CN110563837B - 从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法，该方法包括鸡蛋清溶液的样品制备、利用乙醇预处理蛋清溶液除杂蛋白、微波辅助硫酸铵第一步沉淀、微波辅助硫酸铵第二步沉淀四个步骤；所述的卵类黏蛋白提取工艺是采用微波功率140W、微波时间20s的参数来辅助硫酸铵沉淀过程。本发明解决了卵类黏蛋白分离纯化操作复杂、周期长、纯度及得率低等问题，利用微波技术诱导蛋白分子极化，及促进传质的效应，建立了一种新兴、简单、快速和高效的卵类黏蛋白提取方法，该方法大大缩短了普通盐析过程中的静置时间，简化操作过程，降低提取成本，提高分离效率，适用于大范围生产，为微波技术在禽蛋类蛋白提纯中的应用提供支持。

Description

从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法

技术领域

本发明涉及卵类黏蛋白的高效提取方法，具体涉及一种从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法。

背景技术

鸡蛋清来源广泛，价格低廉，干物质中蛋白质含量超过80％，是最理想的蛋白质资源之一。卵类黏蛋白(ovomucoid，简称OVM)，约占鸡蛋清蛋白质总量的11％。其蛋白结构紧密，具有耐热、耐酸碱以及抗胰蛋白酶消化等特性，可引起免疫反应。卵类黏蛋白有抑制肿瘤和抗癌等重要的免疫学作用，可作为食品检测中的标记物，亦可用于预测儿童群体中鸡蛋过敏症的发生。因此纯化获得卵类黏蛋白，对食品和医药领域都具有非常重要的意义。

虽然蛋白质分离纯化的方法很多，但到目前为止还没有找到一种简单经济、适应范围较广的方法能够将卵类黏蛋白从复杂的鸡蛋组分中提取出来。早期，人们利用有机溶剂沉淀法提取卵类黏蛋白，例如三氯乙酸和丙酮溶剂，但是有机溶剂会导致卵类黏蛋白不同程度的变性。目前，卵类黏蛋白分离纯化方法报道较多的包括双水相萃取法、电泳法、层析法和沉淀法等。双水相萃取法和电泳法处理量小且不具有实际应用价值；层析法获得目标蛋白纯度高，但是处理量小成本大，技术也非常繁琐；目前分离纯化卵类黏蛋白的沉淀技术较多是利用盐析法沉淀，该方法简便易操作，但存在的问题是沉淀法所需静置时间较长，效率极低，分离所得的卵类黏蛋白纯度普遍低于90％。国外研究中，2009年AnupongTankrathok利用两步离子交换层析和沉淀相结合的方法纯化卵类黏蛋白(Tankrathok A,Daduang S,Patramanon R,et al.Purification Process for the Preparation andCharacterizations of Hen Egg White Ovalbumin,Lysozyme,Ovotransferrin,andOvomucoid[J].PREPARATIVE BIOCHEMISTRY&BIOTECHNOLOGY,2009,39(4):380-399.)，但是回收效益低(纯度80％，回收率21％)且仅仅适用于实验室水平的制备。2012年史晓霞所使用的丙酮沉淀法(史晓霞.蛋清卵类粘蛋白分离纯化、结构表征及其过敏原性的研究[D].华中农业大学,2012.)提取出了纯度95.3％的卵类黏蛋白，但在利用冷丙酮进行沉淀处理后还需使用纤维素离子交换法再次纯化，步骤复杂，用时较长，且回收率仅仅达23.8％。E.D.N.S.Abeyrathne在2014年利用高浓度的乙醇与柠檬酸组合，从乙醇提取上清液中分离卵类黏蛋白(Abeyrathne E D N S,Lee H Y,Ahn D U.Separation of ovotransferrinand ovomucoid from chicken egg white[J].Poult Sci,2014,93(4):1010-1017.)，虽然蛋白回收率达到了95％，但其过程繁琐，多个步骤需要静置过夜，等待时间过长，不利于大规模制备；国内研究中，2014年王帅(王帅,吴子健,王素英,等.三步沉淀法纯化鸡卵类黏蛋白[J].食品科学,2014,35(24):74-80.)使用三步盐析沉淀法纯化鸡卵类黏蛋白可取得较高纯度，但提取率仅为27.05％，过程中盐析反应耗时较长(12h左右)。因此，开发出一种操作简便、耗时短暂、纯度及回收率高的卵类黏蛋白分离纯化方法，将具有重要的应用价值。

