CN110568055A - 通过质谱法表征靶蛋白 - Google Patents

通过质谱法表征靶蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN110568055A
CN110568055A CN201910486299.9A CN201910486299A CN110568055A CN 110568055 A CN110568055 A CN 110568055A CN 201910486299 A CN201910486299 A CN 201910486299A CN 110568055 A CN110568055 A CN 110568055A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
proteins
mass spectrum
mass
target protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910486299.9A
Other languages
English (en)
Inventor
德特勒夫·祖考
阿尼亚·拉塞曼
瓦尔特劳德·埃弗斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Brooke Dalton Ltd And Lianghe Co
Original Assignee
Brook Dalton Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Brook Dalton Co Ltd filed Critical Brook Dalton Co Ltd
Publication of CN110568055A publication Critical patent/CN110568055A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/0027—Methods for using particle spectrometers
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/0027—Methods for using particle spectrometers
    • H01J49/0036—Step by step routines describing the handling of the data generated during a measurement
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/26—Mass spectrometers or separator tubes
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/26—Mass spectrometers or separator tubes
    • H01J49/34—Dynamic spectrometers
    • H01J49/40—Time-of-flight spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/38—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of carbohydrates, e.g. glycosylation, glycation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/10—Ion sources; Ion guns
    • H01J49/16—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission
    • H01J49/161—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission using photoionisation, e.g. by laser
    • H01J49/164—Laser desorption/ionisation, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了表征靶蛋白的方法，其中获取靶蛋白的消化肽质谱并与已测定的参考蛋白或参考宿主细胞的蛋白质的消化肽质谱进行比较。该比较包括确定质谱和参考质谱的强度图案的相似性得分。该表征包括将靶蛋白与参考蛋白进行匹配，该参考蛋白的参考质谱的相似性得分高于预定阈值。本发明的具体优点在于：考虑了以下情况：对于两个高度相似的参考蛋白的谱图，即使利用相同的消化肽进行消化，由于两者的消化肽的相对强度不同，两者的强度图案也可能不同。

