CN110551497A - 一种分子印迹量子点磷光探针的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种分子印迹量子点磷光探针的制备方法及其应用。本发明利用APTES在纳米SiO2表面加入氨基的功能，通过TGA修饰得到了富含羧基的量子点，然后以纳米SiO2为核心支撑材料，通过酰胺键合将大量的TGA‑QDs作为发光材料引入纳米SiO2表面，然后分别以CEX、TEOS、APTES、CTAB、NH3·H2O为模板分子、交联剂、功能单体、致孔剂和催化剂，通过微乳液聚合，在SiO2‑QDs表面形成印迹层，最后去除CTAB和CEX后，形成了SiO2‑QDs‑MIPs的介孔结构和特异的印迹腔。本发明所得分子印迹量子点磷光探针的检出限低、检测灵敏度高、专一性好，能够很好用于头孢氨苄的残留检测。

Description

一种分子印迹量子点磷光探针的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种分子印迹量子点磷光探针的制备方法及其应用。
背景技术
食品污染问题随着现代工业的发展变得日益严重，严重威胁着人类的身体健康，目前食品污染物的检测和监控显得尤为重要，其中农药和抗生素是影响食品安全的两大重要物质。头孢类抗生素如头孢氨苄在我国使用量较大，随之排泄的残留也较多，由于它在土壤环境和食品中较稳定，不易被降解，若长期存在于上述环境中将会严重影响食品环境的安全，容易在人体内富集从而影响人类的健康，长期摄入含有头孢氨苄残留的食品，会导致人体内敏感菌群受到抑制，菌群比例失调，消化道功能紊乱，免疫力下降；并能诱导产生耐药性菌株，对病人的诊断、治疗造成恶劣影响，若病原菌的耐药基因在人群中、动物群中、生态系统中的细菌间相互传递，则会引发严重的耐药性问题。
目前对于头孢氨苄残留的检测方法主要有HPLC-MS法、微生物检测法，免疫分析法、毛细管电泳法等，然而传统的检测方法预处理较为复杂、步骤繁琐、耗时耗力，已经渐渐不能满足对食品污染物快速、简便、准确检测的需求。此外，食品种类繁多、成分复杂，需要检测的目标物通常含量较低，需要对待测物进行分离和富集。因此，开发出选择性好、识别快速、灵敏度高的新方法用于食品污染物的检测已迫在眉捷。
量子点(quantum dots，QD)是一种由II-VI族或III-V族元素组成的、能够接受激发光产生荧光的半导体纳米晶粒。量子点具有激发光谱宽且连续、发射光谱窄且对称、发射波长可调、荧光量子产率高、光化学稳定性好等优越的荧光特性。近年来，量子点(半导体纳米粒子)在生物、医学领域的应用，极大的拓展了量子点研究的深度和广度，成为生物、医学领域最有生命力的发展方向之一。
分子印迹(又称分子模板或分子烙印)技术是指制备对目标分子具有特异性识别能力的聚合物的技术，制备的聚合物是一种具有分子识别能力的新型高分子材料，称为分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer，MIP)。制备过程是：首先模板分子(目标分子)与功能单体通过共价键或非共价键结合形成复合物，然后加入交联剂进行共聚形成聚合物，之后洗去模板分子，这样，在聚合物中就留下与模板分子大小、形状、官能团互补的孔穴，使得分子印迹聚合物与模板分子的亲和力大大增强，表现出分子识别效应。由于印迹聚合物中空腔的空间结构以及空穴中官能团的种类、数量和位点均与目标分子高度互补，因而它对目标分子的立体结构具有记忆功能。