微波与传统加热方式不同，是通过偶极子旋转和离子传导两种方式里外同时加热，无温度梯度，因此升温快速均匀，大大缩短反应时间，提高反应速率。微波在生物技术中的应用，是一个比较新的热点研究领域。利用微波辅助盐析作用，可促进传质过程，加快电解质离子与蛋白质周围的水化层的位置更换，离子很快取代水分子，从而使蛋白质的水化层被电解质离子取代，同时中和了蛋白质表面所带的部分电荷。由于微波场诱导蛋白分子产生极化现象，维持蛋白空间结构的非共价键(疏水相互作用、二硫键、静电相互作用)被破坏，蛋白分子部分展开，分子的柔性提高，更多的蛋白分子溶解到水相，蛋白的溶解性增强；当微波处理时间进一步延长时，极化的蛋白分子之间相互作用，通过疏水相互作用、二硫键、静电相互作用及氢键等重新形成分子聚集体，分子的柔性降低，稳定性较弱的蛋白质溶解性降低发生沉淀。因此，微波作用后的盐析体系不必静置，蛋白质的盐析分离速度大大提高。专利CN101962403A(任仙娥,李立军,黄永春,等.一种利用微波辅助盐液提取蚕蛹蛋白的方法:,CN101962403A[P].2011.)中使用微波辅助分离蚕蛹蛋白，并证明微波可有效加快提取效率。

但是，目前未有过将微波技术应用于禽蛋类蛋白质分离提纯的相关报道。

发明内容

本发明的目的是为了改善层析或电泳方法在纯化过程中，耗时长、步骤复杂等不足，提供了一种简单、快速和高效的从鸡蛋清中提取卵类黏蛋白的方法，该方法利用便捷经济的盐析法结合新兴的微波技术，通过微波技术的辅助，工艺流程中无需冷藏静置，盐析过程大大缩短。

为实现上述目的，本发明所设计一种从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)样品制备

将新鲜鸡蛋打碎并分离出蛋清，向鸡蛋清中加入等体积的水，均质15-30min，得鸡蛋清溶液；

(2)乙醇溶液预处理

向鸡蛋清溶液中缓慢加入无水乙醇，使溶液中乙醇终浓度到达20-25％(v/v)，混合均匀得到混合溶液，调节混合溶液pH值至4.5-5，磁力搅拌15-30min后，离心，所得上清液经超滤、冻干，得到卵类黏蛋白粗品粉末；

(3)微波辅助硫酸铵第一步沉淀

取卵类黏蛋白粗品粉末加入一倍体积蒸馏水，制备粗蛋白液，加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达30-70％，置于微波炉中，在微波功率为0-280W密封条件下提取0-40s，得到提取液，将提取液离心得到上清液；

(4)微波辅助硫酸铵第二步沉淀

向上清液继续加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达70-90％，所得溶液置于微波炉中，在微波功率为0-280W密封条件下提取0-40s，离心，弃上清液取沉淀，沉淀复溶于水后进行透析、冻干，制成卵类黏蛋白，其中，卵类黏蛋白提取率为63.1～72.7％，卵类黏蛋白纯度为95％以上(电泳级纯)。

进一步地，所述离心条件为：温度为4℃，转速为5000g，离心10min。

再进一步地，所述步骤3)中，硫酸铵饱和度到达50％。

再进一步地，所述步骤4)中，硫酸铵饱和度为80％。

再进一步地，所述步骤3)和4)中，微波提取参数：功率为140W、时间20s。

再进一步地，所述卵类黏蛋白的提取率为72.7％，纯度为95％以上(电泳级纯)。

本发明的有益效果：

(1)使用新型的微波技术，利用其促进传质过程的优点，加速破坏蛋白空间结构的非共价键，大幅度降低蛋白质的溶解性，在传统的盐析沉淀法的基础上，缩短静置时间，提高纯化效率，达到快速、高效提取蛋白质的目的；