Description

通过质谱法表征靶蛋白
技术领域
本申请涉及蛋白鉴定领域，更具体而言涉及通过质谱法表征靶蛋白的方法。
背景技术
通过蛋白质消化产物的肽质量指纹图谱(PMF)进行蛋白质的常规鉴定已有25年历史。1993年，五组科学工作团队各自发表了该方法的基本要素：(1)Henzel,W.J.,Billeci,T.M.,Stults,J.T.,Wong,S.C.,Grimley,C.和Watanabe,C.(1993).Proc Natl Acad SciUSA 90,5011-5；(2)James,P.,Quadroni,M.,Carafoli,E.和Gonnet,G.(1993).BiochemBiophys Res Commun 195,58-64；(3)Mann,M.,Hojrup,P.和Roepstorff,P.(1993).BiolMass Spectrom 22,338-45；(4)Pappin,D.J.C.,Hojrup,P.和Bleasby,A.J.(1993).Curr.Biol.3,327-32；和(5)Yates,J.R.,3rd,Speicher,S.,Griffin,P.R.和Hunkapiller,T.(1993).Anal Biochem 214,397-408。
该方法取得了巨大成功并被广泛使用。W.J.,Henzel,C.Watanabe和J.T.Stults给出了题为“蛋白质鉴定：肽质量指纹图谱的起源”(“Protein Identification:The Originsof Peptide Mass Fingerprinting”)的详细历史性综述(J Am Soc Mass Spectrom.2003,14,931-942)。
在2004年的ASMS教程中，John Cottrell教导了：“肽质量指纹图谱只能用于纯蛋白质或非常简单的混合物。用具有高特异性的酶消化蛋白质；通常为胰蛋白酶，但任意的特异性的酶均可使用。通过质谱分析肽的混合产物。这会产生分子质量值的集合，可利用搜索引擎在蛋白质序列数据库中检索这些值。对于蛋白质数据库中的各项目，搜索引擎会模拟已知的酶切割特异性，计算预期的肽的质量，并将计算得到的质量值的该集合和实验质量值的集合进行比较。将某种评分用于鉴定可提供最佳匹配的数据库中的项目，同时生成报告。”
因此，肽质量指纹图谱仅利用了肽的质量。强度通常不起作用，因为强度几乎不能通过计算机的虚拟切割程序计算。John Cottrell：“在肽质量指纹图谱中，峰的质量值是最重要的。峰面积或强度值是肽碱度、长度和一些其他物理及化学参数的函数。没有特殊理由可假设大的峰是需要关注的而小的峰是不需要关注的......质量的准确度很重要，但覆盖率同样重要。大量质量值具有中等准确度比一个或两个质量值具有极高准确度要更好。
网络上可得到的肽质量指纹图谱程序有六个以上，且文献中描述了更多种。
与仅使用质量值相比，K.C.Parker提出尝试考虑计算出的峰强度：“MALDI肽质量指纹图谱中的评分方法：ChemScore和ChemApplex程序”(“Scoring methods in MALDIPeptide Mass Fingerprinting:ChemScore,and the ChemApplex Program”，J Am SocMass Spectrom 2002,13,22-39)。作者描述了一个基于计算出的参数(结合蛋白质评分)的软件程序(ChemApplex)，该程序将(1)峰强度、(2)匹配的质量准确度和(3)理论强度因子ChemScore考虑在内，所述理论强度因子基于化学因素(特别是肽的氨基酸组成以及跨越切割位点的氨基酸的氨基酸序列)的组合，从而估计观察到特定的肽的概率。
出版物US 2007/0092926 A1(M.A.Alterman和B.A.Kornilayev；2007)描述了将“独特的蛋白水解肽”应用于肽质量指纹图谱。术语“特殊的蛋白水解肽”(distinctiveproteolytic peptide)或“独特的蛋白水解肽”(unique proteolytic peptide)包括由通过蛋白酶蛋白水解切割蛋白质形成的肽键连接的氨基酸亚基组成的化合物，其不同于任何其他源于利用相同蛋白酶的其他蛋白质消化生成的蛋白水解肽。当参考SwissProt或NCBI数据库时，特殊性(distinctiveness)或独特性(uniqueness)优选涉及整个基因组，并且最优选涉及人类基因组。可以通过预测蛋白酶的切割位点来确定肽的边界。
如出版物US 2005/0153380 A1(N.P.Everett等人,2005)所述的靶蛋白的定性和定量分析基于“特征肽”，用于同样的目的。从混合物中提取并浓缩靶蛋白。浓缩的合适方法的实例包括使用固相支持树脂(例如，离子交换剂、亲和凝胶和其他吸附蛋白质的树脂)。术语“特征肽质量”是指由一种或多种特定蛋白质靶标生成的肽质量，其可用来鉴定蛋白质靶标。来源于指定肽质量指纹图谱的容易电离且质量分辨率和准确度高的肽质量被认为是指定靶标的特征诊断性肽质量的集合的成员。对于各蛋白质，图案是独特的，因此是特殊的。
