CN110559447A - 一种tat-cryab融合蛋白在肠道炎症中的应用方法 - Google Patents

一种tat-cryab融合蛋白在肠道炎症中的应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种TAT‑CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法，具体涉及药品领域，具体包括以下步骤：S1、pET28a‑TAT‑CRYAB重组质粒的构建；S2、pET28a‑TAT‑CRYAB重组蛋白的表达与纯化。本发明主要利用分子克隆与重组蛋白技术，构建了pET28a‑TAT‑CRYAB重组质粒，而后将该质粒纯化提取重组蛋白，本发明的目的在于治疗肠道炎症，包括体味和动物模型中的治疗价值，为炎症性肠病的治疗提供新的思路，本发明目前能够治疗体外诱导的炎症反应，并能够有效治疗小鼠肠道炎症。

Description

一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法
技术领域
本发明涉及药品技术领域，更具体地说，本发明涉及一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法。
背景技术
炎症性肠病(IBD)是一种累及消化道的慢性炎性疾病，主要的表现形式溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。近年来，IBD的发病率持续上升，尤其是在发展中国家。10％-30％的UC和70％的CD患者在病程发展过程中，因药物治疗失败或并发症需行手术治疗。抗TNF-α抗体治疗的成功应用被认为是治疗IBD的重大突破，但大约三分之一的患者对抗TNF-α治疗无应答或出现药物不耐受。深入研究IBD肠道炎症病变相关因子与信号转导通路中关键靶基因或受体，寻找介导或参与多个炎症相关信号通路发挥生物学效应的靶点显得尤为迫切。
αB-晶状体蛋白(CRYAB)是小分子热休克蛋白家族具代表性的成员之一，基本功能是作为热敏感性分子伴侣协助蛋白进行正确的折叠和组装，稳定靶蛋白分子的构象，防止形成不可逆性的蛋白质聚集产物。
CRYAB在许多炎症性疾病中具有潜在治疗价值，尤其在慢性阻塞性肺疾病、免疫性心肌炎以及中枢神经系统炎症中发挥着重要的抗炎作用，但CRYAB在肠道炎症的作用仍不清楚。
以前的研究表明，一种特殊的10-20氨基酸序列，来自 HIV-1Trans-ActivatorofTranscription(TAT)蛋白，被称为TAT蛋白转导结构域(PTD)，具有促进重组成分穿透细胞的能力。近年来，TAT介导的蛋白质转导的新兴技术逐渐发展，主要用于细胞重编程。然而，使用这种技术进行疾病的临床治疗是比较少见的。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法，具体包括以下步骤：
S1、pET28a-TAT-CRYAB重组质粒的构建；构建方法具体如下：
S1.1、购买pET28a质粒，准备pET28a载体酶切体系：pET28a载体、 NheI、10xFastdigestBuffer以及DEPC水，然后将酶切体系配好，在37℃水浴锅中水浴1h，而后同上述步骤胶回；
S1.2、pET28a-TAT质粒连接；
首先将TAT的前后引物退火，退火后进行连接，体系为：10×T4buffer、 T4连接酶、pET28a酶切产物以及TAT序列退火产物，体系配好后室温静置1h 即可；
S1.3、而后进行pET28a-TAT质粒的转化、涂板、摇菌、提质粒以及测序，获得可用的pET28a-TAT质粒；
S1.4、将pET28a-TAT质粒再次酶切，体系如下：
pET28a-TAT质粒、10xFastDigestgreenbuffer、BamHI、EcoRI水以及DEPC 水，上述体系配好后37℃水浴锅中水浴1h，而后同上述步骤胶回；
S1.5、pET28a-TAT-CRYAB质粒连接；
CRYAB前后引物先进行退火处理，而后进行T4连接酶法连接，体系为： 10×T4buffer、T4连接酶、pET28a酶切产物以及CRYAB序列退火产物，体系配好后，室温静置1h即可；