(2)考察了不同参数对实验结果的影响，优化了微波提取蛋白质的方案。通过分析，微波辅助盐析提取鸡蛋清中卵类黏蛋白的最佳工艺条件为微波功率140W，微波时间20s，三次平行实验得到蛋白质提取率为72.7％。此方法对鸡蛋清中蛋白质的提取比较彻底、得率高、纯度高，而且操作简单、环保，对提升蛋产品附加值具有一定的参考价值。

与现有的方法相比省去12h的反应时间，实验效果明显，可用于OVM蛋白质的大规模制备。综上，本发明所提供微波辅助盐析技术经济环保，在蛋白质提纯领域中具有可行性、创新性及良好的应用前景。

附图说明

图1为卵类黏蛋白分离纯化技术流程图；

图2为不同微波功率对OVM蛋白提取率的影响；

图3为不同微波时间对OVM蛋白提取率的影响；

图4为两步沉淀过程中不同硫酸铵饱和度组合对OVM蛋白提取率的影响；

图5为各步骤提取样品的SDS-PAGE凝胶电泳图；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

本发明的从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)样品制备

将新鲜鸡蛋打碎并分离出蛋清，向鸡蛋清中加入等体积的水，均质15-30min，得鸡蛋清溶液；

(2)乙醇溶液预处理

向鸡蛋清溶液中缓慢加入无水乙醇，使溶液中乙醇终浓度到达20-25％(v/v)，混合均匀得到混合溶液，调节混合溶液pH值至4.5-5，磁力搅拌15-30min后，离心，所得上清液经超滤、冻干，得到卵类黏蛋白粗品粉末；

(3)微波辅助硫酸铵第一步沉淀

取卵类黏蛋白粗品粉末加入一倍体积蒸馏水，制备粗蛋白液，加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达30-70％，置于微波炉中，在微波功率为0-280W密封条件下提取0-40s，得到提取液，将提取液离心得到上清液；

(4)微波辅助硫酸铵第二步沉淀

向上清液继续加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达70-90％，所得溶液置于微波炉中，在微波功率为0-280W密封条件下提取0-40s，离心，弃上清液取沉淀，沉淀复溶于水后进行透析、冻干，制成卵类黏蛋白。

上述制备方法参数选取的理论基础：

1.不同微波功率下卵类黏蛋白OVM的提取率

以上述相同制备方法的步骤，微波时间设定为20s时，不同微波功率下(0、70、140、210、280W)提取卵类黏蛋白OVM，并以下述方法计算不同微波功率下的卵类黏蛋白OVM的提取率：

如图2所示：微波功率为140W时蛋白提取率最高；

2.不同微波时间下卵类黏蛋白OVM的提取率

以上述相同制备方法的步骤，微波功率设定为140W时，不同微波时间下(0、10、20、30、40s)的提取卵类黏蛋白OVM，并以上述方法计算不同微波功率下的卵类黏蛋白OVM的提取率：

如图3所示：微波时间为20s时蛋白提取率最高。

3.不同硫酸铵饱和度组合下卵类黏蛋白OVM的提取率

以上述相同制备方法的步骤，微波功率、时间选用最佳参数时，调整第一步沉淀的硫酸铵饱和度(30、40、50、60、70％)及第二步沉淀的硫酸铵饱和度(70、75、80、85、90％)的提取卵类黏蛋白OVM，并以上述方法计算不同硫酸铵饱和度组合下的卵类黏蛋白OVM的提取率：

组合A：第一步硫酸铵饱和度30％及第二步硫酸铵饱和度70％

组合B：第一步硫酸铵饱和度40％及第二步硫酸铵饱和度75％

组合C：第一步硫酸铵饱和度50％及第二步硫酸铵饱和度80％

组合D：第一步硫酸铵饱和度60％及第二步硫酸铵饱和度85％

组合E：第一步硫酸铵饱和度70％及第二步硫酸铵饱和度90％

如图4所示：组合C即第一步沉淀硫酸铵饱和度为50％且第二步沉淀硫酸铵饱和度为80％时蛋白提取率最高。

4.上述步骤中四个步骤得到样品的SDS-PAGE检测

鸡蛋清经依次经上述方法的四步骤分别得到、鸡蛋清溶液、乙醇溶液除去大量杂蛋白、50％硫酸铵溶液第一步沉淀、80％硫酸铵溶液第二步沉淀的步骤所得蛋白质上清液或沉淀；将四种产物进行SDS-PAGE检测：