考虑到生物药剂的开发(例如，克隆选择)和生产(例如，Fill&Finish操作中的快速鉴定试验)需要在短的返回时间内进行快速且可靠性高的分析，以加速决策制定并降低成本。在生物药剂的生产过程中可能出现几种具有较高相似度的产物分子从而增加复杂性。例如，不能够基于从常用的肽质量指纹图谱中获取的序列覆盖对同类别的不同治疗性抗体(例如，IgG1κ)进行可靠的区分，并且目前需要LC-MS或专用ELISAs以实现特异性识别。将描述一种可特异性应用于高度相关分子(单克隆抗体，如赫塞汀或阿达木单抗)的集合的快速且可靠的方法。
发明内容
第一方面，本发明提供了一种表征靶蛋白的方法，包括以下步骤：提供参考蛋白的已测定的参考质谱的文库，其中对于一个参考蛋白的酶消化产物，获取各参考质谱，并且对于所有参考蛋白，酶消化条件大致相同；在用于参考蛋白的相同条件下，对靶蛋白进行酶消化；获取酶消化后的靶蛋白的质谱；确定该质谱和参考质谱的强度图案的相似性得分；以及通过将靶蛋白与参考蛋白进行匹配来表征靶蛋白，该参考蛋白的参考质谱的相似性得分高于预定阈值。靶蛋白通常是来自待表征样品的蛋白质。
本方法比较了测得的质谱的质量位点和强度与文库中已测定的参考蛋白的参考质谱的质量位点和强度的相似性。本方法的一个具体优点在于：考虑了以下情况：对于两个高度相似的参考蛋白的谱图，即使利用相同的消化肽进行消化，由于两者的消化肽的相对强度不同，两者的强度图案也可能不同。优选通过余弦相似性度量或互相关来确定相似性得分。
酶消化优选使用胰蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶(IdeS)和Lys-C中的至少一种。在酶消化之前，通过还原剂并通过变性剂对靶蛋白和参考蛋白进行相同的变性。变性和酶消化可在30分钟之内进行，甚至可以短于15分钟。优选地，使用具有三氟乙醇(TFE)的二硫苏糖醇(DTT)作为变性溶液。
优选通过MALDI-TOF质谱仪获取消化后的靶蛋白的质谱和参考质谱。更优选地，MALDI-TOF质谱仪包括反射器。MALDI-TOF质谱仪可为覆盖区小于一平方米且高度小于1.5米的台式仪器。
在一个优选实施方案中，参考蛋白具有不同的氨基酸序列，并且参考蛋白的酶消化产物包含具有相应的参考蛋白的特征质量的消化肽。通过与参考蛋白之一进行匹配来鉴定靶蛋白。例如，可以通过亲和捕获从复杂的样品混合物中提取靶蛋白。复杂的混合物可以是尿液、血浆、血清、脊髓液和裂解后的组织细胞之一。优选地，利用抗体进行亲和捕获。
在另一个实施方案中，靶蛋白是生物药剂，特别是来自产品的生物药剂。在这种情况下，参考蛋白是靶生物药剂的不同的蛋白质异构体，它们通过选择性剪接、序列变异、转录后修饰和应力诱导的修饰中的至少一种而形成。通过与参考蛋白之一进行匹配从而将靶蛋白鉴定为异构体之一。转录后修饰可以是糖基化、氧化、乙酰化和酰胺化中的至少一种。
在另一个实施方案中，靶蛋白是抗体，特别是来自产品的抗体。在这种情况下，参考蛋白是抗体的不同的修饰体。将靶蛋白和参考蛋白通过酶消化成为结构域，并且通过与参考蛋白之一进行匹配从而将靶蛋白鉴定为经修饰的。修饰可以是糖基化、氧化、乙酰化和酰胺化中的至少一种。优选地，利用IdeS制备Fc/2抗体结构域，用于聚糖谱分析(glycoprofiling)。参考蛋白可以为所需抗体，并且通过与该参考蛋白进行匹配从而将靶蛋白鉴定为所需抗体。
优选地，本方法进一步包括移除存在于大部分已测定的参考质谱中的冗余质量信号，并且在确定步骤中提供和/或使用缩减的参考质谱。缩减集合优选包括大约三到十五个质量信号。如果参考蛋白具有不同的氨基酸序列，则缩减的参考质谱优选仅包括作为相应的参考蛋白的特征的消化肽的质量信号。缩减的参考质谱可另外包括一些冗余质量信号，这些冗余质量信号存在于基本上所有或很多缩减的参考质谱中，并且这些冗余质量信号的数量少于特征质量信号的数量。多变量统计方法被用于确定文库的已测定的参考质谱的冗余质量信号。多变量统计方法优选为主成分分析(PCA)、层次聚类(HC)、受试者工作特性曲线(ROC)和概率潜在语义分析(pLSA)之一。
第二方面，本发明提供了表征靶宿主细胞的蛋白质的方法，包括以下步骤：提供参考宿主细胞蛋白质的已测定的参考质谱的文库，其中各参考质谱包括消化肽的质量信号，所述消化肽通过一种参考宿主细胞的蛋白质的酶消化而产生，并且在酶消化之后，通过使用多种亲和剂进行亲和捕获来提取消化肽；在参考宿主细胞的蛋白质所使用的相同条件下，对靶宿主细胞的蛋白质进行酶消化，然后通过使用多种亲和剂进行亲和捕获来提取消化肽；获取所提取的靶宿主细胞的消化肽的质谱；确定该质谱和参考质谱的强度图案的相似性得分；以及通过将靶宿主细胞的蛋白质与某种参考宿主细胞进行匹配表征靶宿主细胞，该参考宿主细胞的参考图谱的相似性得分高于预定阈值。
本方法比较了测得的质谱的质量位点和强度与文库中已测定的参考质谱的质量位点和强度的相似性。这种方法的一个具体优点在于：考虑了以下情况：两个高度相似的参考质谱的谱图可能包括在相同质量位点处的质量信号，但强度图案不同，这主要是由于消化肽不同的相对强度所致。优选通过余弦相似性度量或者互相关来确定相似性得分。