S1.6、而后进行pET28a-TAT-CRYAB质粒的转化、涂板、摇菌、提质粒以及测序，获得可用的纯化pET28a-TAT质粒；
S2、pET28a-TAT-CRYAB重组蛋白的表达与纯化；具体方法如下：
S2.1、将步骤S1中制备的纯化重组质粒转化至大肠杆菌BL21，挑取转化的单菌落，在5ml含卡那霉素的LB培养基中37℃震荡培养，加入终浓度为 1.0mmol/L的IPTG诱导8h；
S2.2、同时用未诱导菌作对照，离心收集菌体加凝胶上样缓冲液100℃煮沸5min后，进行SDS-PAGE法检测，分离胶和浓缩胶的浓度分别为12％和5 ％；
S2.3、取重组质粒pET28a-TAT-CRYAB转化BL21菌种于卡那霉素LB培养基中，培养12h后取5ml扩大培养至500ml菌液，然后加入终浓度为1.0mmol /L的IPTG诱导8h；
S2.4、6000r/min离心10min收集菌体，用上样缓冲液洗涤3次，然后溶入上样缓冲液中超声破菌，6000r/min离心10min收集上清；
S2.5、2ml镍金属螯合层析柱用10ml平衡液平衡；
S2.6、上清吸附于层析柱后先用10ml平衡液洗涤，再用10ml洗脱液洗脱，收集洗脱的样品液，经PBS透析脱盐，PEG20000浓缩；
S2.7、过滤除菌，加10％甘油-80℃保存；
S2.8、用考马斯蓝染色和SDS-PAGE检验纯化效果，测定蛋白浓度， Westernblot鉴定融合蛋白。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S1.1中，pET28a载体酶切体系具体如下：
在一个优选地实施方式中，所述步骤S1.2中，TAT的前后引物退火后连接的体系具体如下：
在一个优选地实施方式中，所述步骤S1.4中，pET28a-TAT质粒再次酶切的体系具体如下：
在一个优选地实施方式中，所述步骤S1.5中，T4连接酶法连接体系具体如下：
在一个优选地实施方式中，所述步骤S2.1中，震荡培养至OD600＝0.4-0.6 时加入IPTG诱导8h。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S2.5中，平衡液具体为0.3mol/L 的Nacl、50mmol/L的Na2HPO4、10mmol/L的咪唑，且平衡液pH为8.0。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S2.6中，洗脱液具体为0.3mol/L 的Nacl、50mmol/L的Na2HPO4、250mmol/L的咪唑，且洗脱液PH为8.0。
本发明的技术效果和优点：
1、本发明主要利用分子克隆与重组蛋白技术，构建了pET28a-TAT-CRYAB 重组质粒，而后将该质粒纯化提取重组蛋白，本发明的目的在于治疗肠道炎症，包括体味和动物模型中的治疗价值，为炎症性肠病的治疗提供新的思路，本发明目前能够治疗体外诱导的炎症反应，并能够有效治疗肠道炎症；
2、本发明将CRYAB的CDS区连接到TAT序列，在插入pET28a载体，提取重组蛋白，用于体外和体内实验检测其是否具有治疗作用，对于体外实验，本发明能够有效抑制TNF-α引起的炎症反应，减少TNF-α，IL-6，IL-1β和IL-8的表达水平，对于体内实验，TAT-CRYAB重组蛋白不仅能够减轻DSS引起的结肠炎严重程度，改善疾病活动度，还能够保护肠屏障的完整性；
3、本发明为CRYAB重组蛋白，该蛋白中只表达一种成分即CRYAB，不含任何其他成分，本发明TAT序列具有透膜的功能，将目的分子连接到TAT序列后，能够将目的分子透膜送达到疾病区域发货生物学效应，我们在实验中研究了CRYAB抑制炎症反应的机制，主要是CRYAB与IKKβ结合，抑制了IKK β活性，同时再与IKKα结合，从而抑制了IKKβ与IKKα两者之间的结合，影响了IKK复合物的形成，阻碍了NF-κB通路的激活。
附图说明
图1为本发明的TAT-CRYAB重组蛋白的构建示意图。
图2为本发明的重组TAT-CRYAB融合蛋白抑制肠上皮细胞炎症反应示意图。
图3为本发明的注射TAT-CRYAB融合蛋白缓解DSS引起的结肠炎示意图。