a.SDS-PAGE检测蛋白质样品条件：

质量分数12％分离胶、5％浓缩胶、上样量10μL、80V恒压电泳0.5h，120V恒压电泳1h

b.结果：

电泳结束后，使用固定液固定0.5h，染色液染色0.5h，脱色液多次洗脱后拍照；电泳条带的对比显示：发明提取工艺能够得到较纯的卵类黏蛋白。

实施例1

从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白1的方法，包括以下步骤：

(1)样品制备

将新鲜鸡蛋打碎在干净的烧杯里，采用蛋清分离器分离出蛋清，向鸡蛋清中加入等体积的蒸馏水，加入完成后，利用均质机均质30min，得鸡蛋清溶液；

(2)乙醇溶液预处理

取1000mL的鸡蛋清溶液，向鸡蛋清溶液中缓慢加入无水乙醇，使溶液中乙醇终浓度到达20％(v/v)，混合均匀得到混合溶液，并用盐酸调节混合溶液pH值至5，磁力搅拌30min后，离心(4℃，5000×g)10min，所得上清液经超滤、冻干，得到卵类黏蛋白粗品粉末；

(3)微波辅助硫酸铵第一步沉淀

取卵类黏蛋白粗品粉末加入一倍体积蒸馏水，制备粗蛋白液，加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达50％，置于微波炉中，在微波功率为70W密封条件下提取10s，得到提取液，将提取液离心(4℃，5000×g)10min得到上清液；

(4)微波辅助硫酸铵第二步沉淀

向上清液继续加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达80％，所得溶液置于微波炉中，在微波功率为70W密封条件下提取10s，离心(4℃，5000×g)10min，弃上清液取沉淀，沉淀复溶于水后进行透析、冻干，制成卵类黏蛋白1。

实施例2

从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白2的方法，包括以下步骤：

(1)样品制备

将新鲜鸡蛋打碎在干净的烧杯里，采用蛋清分离器分离出蛋清，向鸡蛋清中加入等体积的蒸馏水，加入完成后，利用均质机均质30min，得鸡蛋清溶液；

(2)乙醇溶液预处理

取1000mL的鸡蛋清溶液，向鸡蛋清溶液中缓慢加入无水乙醇，使溶液中乙醇终浓度到达20％(v/v)，混合均匀得到混合溶液，并用盐酸调节混合溶液pH值至5，磁力搅拌30min后，离心(4℃，5000×g)10min，所得上清液经超滤、冻干，得到卵类黏蛋白粗品粉末；

(3)微波辅助硫酸铵第一步沉淀

取卵类黏蛋白粗品粉末加入一倍体积蒸馏水，制备粗蛋白液，加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达50％，置于微波炉中，在微波功率为140W密封条件下提取20s，得到提取液，将提取液离心(4℃，5000×g)10min得到上清液；

(4)微波辅助硫酸铵第二步沉淀

向上清液继续加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达80％，所得溶液置于微波炉中，在微波功率为140W密封条件下提取20s，离心(4℃，5000×g)10min，弃上清液取沉淀，沉淀复溶于水后进行透析、冻干，制成卵类黏蛋白2。

实施例3

从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白3的方法，包括以下步骤：

(1)样品制备

将新鲜鸡蛋打碎在干净的烧杯里，采用蛋清分离器分离出蛋清，向鸡蛋清中加入等体积的蒸馏水，加入完成后，利用均质机均质30min，得鸡蛋清溶液；

(2)乙醇溶液预处理

取1000mL的鸡蛋清溶液，向鸡蛋清溶液中缓慢加入无水乙醇，使溶液中乙醇终浓度到达20％(v/v)，混合均匀得到混合溶液，并用盐酸调节混合溶液pH值至5，磁力搅拌30min后，离心(4℃，5000×g)10min，所得上清液经超滤、冻干，得到卵类黏蛋白粗品粉末；

(3)微波辅助硫酸铵第一步沉淀

取卵类黏蛋白粗品粉末加入一倍体积蒸馏水，制备粗蛋白液，加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达50％，置于微波炉中，在微波功率为280W密封条件下提取40s，得到提取液，将提取液离心(4℃，5000×g)10min得到上清液；