附图说明
图1示出了根据本发明表征靶蛋白的方法的示意性工作流程。
图2示出了靶蛋白的快速变性和消化的优选工作流程。
具体实施方式
本发明提供了通过肽混合物的肽质量指纹图谱(PMF)来鉴定靶蛋白的优选方法，特别是用于质量保证以确认特征的方法，其中由诸如胰蛋白酶之类的蛋白酶进行靶蛋白的酶消化而生成肽混合物。与常用的肽质量指纹图谱完全不同，该鉴定将基于测得的靶蛋白的强度图案和已测定的参考蛋白的强度图案的相似性。
鉴于已知的肽质量指纹图谱依赖于实质上从文库中发现的氨基酸序列计算得到的肽质量，新方法比较了测得的质谱的质量和强度与文库中参考蛋白的已测定的参考质谱的质量和强度的相似性。这种方式的具体优点在于：考虑了以下情况：即使两个高度相似的参考蛋白的相同消化肽可能显示在两个相应的参考质谱中，但由于切割位点附近不同的物理化学微环境，会产生在其相对强度方面十分不同的质量信号。
可以使用任意合适的程序来确定靶蛋白的质谱和构成文库的参考蛋白的参考质谱之间的强度图案的相似性。作为实例，可以通过构成强度图案形成的矢量间的夹角的余弦(余弦相似性得分)或通过互相关来快速确定强度图案的相似性。
参考蛋白的参考谱图优选缩减至具有强度的特征质量信号的较小集合(子集谱图)，这使得匹配具有更好的特异性。缩减集合优选包括大约三到十五种肽。存在不同的方法可用于生成此类子集谱图。这些方法包括谱图分类的典型统计方法，如以主成分分析(PCA)、层次聚类(HC)、受试者工作特性曲线(ROC)来命名的这些方法。如果参考蛋白是抗体，那么能从互补决定区(CDRs)确定特征消化肽。如果通过添加其他参考质谱对文库进行扩增，那么必须重复进行特定质量信号的选择。任选地，可以添加一些冗余肽质量信号用于质量控制。
本方法优选用快速蛋白变性和消化方法进行，通常在30分钟之内，尤其是15分钟之内。用基质溶液制备所得的肽混合物，从而在质谱样品载物台上产生样品点，以用于基质辅助激光解吸电离(MALDI)-飞行时间质谱仪。可利用价格合理的台式飞行时间质谱仪进行谱图采集。
基于参考蛋白消化肽的参考质谱中相对强度图案的差异，本发明的方法尤其能够用于抗体生产的质量控制，或药剂开发期间的克隆选择工作流程，例如，用于筛选完整的Fc-结构域中的聚糖谱或用于克隆体适当地携带靶序列。对于抗体的表征，该技术方案、特别是基于胰蛋白酶/Lys-C消化的技术方案能够用于在15分钟内从提供抗体到自动鉴定获得结果。
利用还原剂和变性剂(如二硫苏糖醇和三氟乙醇)的混合物可使靶蛋白和参考蛋白快速变性，并且通过诸如胰蛋白酶之类的酶蛋白或者连续或平行的双重消化(例如，胰蛋白酶/Lys-C)进行快速消化。可以使用基质辅助激光解吸电离(MALDI)用基质物质来制备肽混合物。HCCA(α-氰基-4-羟基苯丙烯酸)可用作基质物质。
然而，本方法也可以应用于存在于复杂物质混合物中的靶蛋白。在这种情况下，必须提取并纯化靶蛋白。例如，为了避免诸如HPLC之类的耗时的方法，必须应用快速纯化法。实例为固相萃取、柱亲和捕获法或磁珠亲和捕获法等等。
快速蛋白质鉴定检测实施方案的实例：将包括变性、还原和蛋白水解消化在内的消化时间缩减为15分钟，随后的MALDI样品制备包括简单准确的(on-target)纯化步骤。从所有经检测的抗体消化产物得到的MALDI肽质量指纹图谱的质量高(70％序列覆盖率)，并且能够用于实质上仅基于肽差异的鉴定试验，所述肽即衍生于抗体的～120个残基的可变N端的肽；除六种常见的肽外，还有4至13种肽用于这些谱图。这些抗体的谱图使得能够基于余弦相似性得分(CSS)对其进行区分，CSS>0.9作为接受标准，特异性不匹配会使CCS值为0.2至0.6。此外，由软件提供的ID可以通过蝶形图进行直观的确认。
用于克隆选择的具体步骤的实例：IdeS消化的消化及样品制备时间和MALDI样品制备为约30分钟。通过对单克隆抗体的Fc-结构域和合适状态的Fc C端一起进行直接分析来分析主要的聚糖，如G0F、G1F、G2F和G3F。10秒/样品内完成谱图采集和处理。软件中记录了不同的属性，如聚糖谱图与具有确定评分的参考谱图的匹配，或者以G0F作为基峰聚糖的测试。在克隆选择工作流程中样品处理的自动化和平行化使得能够以基于主要Fc-聚糖的高度自动化且显著加速克隆选择的方式每天评估数百个样品。
本发明进一步提供了用于表征靶宿主细胞的蛋白质的优选方法。在这里，在胰蛋白酶消化后，抗多肽抗体被用来提取靶宿主细胞的蛋白质的消化肽。通常，在消化之后可以额外添加稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)，从而可以随抗多肽抗体共同提取SIS肽和由胰蛋白酶消化所得的天然肽。目前可以在分析中共同使用多种抗体(多克隆抗体或单克隆抗体库)和SIS肽，从而提取5种、10种或者更多种对宿主细胞蛋白(HCP)分析具有特异性的肽。目前，可以用与各宿主细胞蛋白质相关水平的SIS肽质量信号和强度来定义谱图。然后，可以基于天然肽/SIS肽的峰强度比例和来自自动检测的靶HPC水平的偏差来确定并准确地量化天然肽的强度。