图4为本发明的腹腔注射TAT-CRYAB保护小鼠肠屏障完整性示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法，具体包括以下步骤：
S1、pET28a-TAT-CRYAB重组质粒的构建；构建方法具体如下：
S1.1、购买pET28a质粒，准备pET28a载体酶切体系：pET28a载体、 NheI、10xFastdigestBuffer以及DEPC水，pET28a载体酶切体系具体如下：
然后将酶切体系配好，在37℃水浴锅中水浴1h，而后同上述步骤胶回；
S1.2、pET28a-TAT质粒连接；
首先将TAT的前后引物退火，退火后进行连接，体系为：10×T4buffer、 T4连接酶、pET28a酶切产物以及TAT序列退火产物，TAT的前后引物退火后连接的体系具体如下：
体系配好后室温静置1h即可；
S1.3、而后进行pET28a-TAT质粒的转化、涂板、摇菌、提质粒以及测序，获得可用的pET28a-TAT质粒；
S1.4、将pET28a-TAT质粒再次酶切，体系如下：
pET28a-TAT质粒、10xFastDigestgreenbuffer、BamHI、EcoRI水以及DEPC 水，pET28a-TAT质粒再次酶切的体系具体如下：
上述体系配好后37℃水浴锅中水浴1h，而后同上述步骤胶回；
S1.5、pET28a-TAT-CRYAB质粒连接；
CRYAB前后引物先进行退火处理，而后进行T4连接酶法连接，体系为： 10×T4buffer、T4连接酶、pET28a酶切产物以及CRYAB序列退火产物，T4连接酶法连接体系具体如下：
体系配好后，室温静置1h即可；
S1.6、而后进行pET28a-TAT-CRYAB质粒的转化、涂板、摇菌、提质粒以及测序，获得可用的纯化pET28a-TAT质粒；
S2、pET28a-TAT-CRYAB重组蛋白的表达与纯化；具体方法如下：
S2.1、将步骤S1中制备的纯化重组质粒转化至大肠杆菌BL21，挑取转化的单菌落，在5ml含卡那霉素的LB培养基中37℃震荡培养，震荡培养至 OD600＝0.4时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导8h；
S2.2、同时用未诱导菌作对照，离心收集菌体加凝胶上样缓冲液100℃煮沸5min后，进行SDS-PAGE法检测，分离胶和浓缩胶的浓度分别为12％和5 ％；
S2.3、取重组质粒pET28a-TAT-CRYAB转化BL21菌种于卡那霉素LB培养基中，培养12h后取5ml扩大培养至500ml菌液，然后加入终浓度为1.0mmol /L的IPTG诱导8h；
S2.4、6000r/min离心10min收集菌体，用上样缓冲液洗涤3次，然后溶入上样缓冲液中超声破菌，6000r/min离心10min收集上清；
S2.5、2ml镍金属螯合层析柱用10ml平衡液平衡，平衡液具体为0.3mol/L 的Nacl、50mmol/L的Na2HPO4、10mmol/L的咪唑，且平衡液pH为8.0；
S2.6、上清吸附于层析柱后先用10ml平衡液洗涤，再用10ml洗脱液洗脱，收集洗脱的样品液，经PBS透析脱盐，PEG20000浓缩，洗脱液具体为 0.3mol/L的Nacl、50mmol/L的Na2HPO4、250mmol/L的咪唑，且洗脱液PH 为8.0；
S2.7、过滤除菌，加10％甘油-80℃保存；
S2.8、用考马斯蓝染色和SDS-PAGE检验纯化效果，测定蛋白浓度， Westernblot鉴定融合蛋白。
实施例2：
一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法，具体包括以下步骤：
S1、pET28a-TAT-CRYAB重组质粒的构建；构建方法具体如下：
S1.1、购买pET28a质粒，准备pET28a载体酶切体系：pET28a载体、 NheI、10xFastdigestBuffer以及DEPC水，pET28a载体酶切体系具体如下：
然后将酶切体系配好，在37℃水浴锅中水浴1h，而后同上述步骤胶回；
S1.2、pET28a-TAT质粒连接；
首先将TAT的前后引物退火，退火后进行连接，体系为：10×T4buffer、 T4连接酶、pET28a酶切产物以及TAT序列退火产物，TAT的前后引物退火后连接的体系具体如下：