基于分子印迹技术的量子点荧光探针的制备技术，则将分子印迹技术应用于量子点荧光探针的制备，目前，已被成功地应用于小分子的识别分析。这一类大多是应用于分子印迹荧光传感器的制备，以及一些生物小分子的检测中。然而目前对于食品中头孢氨苄的检测手段尚未有采用量子点分子印迹技术的，另一方面，以往的荧光探针检测手段容易受到荧光背景的干扰，出现抗干扰能力较差，检出限不高，灵敏度较低的缺陷，因此急需提供一种用于检测食品中头孢氨苄残留的量子点分子印迹检测方法。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种分子印迹量子点磷光探针的制备方法及其应用，以很好解决食品中头孢氨苄残留量的检测问题。该方法的检出限低、检测灵敏度高、专一性好，抗干扰能力强，重要的是，本发明提供的方法很好抵抗了背景的干扰。
本发明的目的之一是提供一种分子印迹量子点磷光探针的制备方法，其包括以下步骤：
(1)TGA-QDs的制备：制备TGA改性的Mn掺杂ZnS量子点；
(2)氨基功能化SiO2纳米粒子的制备：取体积比为3:5的乙醇-超纯水溶液，加入氨水进行混合，所述氨水与乙醇的体积比为3:1，然后向其中缓慢滴加乙醇/TEOS混合溶液，混合溶液中乙醇与TEOS的体积比4:1，室温搅拌过夜后，加入APTES，搅拌反应12h，得到氨基功能化的SiO2纳米粒子；将其用乙醇洗涤后离心三次，分散于50ml乙醇中备用；
(3)SiO2-QDs的制备：取步骤(2)所得SiO2纳米粒子溶液，加入MES缓冲液(pH＝5.2，0.1mM)，于超声波水浴中振荡10min，然后依次滴入TGA-QDs、EDC(25mg·mL-1)和NHS(25mg·mL-1)，所述TGA-QDs、EDC、NHS三者的体积比为1.5:8:4，滴加完毕后将混合物于室温下黑暗中搅拌反应12小时，于8000rpm重复离心10分钟，获得纯化后的SiO2-QDs纳米粒子，将产物分散在50mL PBS溶液(0.02M、pH 7.0)中备用；
(4)SiO2-QDs-MIPs的合成：取步骤(3)所得SiO2-QDs溶液5mL分散于15mL PBS溶液中，超声振荡10分钟，于避光条件下向其中加入50μL APTES和12.5mg CEX，搅拌30分钟，然后加入CTAB溶液(0.2M，0.8mL)和氢氧化钠溶液(0.2M，0.1mL)，搅拌30分钟后，再向其中加入0.1mL NH3·H2O和90μL TEOS，混合溶液在黑暗下搅拌过夜，所得产物用甲醇/超纯水(4:1，v/v)反复洗涤离心，直至完全去除CEX和CTAB，于262nm下进行紫外光谱测定，获得印迹介孔结构磷光探针SiO2-QDs-MIPs，将其分散在20mL的超纯水中备用。
本发明的上述制备方法充分利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)在纳米SiO2表面加入胺的功能，通过巯基乙酸(TGA)修饰得到了富含羧基的量子点，然后以纳米SiO2为核心支撑材料，通过酰胺键合将大量的巯基乙酸修饰的量子点(TGA-QDs)作为发光材料引入纳米SiO2表面，然后分别以头孢氨苄(CEX)、正硅酸乙酯(TEOS)、APTES、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、NH3·H2O为模板分子、交联剂、功能单体、致孔剂和催化剂，通过微乳液聚合的方法，在SiO2-QDs表面形成印迹层，最后去除CTAB和CEX后，形成了分子印迹量子点磷光探针(SiO2-QDs-MIPs)的介孔结构和特异的印迹腔。
采用真实食品样品检验SiO2-QDs-MIPs检测CEX的实用性，并采用HPLC-UV进行对照试验。所得结果表明本发明制备得到的分子印迹量子点磷光探针其检出限低、检测灵敏度高、专一性好，抗干扰能力强，能够很好用于食品中头孢氨苄的残留检测。