Claims (15)

1.一种表征靶蛋白的方法，包括以下步骤：
提供参考蛋白的已测定的参考质谱的文库，其中对于一个参考蛋白的酶消化产物，获取各参考质谱，并且对于所有参考蛋白，所述酶消化的条件大致相同；
在用于所述参考蛋白的相同条件下，对所述靶蛋白进行酶消化；
获取酶消化后的靶蛋白的质谱；
确定该质谱和所述参考质谱的强度图案的相似性得分；以及
通过将所述靶蛋白与参考蛋白进行匹配来表征所述靶蛋白，该参考蛋白的参考质谱的相似性得分高于预定阈值。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶消化使用胰蛋白酶、IdeS和Lys-C中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在所述酶消化之前，通过还原剂并通过变性剂对所述靶蛋白和所述参考蛋白进行相同的变性。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述参考蛋白具有不同的氨基酸序列，所述参考蛋白的酶消化产物包含各自具有相应的参考蛋白的特征质量的消化肽，并且通过与所述参考蛋白之一进行匹配来鉴定所述靶蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其中通过亲和捕获从复杂的样品混合物中提取所述靶蛋白。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶蛋白是生物药剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述参考蛋白为所述生物药剂的不同的蛋白质异构体，通过选择性剪接、序列变异、转录后修饰和应力诱导的修饰中的至少一种来形成所述异构体，并且通过与所述参考蛋白之一进行匹配从而将所述靶蛋白鉴定为所述异构体之一。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶蛋白是抗体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述参考蛋白是所述抗体的不同的修饰体，将所述靶蛋白和所述参考蛋白通过酶消化成为结构域，并且通过与所述参考蛋白之一进行匹配从而将所述靶蛋白鉴定为经修饰的。
10.根据权利要求9所述的方法，其中一种参考蛋白是所述抗体，并且通过与该参考蛋白进行匹配从而将所述靶蛋白鉴定为所述抗体。
11.根据权利要求1所述的方法，其中移除存在于大部分已测定的参考质谱中的冗余质量信号，并且在所述确定步骤中提供和/或使用缩减的参考质谱。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述参考蛋白具有不同的氨基酸序列，所述参考蛋白的酶消化产物包含具有相应的参考蛋白的特征质量的消化肽，并且所述缩减的参考质谱仅包括特征质量信号。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述缩减的参考质谱另外包括一些冗余质量信号，所述冗余质量信号基本上存在于所有缩减的参考质谱中，并且所述冗余质量信号的数量少于所述特征质量信号的数量。
14.根据权利要求1所述的方法，其中通过余弦相似性度量或互相关来确定相似性得分。
15.一种表征靶宿主细胞的蛋白质的方法，包括以下步骤：
提供参考宿主细胞的蛋白质的已测定的参考质谱的文库，其中各参考质谱包括消化肽的质量信号，所述消化肽通过一种类型的参考宿主细胞的多种蛋白质的酶消化而生成，并且在所述酶消化之后，通过使用多种亲和剂进行亲和捕获来提取所述消化肽；
在所述参考宿主细胞的蛋白质所使用的相同条件下，对所述靶宿主细胞的蛋白质进行酶消化，然后通过使用所述多种亲和剂进行亲和捕获来提取所述消化肽；
获取所提取的所述靶宿主细胞的消化肽的质谱；
确定该质谱和所述参考质谱的强度图案的相似性得分；以及
通过将所述靶宿主细胞的蛋白质与某种类型的参考宿主细胞进行匹配来表征所述靶宿主细胞，该参考宿主细胞的参考图谱的相似性得分高于预定阈值。
CN201910486299.9A 2018-06-06 2019-06-05 通过质谱法表征靶蛋白 Pending CN110568055A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862681411P 2018-06-06 2018-06-06
US62/681,411 2018-06-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110568055A true CN110568055A (zh) 2019-12-13