(4)微波辅助硫酸铵第二步沉淀

向上清液继续加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达80％，所得溶液置于微波炉中，在微波功率为280W密封条件下提取40s，离心(4℃，5000×g)10min，弃上清液取沉淀，沉淀复溶于水后进行透析、冻干，制成卵类黏蛋白3。

实施例4

从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白1的方法，包括以下步骤：

(1)样品制备

将新鲜鸡蛋打碎在干净的烧杯里，采用蛋清分离器分离出蛋清，向鸡蛋清中加入等体积的蒸馏水，加入完成后，利用均质机均质30min，得鸡蛋清溶液；

(2)乙醇溶液预处理

取1000mL的鸡蛋清溶液，向鸡蛋清溶液中缓慢加入无水乙醇，使溶液中乙醇终浓度到达20％(v/v)，混合均匀得到混合溶液，并用盐酸调节混合溶液pH值至5，磁力搅拌30min后，离心(4℃，5000×g)10min，所得上清液经超滤、冻干，得到卵类黏蛋白粗品粉末；

(3)微波辅助硫酸铵第一步沉淀

取卵类黏蛋白粗品粉末加入一倍体积蒸馏水，制备粗蛋白液，加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达50％，4℃静置一段时间提取，得到提取液，将提取液离心(4℃，5000×g)10min得到上清液；

(4)微波辅助硫酸铵第二步沉淀

向上清液继续加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达70-90％，所得溶液置于微波炉中，4℃静置一段时间提取，离心(4℃，5000×g)10min，弃上清液取沉淀，沉淀复溶于水后进行透析、冻干，制成卵类黏蛋白4。

实施例5

从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白5的方法，包括以下步骤：

(1)样品制备

将新鲜鸡蛋打碎在干净的烧杯里，采用蛋清分离器分离出蛋清，向鸡蛋清中加入等体积的蒸馏水，加入完成后，利用均质机均质30min，得鸡蛋清溶液；

(2)乙醇溶液预处理

取1000mL的鸡蛋清溶液，向鸡蛋清溶液中缓慢加入无水乙醇，使溶液中乙醇终浓度到达25％(v/v)，混合均匀得到混合溶液，并用盐酸调节混合溶液pH值至4.5，磁力搅拌15min后，离心(4℃，5000×g)10min，所得上清液经超滤、冻干，得到卵类黏蛋白粗品粉末；

(3)微波辅助硫酸铵第一步沉淀

取卵类黏蛋白粗品粉末加入一倍体积蒸馏水，制备粗蛋白液，加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达70％，置于微波炉中，在微波功率为200W密封条件下提取40s，得到提取液，将提取液离心(4℃，5000×g)10min得到上清液；

(4)微波辅助硫酸铵第二步沉淀

向上清液继续加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达70-90％，所得溶液置于微波炉中，在微波功率为200W密封条件下提取40s，离心(4℃，5000×g)10min，弃上清液取沉淀，沉淀复溶于水后进行透析、冻干，制成卵类黏蛋白5。

实施例6

从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白6的方法，包括以下步骤：

(1)样品制备

将新鲜鸡蛋打碎在干净的烧杯里，采用蛋清分离器分离出蛋清，向鸡蛋清中加入等体积的蒸馏水，加入完成后，利用均质机均质30min，得鸡蛋清溶液；

(2)乙醇溶液预处理

取1000mL的鸡蛋清溶液，向鸡蛋清溶液中缓慢加入无水乙醇，使溶液中乙醇终浓度到达20-25％(v/v)，混合均匀得到混合溶液，并用盐酸调节混合溶液pH值至4.5，磁力搅拌30min后，离心(4℃，5000×g)10min，所得上清液经超滤、冻干，得到卵类黏蛋白粗品粉末；

(3)微波辅助硫酸铵第一步沉淀

取卵类黏蛋白粗品粉末加入一倍体积蒸馏水，制备粗蛋白液，加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达30％，置于微波炉中，在微波功率为120W密封条件下提取10s，得到提取液，将提取液离心(4℃，5000×g)10min得到上清液；

(4)微波辅助硫酸铵第二步沉淀

向上清液继续加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达70％，所得溶液置于微波炉中，在微波功率为120W密封条件下提取10s，离心(4℃，5000×g)10min，弃上清液取沉淀，沉淀复溶于水后进行透析、冻干，制成卵类黏蛋白6。