进一步的是，步骤(1)中所述TGA改性的Mn掺杂ZnS量子点的制备方法如下：于三颈烧瓶中加入ZnSO4溶液和MnCl4溶液，所述ZnSO4溶液与MnCl4溶液的摩尔浓度比为12.5:1，然后加入TGA(2mL)，混合溶液在氮气保护下搅拌20分钟，然后向混合物中缓慢注入0.25mmol/mL的Na2S·9H2O溶液，搅拌30min后，于50℃水浴陈化2h，形成TGA改性Mn:ZnS QDs，即TGA-QDs，将制备好的TGA-QDs重复离心，用超纯水和乙醇洗涤三次，分散于超纯水中(50ml)备用。
进一步的是，步骤(2)中所述乙醇-超纯水溶液中乙醇的体积用量为30mL，超纯水的体积用量为50mL。
进一步的是，步骤(2)中乙醇/TEOS混合溶液中乙醇的体积为20mL，TEOS的体积为5mL。
进一步的是，步骤(2)中所述APTES的添加量为5mL。
进一步的是，步骤(3)中所述SiO2纳米粒子溶液的体积为5mL，MES缓冲液的体积为45mL。
进一步的是，步骤(3)中所述TGA-QDs溶液的体积为1.5mL，EDC溶液的体积为8mL、NHS溶液的体积为4mL。
本发明的目的之二是提供由上述方法制备得到的分子印迹量子点磷光探针。
本发明的目的之三是提供上述分子印迹量子点磷光探针在检测食品中头孢氨苄残留方面的应用。
具体的，在进行头孢氨苄残留量检测时，所述分子印迹量子点磷光探针的检测条件为：检测pH 6-9，检测时间30min。
本发明的有益效果如下：
(1)提供了一种分子印迹量子点磷光探针的制备方法，采用水相共沉淀法制备QDs，很好解决了油相制备的QDs量子点水溶性较差，毒性较大的缺点，同时采用表面修饰提高发光效率和化学稳定性；通过优化后的磷光探针合成方法，提高了磷光探针的印迹容量和对头孢氨苄的特异性识别能力；
(2)该探针可用于牛奶和奶粉中CEX残留的检测。检测结果与HPLC-UV法检测结果吻合较好，并优于HPLC-UV检测灵敏度。该方法选择性好、灵敏度高、成本低、反应快，可用于食品质量监测和市场监测，能够很好解决普通吸附剂吸附的盲目性，提高检测选择性，并充分利用量子点的独特光学性质以提高检测灵敏度，实现对复杂食品基质中痕量头孢氨苄的分析；
(3)本发明提供的磷光探针用于食品中头孢氨苄残留的浓度检测范围为2.5～50μg·L-1，检出限LOD最低浓度为0.81μg·L-1，回收率为91.7-103.7％。
附图说明
图1为TGA-QDs的TEM图像(a,c)、粒径分布图(b)和XRD光谱(d)；
图2为透射电镜图像(a)SiO2、(b)SiO2-QDs-NIPs和(c,d)SiO2-QDs-MIPs；(e)SiO2、(f)SiO2-QDs、(g)SiO2-QDs-NIPs和(h)SiO2-QDs-MIPs的SEM图像；
图3为(A)TGA-QDs(A)、SiO2-QDs(b)、SiO2-QDs-MIPs(c)、SiO2(d)的XRD图谱；(B)(a)TGA-QDs、(B)SiO2-QDs、(c)SiO2-QDs-MIPs和(d)SiO2的FT-IR光谱；
图4为(A)TGA-QDs的紫外吸收(A)、SiO2-QDs-MIPs激发光谱(b)、CEX(d)去除前后SiO2-QDs-MIPs的磷光发射光谱(c)、SiO2-QDs-NIPs(e)、Mn能级示意图:ZnS QDs(插图)；(B)SiO2-QDs-NIPs/MIPs的光致发光照片；
图5为(A)120min内SiO2-QDs-MIPs的磷光强度变化；(B)SiO2-QDs-MIPs浓度对系统磷光强度的影响；(C)pH对SiO2-QDs-MIPs(a)和SiO2-QDs-MIPs+CEX混合体系磷光强度的影响(b)；(D)SiO2-QDs-MIPs对CEX的磷光响应时间；