Family

ID=66690714

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910486299.9A Pending CN110568055A (zh) 2018-06-06 2019-06-05 通过质谱法表征靶蛋白

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10877044B2 (zh)
CN (1) CN110568055A (zh)
DE (1) DE102019115108B4 (zh)
GB (3) GB2607197B (zh)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020028005A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-07 Anderson Norman G. Reference database
CN1344370A (zh) * 1999-03-23 2002-04-10 拜奥维森有限公司 蛋白质的分离和分析
US20020102610A1 (en) * 2000-09-08 2002-08-01 Townsend Robert Reid Automated identification of peptides
US20030059095A1 (en) * 2000-09-01 2003-03-27 Anderson Norman G. Reference database
US20070148720A1 (en) * 2003-12-19 2007-06-28 Hiroaki Torii Method of identifying protein with the use of mass spectometry
US20080044857A1 (en) * 2004-05-25 2008-02-21 The Gov Of Usa As Represented By The Secretary Of Methods For Making And Using Mass Tag Standards For Quantitative Proteomics
CN101871945A (zh) * 2010-06-13 2010-10-27 中国科学院计算技术研究所 谱库的生成方法和串联质谱谱图鉴定方法
CN103177198A (zh) * 2011-12-26 2013-06-26 深圳华大基因科技有限公司 一种蛋白质鉴定方法
US20150066380A1 (en) * 2013-08-30 2015-03-05 Shimadzu Corporation Mass spectrometoric data analyzing apparatus and analyzing method
CN107727727A (zh) * 2017-11-13 2018-02-23 复旦大学 一种蛋白质鉴定方法及系统

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002338614A1 (en) 2001-04-17 2002-10-28 Femtolink Biotechnologies Llc Methods for mass spectrometry detection and quantification of specific target proteins in complex biological samples
JP2005532565A (ja) * 2002-07-10 2005-10-27 アンスティテュ スイス ドゥ ブオインフォルマティク ペプチド及びタンパク質の同定方法
JP5011283B2 (ja) * 2005-06-03 2012-08-29 ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン 化学分析のためのポリペプチド関連情報のカタログの発生および使用
US20060287834A1 (en) * 2005-06-16 2006-12-21 Kearney Paul E Virtual mass spectrometry
US20070092926A1 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Alterman Michail A Analysis of protein isoforms using unique tryptic peptides by mass spectrometry and immunochemistry
ATE529752T1 (de) * 2006-12-21 2011-11-15 Novartis Ag Antikörperquantifizierung
WO2010109022A1 (en) * 2009-03-27 2010-09-30 Universitetet I Oslo Quantitative proteomics method
PT3023777T (pt) * 2013-09-09 2018-01-19 Shimadzu Corp Método para preparar fragmentos peptídicos, kit para preparar fragmentos peptídicos para serem utilizados neste, e método de análise
AU2018327347A1 (en) * 2017-09-07 2020-03-19 Adeptrix Corp. Multiplexed bead arrays for proteomics
CN107827960B (zh) * 2017-10-26 2021-06-15 中国食品药品检定研究院 Hpv的l1蛋白的定量检测方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1344370A (zh) * 1999-03-23 2002-04-10 拜奥维森有限公司 蛋白质的分离和分析
US20020028005A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-07 Anderson Norman G. Reference database
US20030059095A1 (en) * 2000-09-01 2003-03-27 Anderson Norman G. Reference database
US20020102610A1 (en) * 2000-09-08 2002-08-01 Townsend Robert Reid Automated identification of peptides
US20070148720A1 (en) * 2003-12-19 2007-06-28 Hiroaki Torii Method of identifying protein with the use of mass spectometry
US20080044857A1 (en) * 2004-05-25 2008-02-21 The Gov Of Usa As Represented By The Secretary Of Methods For Making And Using Mass Tag Standards For Quantitative Proteomics
CN101871945A (zh) * 2010-06-13 2010-10-27 中国科学院计算技术研究所 谱库的生成方法和串联质谱谱图鉴定方法
CN103177198A (zh) * 2011-12-26 2013-06-26 深圳华大基因科技有限公司 一种蛋白质鉴定方法
US20150066380A1 (en) * 2013-08-30 2015-03-05 Shimadzu Corporation Mass spectrometoric data analyzing apparatus and analyzing method
CN107727727A (zh) * 2017-11-13 2018-02-23 复旦大学 一种蛋白质鉴定方法及系统