体系配好后室温静置1h即可；
S1.3、而后进行pET28a-TAT质粒的转化、涂板、摇菌、提质粒以及测序，获得可用的pET28a-TAT质粒；
S1.4、将pET28a-TAT质粒再次酶切，体系如下：
pET28a-TAT质粒、10xFastDigestgreenbuffer、BamHI、EcoRI水以及DEPC 水，pET28a-TAT质粒再次酶切的体系具体如下：
上述体系配好后37℃水浴锅中水浴1h，而后同上述步骤胶回；
S1.5、pET28a-TAT-CRYAB质粒连接；
CRYAB前后引物先进行退火处理，而后进行T4连接酶法连接，体系为： 10×T4buffer、T4连接酶、pET28a酶切产物以及CRYAB序列退火产物，T4连接酶法连接体系具体如下：
体系配好后，室温静置1h即可；
S1.6、而后进行pET28a-TAT-CRYAB质粒的转化、涂板、摇菌、提质粒以及测序，获得可用的纯化pET28a-TAT质粒；
S2、pET28a-TAT-CRYAB重组蛋白的表达与纯化；具体方法如下：
S2.1、将步骤S1中制备的纯化重组质粒转化至大肠杆菌BL21，挑取转化的单菌落，在5ml含卡那霉素的LB培养基中37℃震荡培养，震荡培养至 OD600＝0.5时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导8h；
S2.2、同时用未诱导菌作对照，离心收集菌体加凝胶上样缓冲液100℃煮沸5min后，进行SDS-PAGE法检测，分离胶和浓缩胶的浓度分别为12％和5 ％；
S2.3、取重组质粒pET28a-TAT-CRYAB转化BL21菌种于卡那霉素LB培养基中，培养12h后取5ml扩大培养至500ml菌液，然后加入终浓度为1.0mmol /L的IPTG诱导8h；
S2.4、6000r/min离心10min收集菌体，用上样缓冲液洗涤3次，然后溶入上样缓冲液中超声破菌，6000r/min离心10min收集上清；
S2.5、2ml镍金属螯合层析柱用10ml平衡液平衡，平衡液具体为0.3mol/L 的Nacl、50mmol/L的Na2HPO4、10mmol/L的咪唑，且平衡液pH为8.0；
S2.6、上清吸附于层析柱后先用10ml平衡液洗涤，再用10ml洗脱液洗脱，收集洗脱的样品液，经PBS透析脱盐，PEG20000浓缩，洗脱液具体为 0.3mol/L的Nacl、50mmol/L的Na2HPO4、250mmol/L的咪唑，且洗脱液PH 为8.0；
S2.7、过滤除菌，加10％甘油-80℃保存；
S2.8、用考马斯蓝染色和SDS-PAGE检验纯化效果，测定蛋白浓度， Westernblot鉴定融合蛋白。
实施例3：
一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法，具体包括以下步骤：
S1、pET28a-TAT-CRYAB重组质粒的构建；构建方法具体如下：
S1.1、购买pET28a质粒，准备pET28a载体酶切体系：pET28a载体、 NheI、10xFastdigestBuffer以及DEPC水，pET28a载体酶切体系具体如下：
然后将酶切体系配好，在37℃水浴锅中水浴1h，而后同上述步骤胶回；
S1.2、pET28a-TAT质粒连接；
首先将TAT的前后引物退火，退火后进行连接，体系为：10×T4buffer、 T4连接酶、pET28a酶切产物以及TAT序列退火产物，TAT的前后引物退火后连接的体系具体如下：
体系配好后室温静置1h即可；
S1.3、而后进行pET28a-TAT质粒的转化、涂板、摇菌、提质粒以及测序，获得可用的pET28a-TAT质粒；
S1.4、将pET28a-TAT质粒再次酶切，体系如下：
pET28a-TAT质粒、10xFastDigestgreenbuffer、BamHI、EcoRI水以及DEPC 水，pET28a-TAT质粒再次酶切的体系具体如下：
上述体系配好后37℃水浴锅中水浴1h，而后同上述步骤胶回；
S1.5、pET28a-TAT-CRYAB质粒连接；