图6为SiO2-QDs-MIPs(A)和SiO2-QDs-NIPs(B)的磷光发射光谱(插图:相应的SiO2-QDs-MIPs和SiO2-QDs-NIPs的室温磷光强度线性图)；
图7为(A)SiO2-QDs-MIPs和SiO2-QDs-NIPs对同一浓度不同种类的抗生素的选择性以及每种抗生素的化学结构；(B)头孢曲松钠(CRO)对SiO2-QDs-MIPs+CEX室温磷光强度的影响；
图8为(A)QDs室温磷光淬灭的Stem-Volmer方程和Lineweaver-Burk方程图；(B)基于电子传递诱导能量传递的QDs室温磷光淬火机理示意图；
图9为从标准物质(A)、原料奶(b)和奶粉(c)中提取的在不同浓度(5μg·L-1、10μg·L-1和15μg·L-1)CEX的HPLC-UV色谱；(B)SiO2-QDs-MIPs与HPLC-UV法测定食品样品中CEX的相关性；
图10为实施例中介孔结构SiO2-QDs-MIPs磷光探针的制备原理图及头孢氨苄的传感机理图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
氨基功能化SiO2纳米粒子的制备：
在250mL圆底烧瓶中加入30mL乙醇和50mL超纯水，磁力搅拌下加入NH3·H2O(10mL)。然后用恒压漏斗向烧瓶中滴加乙醇(20ml)和TEOS(5ml)的混合物，室温下搅拌过夜。加入APTES(5mL)后，不断搅拌下反应12h，得到氨基功能化的二氧化硅纳米粒子，将其在乙醇洗涤下至少离心三次，分散在50ml乙醇中备用。
实施例2
TGA改性的Mn掺杂ZnS量子点(TGA-QDs)的合成：
于250mL三颈烧瓶中加入6.25mmol ZnSO4和0.5mmol MnCl4以及100mL超纯水，充分搅拌混合，然后加入TGA(2mL)，将混合溶液在氮气保护下搅拌20分钟，然后向混合物中缓慢注入含6.25mmol溶质的Na2S·9H2O溶液25mL，搅拌30min后，于50℃水浴陈化2h，形成TGA改性Mn:ZnS QDs，即TGA-QDs，将制备好的TGA-QDs重复离心，用超纯水和乙醇洗涤三次，分散于超纯水中(50ml)备用。
实施例3
SiO2-QDs的制备：
取实施例2所得SiO2纳米粒子溶液，加入MES缓冲液(pH＝5.2，0.1mM)，于超声波水浴中振荡10min，然后依次滴入TGA-QDs、EDC(25mg·mL-1)和NHS(25mg·mL-1)，所述TGA-QDs、EDC、NHS三者的体积用量分别为1.5mL、8mL、4mL，滴加完毕后将混合物于室温下黑暗中搅拌反应12小时，于8000rpm重复离心10分钟，获得纯化后的SiO2-QDs纳米粒子，将产物分散在50mL PBS溶液(0.02M、pH 7.0)中备用。
实施例4
SiO2-QDs-MIPs的合成：
取实施例3所得SiO2-QDs溶液5mL分散于15mL PBS溶液中，超声振荡10分钟，于避光条件下向其中加入50μL APTES和12.5mg CEX，搅拌30分钟，然后加入CTAB溶液(0.2M，0.8mL)和氢氧化钠溶液(0.2M，0.1mL)，搅拌30分钟后，再向其中加入0.1mL NH3·H2O和90μLTEOS，混合溶液在黑暗下搅拌过夜，所得产物用甲醇/超纯水(4:1，v/v)反复洗涤离心，直至完全去除CEX和CTAB，于262nm下进行紫外光谱测定，获得印迹介孔结构磷光探针SiO2-QDs-MIPs，将其分散在20mL的超纯水中备用。
测试例1
