的血清稳定性。通过酚/氯仿/异戊醇提取提取接下来的RNA。通过TBE-聚丙烯酰胺凝胶电泳和用SybrGold染色RNA显示降解。
结果显示在图52中：siRNA-缀合物与对于核酸酶降解的较不稳定的阳性对照比较的血清稳定性。
在RNA序列内教导具体接头和或修饰的键的场合，例如PS、PS2、GN、GN2、GN3等，这些是序列的选择部分，但是该序列的优选实施方案。
可以使用以下缩写：

Claims (16)

1.用于抑制TMPRSS6表达的核酸，其包含至少一个双链体区，所述双链体区包含第一链的至少部分和第二链的至少部分，所述第二链至少部分地与所述第一链互补，其中所述第一链至少部分地与由TMPRSS6基因转录的RNA的至少部分互补，其中所述核酸包含下面的第一链：
任选地其中所述核酸进一步包含下面的第二链：
。
2.根据任何前述权利要求的核酸，其中所述第一和/或第二链上的一个或多个核苷酸被修饰，以形成修饰的核苷酸。
3.权利要求2的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO: 17的核苷酸序列，且其中所述第二链包含SEQ ID NO: 18的核苷酸序列
其中，具体修饰由下面的数字描述
1=2´F-dU,
2=2´F-dA,
3=2´F-dC,
4=2´F-dG,
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG。
4.缀合至配体的根据任何前述权利要求的核酸，任选地在所述第二链的5'端。
5.根据权利要求4的核酸，其中所述配体包含（i）一种或多种N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）部分及其衍生物，和（ii）接头，其中所述接头将所述GalNAc部分与所述核酸缀合。
6.根据权利要求4或5的核酸，其中所述接头是二价或三价或四价分支结构。
7.根据权利要求4-6中任一项的缀合的核酸，其具有结构：
其中Z是根据权利要求1至40中任一项的核酸。
8.根据权利要求1-6中任一项的核酸或根据权利要求7的缀合的核酸，其中所述核酸在任一条或两条链的5'和/或3'端稳定化。
9.根据权利要求8的核酸，其在所述第一和/或第二链的末端一个、两个或三个3'核苷酸和/或5'核苷酸之间包含硫代磷酸酯键，或包含二硫代磷酸酯键。
10.根据权利要求9的核酸，其在所述第一链上的三个末端3'的每一个之间和三个末端5'核苷酸的每一个之间包含两个硫代磷酸酯键，并且在所述第二链的3'端的三个末端核苷酸之间包含两个硫代磷酸酯键，具有结构
。
11.包含任何前述权利要求的核酸或缀合的核酸和生理学上可接受的赋形剂的组合物。
12.根据任何前述权利要求的核酸或缀合的核酸或组合物，其用于治疗疾病或病症。
13.根据任何前述权利要求的核酸或缀合的核酸或组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。
14.一种治疗疾病或病症的方法，包括向需要治疗的个体施用根据任一前述权利要求的核酸或包含核酸或缀合的核酸的组合物。
15.根据权利要求13-14中任一项的用途或方法，或根据权利要求3的用于使用的核酸，其中所述疾病或病症选自血色素沉着病、生血性卟啉症、输血性铁超负荷和血液病症。
16.根据权利要求12的用于使用的核酸，根据权利要求13或15的用途，或根据权利要求14或15的方法，其中所述核酸用于以下一种或多种或全部：
（i）贫血的治疗，任选地通过血红蛋白的增加来适当确定的；和/或
（ii）脾大的改善，任选地通过脾大小或重量的减少来确定的：和/或
（iii）脾中的应激红细胞生成的降低，任选如本文所述的通过由FACS分析测定的成红血细胞和去核的类红细胞的比例来确定的；和/或
（iv）骨髓中红细胞成熟/红细胞生成的改善，任选通过由FACS分析测定的成红血细胞和去核的类红细胞的比例来确定的。
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