CRYAB前后引物先进行退火处理，而后进行T4连接酶法连接，体系为： 10×T4buffer、T4连接酶、pET28a酶切产物以及CRYAB序列退火产物，T4连接酶法连接体系具体如下：
体系配好后，室温静置1h即可；
S1.6、而后进行pET28a-TAT-CRYAB质粒的转化、涂板、摇菌、提质粒以及测序，获得可用的纯化pET28a-TAT质粒；
S2、pET28a-TAT-CRYAB重组蛋白的表达与纯化；具体方法如下：
S2.1、将步骤S1中制备的纯化重组质粒转化至大肠杆菌BL21，挑取转化的单菌落，在5ml含卡那霉素的LB培养基中37℃震荡培养，震荡培养至 OD600＝0.6时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导8h；
S2.2、同时用未诱导菌作对照，离心收集菌体加凝胶上样缓冲液100℃煮沸5min后，进行SDS-PAGE法检测，分离胶和浓缩胶的浓度分别为12％和5 ％；
S2.3、取重组质粒pET28a-TAT-CRYAB转化BL21菌种于卡那霉素LB培养基中，培养12h后取5ml扩大培养至500ml菌液，然后加入终浓度为1.0mmol /L的IPTG诱导8h；
S2.4、6000r/min离心10min收集菌体，用上样缓冲液洗涤3次，然后溶入上样缓冲液中超声破菌，6000r/min离心10min收集上清；
S2.5、2ml镍金属螯合层析柱用10ml平衡液平衡，平衡液具体为0.3mol/L 的Nacl、50mmol/L的Na2HPO4、10mmol/L的咪唑，且平衡液pH为8.0；
S2.6、上清吸附于层析柱后先用10ml平衡液洗涤，再用10ml洗脱液洗脱，收集洗脱的样品液，经PBS透析脱盐，PEG20000浓缩，洗脱液具体为 0.3mol/L的Nacl、50mmol/L的Na2HPO4、250mmol/L的咪唑，且洗脱液PH 为8.0；
S2.7、过滤除菌，加10％甘油-80℃保存；
S2.8、用考马斯蓝染色和SDS-PAGE检验纯化效果，测定蛋白浓度， Westernblot鉴定融合蛋白。
如图1所示，TAT-CRYAB重组蛋白的构建中，A为TAT-CRYAB重组蛋白构建过程；B为考马斯蓝染色检测纯化的TAT-CRYAB重组蛋白；C为western blot检测纯化的TAT-CRYAB重组蛋白。
实施例4：
分别取上述实施例1-3的方法对三组小鼠进行分别治疗，且每只小鼠患肠道炎症情况大致相同，每30只小鼠为一组，治疗1-3天时间后，得到以下数据：
由上表可知，实施例2中原料配合比例适中，小鼠治疗后，能够明显的改善患病情况，以及快速的治疗好肠道炎症。
实施例5：
由于本发明目前只用于体外和体内研究，并未用于临床，因此无口服剂量，通过以下实验验证TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的治疗效果；
透膜功能实验：TAT-CRYAB重组蛋白孵育HT29和Caco-2细胞不同时间段，而后WB检测CRYAB蛋白表达水平，结果发现TAT-CRYAB重组蛋白处理HT29 和Caco-2细胞后，发现CRYAB蛋白水平有着时间依赖性地增高；进一步在DSS 诱导的结肠炎小鼠模型中研究TAT-CRYAB的治疗作用，首先取5只小鼠，腹腔分别注射25μg TAT-CRYAB后不同时间段后处死，提取结肠蛋白检测融合蛋白能否穿过肠屏障，结果发现腹腔注射融合蛋白上调了结肠组织CRYAB表达水平。
体外实验：在有或无TAT-CRYAB重组蛋白(25μg)预处理12h的HT29 和Caco-2细胞中加入TNF-α(10μg/ml)处理6h，qRT-PCR检测细胞因子的 mRNA水平(TNF-α，IL-6，IL-1β和IL-8)，结果发现TAT-CRYAB重组蛋白能够有效治疗TNF-α引起的炎症因子的上调，同时在处理融合蛋白后，p-p65 和p-IκBα水平也得到了显著抑制；
如图2所示，重组TAT-CRYAB融合蛋白抑制肠上皮细胞炎症反应中，A 为TAT-CRYAB重组蛋白孵育HT29和Caco-2细胞不同时间段，CRYAB的表达水平用免疫印迹法检测；B为在有或无TAT-CRYAB重组蛋白预处理12h的HT29 和Caco-2细胞中加入TNF-α(10μg/ml)处理6h，qRT-PCR检测细胞因子的 mRNA水平；C为不同组别细胞的p-p65,p65，p-IκBα和IκBα水平则用蛋白免疫印迹法检测。