在相同条件下测定了SiO2-QDs-MIPs的各项光学性能，便于分析。具体方法为：扫描波长范围为500-700nm，激发波长295nm。为了研究激发光谱，将发射波长设置为590nm，记录激发范围为200-400nm。
将上述SiO2-QDs-MIPs原液按不同倍数稀释作为试验溶液，然后将PBS溶液(0.02M，pH值7.0)、SiO2-QDs-MIPs和CEX溶液(2.5-50μg·L-1)添加到一系列2mL塑料离心管中，将混合物经超声处理分散后，加入超纯水体积至2mL，轻柔旋转孵育30min后，记录各管的室温磷光强度(RTP)，并检测SiO2-QDs-NIPs的室温磷光。
测试例2
采用真实食品样品检验SiO2-QDs-MIPs用于检测CEX的实用性，并采用HPLC-UV进行对照试验。具体方法如下：
将5mL已知浓度CEX的添加原料乳样品(或0.5g奶粉样品和4mL超纯水)转移到50mL聚丙烯离心管中，并加入20mL乙腈对其进行脱蛋白处理。搅拌1分钟，8000rpm离心10分钟，重复提取2次，收集上清液。随后，将上清液于40℃蒸发至干燥，再用2.0mL超纯水溶解后用0.22μm过滤膜过滤，最后将滤液分为两部分，一部分用于SiO2-QDs-MIPs，另一部分用于HPLC-UV检测。
(一)TGA-QDs的表征结果如图1：从图1可知，TGA-QDs几乎是球形颗粒，尺寸大约为2～6nm(图1a和b)，TGA-QDs的HRTEM图像显示的晶面间距为0.34nm(图1c)，与现有文献中提到的Mn:ZnS纳米晶的晶面间距基本吻合。XRD谱图(图1d)为(111)、(220)、(311)平面的立方结构，呈现出与闪锌矿相(JCPDSC No.77-2100)相对应的所有衍射峰，进一步验证了TGA-QDs的成功制备。
(二)SiO2-QDs-MIPs的表征结果如图2：研究了SiO2-QDs-MIPs的结构和光学性能，首先用透射电镜和扫描电镜对探针的形貌进行了表征，这些纳米颗粒均表现出良好的分散性和高度均匀的球形形貌。在尺寸上，SiO2(图2a,e)为150～180nm,SiO2-QDs(图2f)相似。这是因为QDs的粒径非常小，QDs与SiO2的结合几乎没有引起SiO2粒径的变化。SiO2-QDs-NIPs/MIPs具有明显的核-壳结构，平均直径为250-300nm(图2b和c)，核直径约为160nm，与SiO2-QDs的直径一致(图2d)。由于模板分子CEX对印迹层的影响，SiO2-QDs-MIPs表面比SiO2-QDs-NIPs表面粗糙。因此，成功地合成了包覆SiO2-QDs的印迹层。
与TGA-QDs(图3A曲线a)相比，QDs接枝到SiO2表面后XRD谱发生了显著变化，表现出典型的宽硅胶峰(图3A曲线b)。SiO2-QDs、SiO2-QDs-NIPs/MIPs(图3A中的曲线b、c、d)的ZnS特征衍射峰强度较TGA-QDs弱。这可能与印迹壳层和非晶态材料(SiO2)有关，进一步证明了印迹层存在于SiO2-QDs表面。
为了进一步确定印迹层是否存在于SiO2-QDs上，对这些FT-IR光谱进行了比较。TGA-QDs在1384cm-1和1575cm-1处的吸收峰(图3B中的曲线a)分别归因于COO-反对称和对称拉伸振动。在1121cm-1和3405cm-1处的特征峰归属于O-H拉伸和C-O拉伸。SiO2的FT-IR光谱(图3B中曲线d)在471cm-1和799cm-1处出现特征峰，属于Si-O反对称拉伸振动，1096cm-1处的吸收峰属于Si-O-Si的不对称拉伸振动。SiO2的这些特征峰也可以在SiO2-QDs和SiO2-QDs-MIPs的FT-IR光谱中观察到，说明这些材料中存在SiO2基体。同时，在1632cm-1和3350cm-1处的峰值分别对应于酰胺C＝O键和N-H键的拉伸振动，表明SiO2表面被氨基修饰成功。将TGA-QDS接枝到SiO2上(图3B曲线b)后，特征峰1575cm-1减弱，分别出现了1632cm-1处的C＝O和1400cm-1处的C-N伸缩振动峰。这表明羧基与氨基反应形成酰胺键。从SiO2-QDs-MIPs的FT-IR光谱(图3B曲线c)可以看出，酰基氨基和SiO2明显减弱，没有其他杂质峰，说明印迹层是在SiO2-QDs表面制备并涂覆的。