实施例7未微波辅助对照组

从鸡蛋清中提取卵类黏蛋白7的方法，该方法包括以下步骤：

(1)样品制备

将新鲜鸡蛋打碎在干净的烧杯里，采用蛋清分离器分离出蛋清，向鸡蛋清中加入等体积的蒸馏水，加入完成后，利用均质机均质30min，得鸡蛋清溶液。

(2)乙醇溶液预处理

取1000mL处理后蛋清液，向其中缓慢加入乙醇至终浓度为20％，混合均匀，并用盐酸调节混合溶液pH值至5，磁力搅拌30min后，离心(4℃，5000×g)10min，所得上清液经超滤、冻干，得到卵类黏蛋白粗品粉末。

(3)硫酸铵第一步沉淀

取样品粉末加入一倍体积蒸馏水，制备粗蛋白液，加入硫酸铵至饱和度50％，密封，4℃静置6h(不做微波处理，即微波功率0W、提取时间0s)，提取结束后，将样品离心(4℃，5000×g)10min后弃沉淀取上清液。

(4)硫酸铵第二步沉淀

选取第一步盐析的上清液，继续加入硫酸铵至饱和度80％，密封，4℃静置6h(不做微波处理，即微波功率0W、提取时间0s)，提取结束后，将样品离心(4℃，5000×g)10min，弃上清液取沉淀，即为纯化所得的卵类黏蛋白，称量蛋白质沉淀质量，并计算蛋白质提取率，比较得出最佳的微波提取参数，沉淀复溶于水后进行透析、冻干，包装后可制成卵类黏蛋白纯品7。

对比例1

参考丙酮沉淀法(史晓霞.蛋清卵类粘蛋白分离纯化、结构表征及其过敏原性的研究[D].华中农业大学,2012.)。

对比例2

参考三步沉淀法(王帅,吴子健,王素英,等.三步沉淀法纯化鸡卵类黏蛋白[J].食品科学,2014,35(24):74-80.)。

将上述实施例提取的卵类黏蛋白与现有方法提取的卵类黏蛋白进行对比：

表1 不同实施例卵类黏蛋白提取的对比效果

	提取率	纯度	沉淀反应用时
				实施例1	72.7％	95％以上	40s
实施例2	67.5％	95％以上	40s
				实施例3	69.1％	95％以上	20s
实施例4	65.9％	95％以上	40s
				实施例5	66.1％	95％以上	20s
实施例6	65.6％	95％以上	20s
				实施例7	63.1％	95％以上	12h
对比例1	23.8％	95.3％	12h以上
				对比例2	27.0％	99.0％	12h以上

由表1可知，本方法可从鸡蛋清中高效、快速、大量地提取卵类黏蛋白。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (3)

1.一种从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）样品制备

将新鲜鸡蛋打碎并分离出蛋清，向鸡蛋清中加入等体积的水，均质15-30 min，得鸡蛋清溶液；

（2）乙醇溶液预处理

向鸡蛋清溶液中缓慢加入无水乙醇，使溶液中乙醇终浓度到达20-25％，混合均匀得到混合溶液，调节混合溶液pH值至4.5-5，磁力搅拌15-30 min后，离心，所得上清液经超滤、冻干，得到卵类黏蛋白粗品粉末；

（3）微波辅助硫酸铵第一步沉淀

取卵类黏蛋白粗品粉末加入一倍体积蒸馏水，制备粗蛋白液，加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达50％，置于微波炉中，在微波功率为140 W密封条件下提取20 s，得到提取液，将提取液离心得到上清液；

（4）微波辅助硫酸铵第二步沉淀

向上清液继续加入硫酸铵，直至硫酸铵饱和度到达80%，所得溶液置于微波炉中，在微波功率为140 W密封条件下提取20 s，离心，弃上清液取沉淀，沉淀复溶于水后进行透析、冻干，制成卵类黏蛋白，其中，卵类黏蛋白提取率为63.1~72.7%，卵类黏蛋白纯度为95%以上。

2.根据权利要求1所述从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法，其特征在于：所述离心条件为：温度为4℃，转速为5000 g，离心10 min。

3.根据权利要求1所述从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法，其特征在于：所述卵类黏蛋白的提取率为72.7%，纯度为95%以上。

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