体内试验：将20只小鼠分组，每组5只，第一组饮水，每天注射PBS 200μl，第二组饮水，每天注射TAT-CRYAB 25μg，第三组DSS诱导，每天注射PBS 200μl，第四组DSS诱导，每天注射TAT-CRYAB 25μg；每组小鼠共相应诱导处理7天，试验结果发现，DSS诱导使结肠明显缩短，而注射融合蛋白的小鼠结肠长度却仅有轻度缩短，同时疾病活动度(评分和结肠组织中炎症因子的表达也较低；
免疫印迹结果显示DSS显著降低了CRYAB水平，但补充TAT-CRYAB后CRYAB 却有一定程度回升，且能够抑制p-p65和p-IκBα的水平，最后免疫组化结果表明注射TAT-CRYAB后上调了结肠组织中CRYAB的表达水平；
如图3所示，注射TAT-CRYAB融合蛋白缓解DSS引起的结肠炎实验中，A 为注射TAT-CRYAB增加结肠组织中CRYAB的表达；B为TAT-CRYAB治疗DSS诱导结肠炎的模式图；C-D为TAT-CRYAB减少了结肠炎引起的结肠长度缩短以及 DAI评分；E为注射TAT-CRYAB减少了DSS诱导的结肠炎TNF-α,IL-6,IL-1β和IL-8的表达；F为免疫印迹法检测结肠中CRYAB,p-p65,p65,p-IκBα和 IκBα的水平；G为不同组别小鼠结肠中CRYAB表达的代表性免疫组化图片(放大倍数：低倍200x，高倍400x)；
以上结果一致表明TAT-CRYAB融合蛋白能够有效治疗DSS诱导的小鼠结肠炎，我们最后研究TAT-CRYAB能否保护肠屏障完整性，首先用FITC在诱导第7天给小鼠灌胃，取小鼠血检测小鼠肠屏障通透性，结果发现TAT-CRYAB 融合蛋白能够有效缓解DSS引起的肠屏障通透性升高，接着我们对不同组别的小鼠结肠组织进行HE染色，结果发现腹腔注射TAT-CRYAB融合蛋白能够减少溃疡形成及炎症组织病理学评分；
ABPAS发现TAT-CRYAB可以保护肠杯状细胞免于DSS的破坏，免疫印迹法检测不同组别小鼠结肠蛋白发现TAT-CRYAB治疗组的E-cadhein水平较未治疗组高，最后免疫荧光检测ZO-1、E-cadherin、CK20和MUC2表达反映不同组别肠屏障破坏情况，结果表明TAT-CRYAB治疗的小鼠上述指标均破坏较少，肠屏障较未治疗组完好。
如图4所示，腹腔注射TAT-CRYAB保护小鼠肠屏障完整性实验中，A为不同组别小鼠代表性的HE染色图片以及结肠组织病理学评分(放大倍数：低倍 200x，高倍400x)；B为不同组别小鼠代表性的ABPAS染色图片放大倍数：低倍200x，高倍400x)；C为免疫印迹法检测不同组别小鼠中E-cadherin的表达；D为同组别小鼠ZO-1免疫荧光检测(放大倍数：低倍200x，高倍 400x)；E为DSS诱导第7天时，每只小鼠灌胃Fluorescein isothiocyanate-dextran(FITC)150ul 80mg/mL，(用无菌水溶解配制)， 3h后，取小鼠血,根据荧光强度检测每组小鼠的肠屏障通透性；F为不同组别小鼠代表性的E-cadherin、CK20和MUC2的免疫荧光图片(放大倍数：低倍200x，高倍400x)。
对于体外实验，本发明能够有效抑制TNF-α引起的炎症反应，减少TNF- α，IL-6，IL-1β和IL-8的表达水平，对于体内实验，TAT-CRYAB重组蛋白不仅能够减轻DSS引起的小鼠结肠炎严重程度，改善小鼠疾病活动度，还能够保护小鼠肠屏障的完整性。
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、pET28a-TAT-CRYAB重组质粒的构建；构建方法具体如下：
S1.1、购买pET28a质粒，准备pET28a载体酶切体系：pET28a载体、NheI、10xFastdigestBuffer以及DEPC水，然后将酶切体系配好，在37℃水浴锅中水浴1h，而后同上述步骤胶回；
S1.2、pET28a-TAT质粒连接；
首先将TAT的前后引物退火，退火后进行连接，体系为：10×T4buffer、T4连接酶、pET28a酶切产物以及TAT序列退火产物，体系配好后室温静置1h即可；