SiO2-QDs-MIPs的最大激发波长为295nm，最大发射波长为590nm(图4A中的曲线b和d)。如能级图所示，其中hv1为缺陷态(Zn空位、S空位、表面态)引起的蓝绿色荧光；hv2是橙色磷光，这是由于Mn2+离子在Td对称中的4T1→6A1跃迁所致。在激发光的作用下，ZnS矩阵中的电子和空穴被分离，然后被Mn2+捕获。电子与空穴的复合引起Mn2+的激发，然后以磷光的形式释放能量。
如图4B所示，CEX去除前SiO2-QDs-MIPs的磷光强度较弱。与乙醇多次离心后，其磷光强度恢复良好，发射光谱的形状和位置与SiO2-QDs-NIPs的发射光谱一致(图4A中的曲线e、d、c)。同时，SiO2-QDs-MIPs的磷光强度几乎恢复到SiO2-QDs-NIPs的磷光强度，验证了CEX已经从识别腔中去除。
实验例1
实验的重复性取决于SiO2-QDs-MIPs的磷光稳定性。在最大发射峰值下，每10分钟检测一次室温磷光强度。如图5A所示，室温磷光强度变化不大，表明其具有良好的物理稳定性和化学惰性，其原因可以归结为硅胶壳和量子点表面的印迹壳，它们可以保护量子点不受混合溶液的影响，从而使量子点的磷光强度保持稳定。
SiO2-QDs-MIPs的浓度也有助于提高检测效率。在低浓度条件下，虽然可以得到较大的淬灭，且具有较好的灵敏度，但线性范围较窄；而高浓度则会降低淬灭速率。为了确定合适的SiO2-QDs-MIPs浓度，使用不同稀释倍数的SiO2-QDs-MIPs检测CEX，并选择40倍作为后续研究的最佳稀释倍数(图5B)。
然后，研究了pH对SiO2-QDs-MIPs和SiO2-QDs-MIPs+CEX混合体系磷光强度的影响，结果如图5C所示。当培养基pH值低于6.0时，SiO2-QDs-MIPs的室温磷光强度因强酸条件下降，影响分子印迹微球的表面环境。pH在6.0～9.0之间时，室温磷光强度保持稳定(图5C曲线a)。此外，SiO2-QDs-MIPs的室温磷光淬灭速率随pH值的增加而先升高，在pH＝7时达到最大值。此外，pH值增加，SiO2-QDs-MIPs的P0/P值降低(图5C中的曲线b)。其原因可能是在强碱性溶液中，极性分子与被分析物CEX或SiO2-QDs-MIPs表面的识别位点形成氢键，降低了SiO2-QDs-MIPs对CEX的识别和保留能力。考虑到SiO2-QDs-MIPs具有良好的室温磷光强度、淬灭速度以及在食品样品中的应用前景，选择pH 7.0作为下一步实验的pH。
为保证CEX与SiO2-QDs-MIPs的识别位点充分结合，从0～120min研究其响应时间的影响，并记录不同时间间隔的P0/P值来显示结果。如图5D所示，在初始30min，P0/P值随着时间的增长而上升，直到曲线达到平衡。因此，SiO2-QDs-MIPs对CEX检测具有良好的传质率和识别可达性，最佳检测时间为30min。