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
中国环境监测总站 编译: "《美国SW-846环境监测方法选编》", 31 August 2010 *
于长永: ""基于串联质谱的蛋白鉴定算法研究"", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *
王冲等: "MALDI-TOF MS技术在临床病原真菌鉴定中的应用进展", 《中国真菌学杂志》 *
蒋代凤等: "肝癌细胞线粒体蛋白的MALDI-TOF质谱鉴定方法研究", 《重庆医科大学学报》 *
谭贵良 赖心田主编: "《现代分子生物学及组学技术在食品安全检测中的应用》", 30 June 2014 *
邵晨 等: ""蛋白质数据库对蛋白质组鉴定的影响"", 《中国生物医学工程学报》 *
黄迎波等: "MALDI-TOF-MS鉴定水稻细菌性叶鞘褐腐病菌的方法研究", 《植物检疫》 *

Also Published As

Publication number Publication date
GB2607197A9 (en) 2023-02-08
GB2607197B (en) 2023-04-26
GB202208586D0 (en) 2022-07-27
GB2577150A (en) 2020-03-18
DE102019115108A1 (de) 2019-12-12
GB2577150B (en) 2022-11-23
GB2607739B (en) 2023-04-05
GB2607739A (en) 2022-12-14
GB201906843D0 (en) 2019-06-26
US20190376980A1 (en) 2019-12-12
US10877044B2 (en) 2020-12-29
DE102019115108B4 (de) 2024-06-20
GB2607197A (en) 2022-11-30
GB202209778D0 (en) 2022-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Merkley et al. Applications and challenges of forensic proteomics
JP5199101B2 (ja) 生体分子の検定を開発するための方法
Blueggel et al. Bioinformatics in proteomics
JP2005091344A (ja) 質量分析システム
WO2004090526A1 (ja) 試料解析方法及び試料解析プログラム
JP7431933B2 (ja) 質量分析を使用する低存在量のポリペプチドの絶対定量のための方法
EP1704507B1 (en) Methods and system for the identification and charcterization of peptides and their functional relationships by use of measures of correlation
US20180088094A1 (en) Multiple attribute monitoring methodologies for complex samples
EP1887351A1 (en) Screening method for specific protein in proteome comprehensive analysis
US20140156206A1 (en) Detection and Quantification of Polypeptides Using Mass Spectrometry
Merkley et al. A proteomics tutorial
JP4990273B2 (ja) Ｌｃ／ｍｓを用いるタンパク質を絶対定量するためのシステムおよび方法
CN110568055A (zh) 通过质谱法表征靶蛋白
US20210246085A1 (en) Methods and Systems for Measuring Plasma Renin Activity
Meyers et al. Protein identification and profiling with mass spectrometry
WO2023118561A1 (en) Method of extracting information about protein sequence modifications
Cottrell Database searching for protein identification and characterization
EP2199800A1 (en) A method of more reliable protein determination from mass spectrometric data
Compendium Proteomics: Biomarker Discovery and Validation
Dunham Applicability of Multidimensional Fractionation to Affinity Purification Mass Spectrometry Samples and Protein Phosphatase 4 Substrate Identification

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210727

Address after: Bremen, Germany

Applicant after: Brooke Dalton limited and Lianghe Co.

Address before: Bremen, Germany

Applicant before: Brook Dalton Ltd.

TA01 Transfer of patent application right