S1.3、而后进行pET28a-TAT质粒的转化、涂板、摇菌、提质粒以及测序，获得可用的pET28a-TAT质粒；
S1.4、将pET28a-TAT质粒再次酶切，体系如下：
pET28a-TAT质粒、10xFastDigestgreenbuffer、BamHI、EcoRI水以及DEPC水，上述体系配好后37℃水浴锅中水浴1h，而后同上述步骤胶回；
S1.5、pET28a-TAT-CRYAB质粒连接；
CRYAB前后引物先进行退火处理，而后进行T4连接酶法连接，体系为：10×T4buffer、T4连接酶、pET28a酶切产物以及CRYAB序列退火产物，体系配好后，室温静置1h即可；
S1.6、而后进行pET28a-TAT-CRYAB质粒的转化、涂板、摇菌、提质粒以及测序，获得可用的纯化pET28a-TAT质粒；
S2、pET28a-TAT-CRYAB重组蛋白的表达与纯化；具体方法如下：
S2.1、将步骤S1中制备的纯化重组质粒转化至大肠杆菌BL21，挑取转化的单菌落，在5ml含卡那霉素的LB培养基中37℃震荡培养，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导8h；
S2.2、同时用未诱导菌作对照，离心收集菌体加凝胶上样缓冲液100℃煮沸5min后，进行SDS-PAGE法检测，分离胶和浓缩胶的浓度分别为12％和5％；
S2.3、取重组质粒pET28a-TAT-CRYAB转化BL21菌种于卡那霉素LB培养基中，培养12h后取5ml扩大培养至500ml菌液，然后加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导8h；
S2.4、6000r/min离心10min收集菌体，用上样缓冲液洗涤3次，然后溶入上样缓冲液中超声破菌，6000r/min离心10min收集上清；
S2.5、2ml镍金属螯合层析柱用10ml平衡液平衡；
S2.6、上清吸附于层析柱后先用10ml平衡液洗涤，再用10ml洗脱液洗脱，收集洗脱的样品液，经PBS透析脱盐，PEG20000浓缩；
S2.7、过滤除菌，加10％甘油-80℃保存；
S2.8、用考马斯蓝染色和SDS-PAGE检验纯化效果，测定蛋白浓度，Westernblot鉴定融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法，其特征在于：所述步骤S1.1中，pET28a载体酶切体系具体如下：
3.根据权利要求1所述的一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法，其特征在于：所述步骤S1.2中，TAT的前后引物退火后连接的体系具体如下：
4.根据权利要求1所述的一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法，其特征在于：所述步骤S1.4中，pET28a-TAT质粒再次酶切的体系具体如下：
5.根据权利要求1所述的一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法，其特征在于：所述步骤S1.5中，T4连接酶法连接体系具体如下：
6.根据权利要求1所述的一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法，其特征在于：所述步骤S2.1中，震荡培养至OD600＝0.4-0.6时加入IPTG诱导8h。
7.根据权利要求1所述的一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法，其特征在于：所述步骤S2.5中，平衡液具体为0.3mol/L的Nacl、50mmol/L的Na2HPO4、10mmol/L的咪唑，且平衡液pH为8.0。
8.根据权利要求1所述的一种TAT-CRYAB融合蛋白在肠道炎症中的应用方法，其特征在于：所述步骤S2.6中，洗脱液具体为0.3mol/L的Nacl、50mmol/L的Na2HPO4、250mmol/L的咪唑，且洗脱液PH为8.0。
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