不同浓度CEX下探针的磷光光谱如图6所示。随着CEX浓度的增加，SiO2-QDs-MIPs的RIP强度明显减弱，而相应CEX浓度下SiO2-QDs-NIPs的室温磷光淬灭效果不明显。这是由于SiO2-QDs-NIPs中缺乏特异性的识别位点，CEX只能接触SiO2-QDs-NIPs表面上的QDs，无法进入其内部，因此RIP淬灭强度较小。调查显示良好的线性浓度范围为2.5～50μg·L-1，线性方程(P0/P-1)＝0.3037CCEX+0.0477(R＝0.9985)，检出限(3σ/K)0.81μg·L-1。所有结果表明，SiO2-QDs-MIPs对CEX具有预先确定的选择性识别位点，因此显著提高了CEX的淬灭效率和光谱灵敏度。因此，本发明方法可以对CEX进行高灵敏度、高精度的识别和检测。
干扰试验结果表明，食品中常见的一些金属离子和生物分子在检测CEX时不影响SiO2-QDs-MIPs的室温磷光强度。本发明利用几种抗生素(头孢曲松钠、阿莫西林和氨苄西林)对SiO2-QDs-MIPs的选择性进行了评价，其中CEX的室温磷光淬灭效率最高(图7A)。与SiO2-QDs-MIPs相比，SiO2-QDs-NIPs与头孢曲松钠、阿莫西林、氨苄西林在室温磷光淬灭效率上无明显差异。
然后计算印迹因子(IF)，由KSV,MIPs与KSV,NIPs比值来定义，评估探针的选择性(表1)。结果表明，CEX中SiO2-QDs-MIPs的IF值最大(IF＝3.34)。
选择头孢曲松钠作为竞争实验的反应底物，进一步测试SiO2-QDs-MIPs的选择性。制备了不同配比的SiO2-QDs-MIPs+CEX+CRO混合溶液。与SiO2-QDs-NIPs相比，随着CCRO/CCEX比值的增加，SiO2-QDs-MIPs的室温磷光强度变化不明显(图7B)。上述现象可以解释为，在SiO2-QDs-MIPs的印迹壳层中，在制备过程中形成了大小、形状和空间排列都与模板分子互补的印迹腔。因此，CEX可以与SiO2-QDs-MIPs牢固结合，导致室温磷光淬灭，而头孢曲松钠与识别位点不匹配，可达性较低，不能有效猝灭SiO2-QDs-MIPs的磷光。
实验例2
为了研究SiO2-QDs-MIPs在食品样品中的适用性，评估了测定牛奶和奶粉中CEX的回收率试验。样品制备同上。如表2所示，加标样品的回收率为91.7～103.7％。SiO2-QDs-MIPs与HPLC-UV分析结果相关性较好，测定系数(R2)大于0.98(图9)，回收率优于HPLC-UV分析(86.5-105.2％)。结果表明，该方法对食品样品中CEX的检测具有较好的准确度和精密度。与其他报道的方法相比，该方法在线性范围和检出限方面都有一定的优势(表3)，而且与色谱法相比，该方法不需要复杂的预处理程序、昂贵的仪器和任何有毒有机溶剂作为流动相。此外，与其它方法相比，该方法采用分子印迹技术具有更好的选择性。与此同时，基于荧光量子点的方法具有较强的抗干扰能力和较高的灵敏度。因此，该方法对实际样品CEX的检测具有较高的实用价值。

Claims (10)

1.一种分子印迹量子点磷光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)TGA-QDs的制备：制备TGA改性的Mn掺杂ZnS量子点；
(2)氨基功能化SiO2纳米粒子的制备：取体积比为3:5的乙醇-超纯水溶液，加入氨水进行混合，所述氨水与乙醇的体积比为3:1，然后向其中缓慢滴加乙醇/TEOS混合溶液，混合溶液中乙醇与TEOS的体积比4:1，室温搅拌过夜后，加入APTES，搅拌反应12h，得到氨基功能化的SiO2纳米粒子；将其用乙醇洗涤后离心三次，分散于50ml乙醇中备用；
(3)SiO2-QDs的制备：取步骤(2)所得SiO2纳米粒子溶液，加入MES缓冲液(pH＝5.2，0.1mM)，于超声波水浴中振荡10min，然后依次滴入TGA-QDs、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC,25mg·mL-1)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,25mg·mL-1)，所述TGA-QDs、EDC、NHS三者的体积比为1.5:8:4，滴加完毕后将混合物于室温下黑暗中搅拌反应12小时，于8000rpm重复离心10分钟，获得纯化后的SiO2-QDs纳米粒子，将产物分散在50mL PBS溶液(0.02M、pH 7.0)中备用；
(4)SiO2-QDs-MIPs的合成：取步骤(3)所得SiO2-QDs溶液5mL分散于15mL PBS溶液中，超声振荡10分钟，于避光条件下向其中加入50μL APTES和12.5mg CEX，搅拌30分钟，然后加入CTAB溶液(0.2M，0.8mL)和氢氧化钠溶液(0.2M，0.1mL)，搅拌30分钟后，再向其中加入0.1mLNH3·H2O和90μL TEOS，混合溶液在黑暗下搅拌过夜，所得产物用甲醇/超纯水(4:1，v/v)反复洗涤离心，直至完全去除CEX和CTAB，于262nm下进行紫外光谱测定，获得印迹介孔结构磷光探针SiO2-QDs-MIPs，将其分散在20mL的超纯水中备用。
2.根据权利要求1所述的分子印迹量子点磷光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述TGA改性的Mn掺杂ZnS量子点的制备方法如下：于三颈烧瓶中加入ZnSO4溶液和MnCl4溶液，所述ZnSO4溶液与MnCl4溶液的摩尔浓度比为12.5:1，然后加入TGA(2mL)，混合溶液在氮气保护下搅拌20分钟，然后向混合物中缓慢注入0.25mmol/mL的Na2S·9H2O溶液，搅拌30min后，于50℃水浴陈化2h，形成TGA改性Mn:ZnS QDs，即TGA-QDs，将制备好的TGA-QDs重复离心，用超纯水和乙醇洗涤三次，分散于超纯水中(50ml)备用。
3.根据权利要求1所述的分子印迹量子点磷光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述乙醇-超纯水溶液中乙醇的体积用量为30mL，超纯水的体积用量为50mL。
4.根据权利要求1所述的分子印迹量子点磷光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中乙醇/TEOS混合溶液中乙醇的体积为20mL，TEOS的体积为5mL。
5.根据权利要求1所述的分子印迹量子点磷光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述APTES的添加量为5mL。
6.根据权利要求1所述的分子印迹量子点磷光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述SiO2纳米粒子溶液的体积为5mL，MES缓冲液的体积为45mL。
7.根据权利要求1所述的分子印迹量子点磷光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述TGA-QDs溶液的体积为1.5mL，EDC溶液的体积为8mL、NHS溶液的体积为4mL。
8.根据权利要求1-7任一项所述方法制备得到的分子印迹量子点磷光探针。
9.根据权利要求8所述分子印迹量子点磷光探针在检测食品中头孢氨苄残留方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述分子印迹量子点磷光探针的检测条件为：检测pH 6-9，检测时间30min。
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