CN110542760A

CN110542760A - 一组表达受药物dl-PHPB调节的大脑蛋白

Info

Publication number: CN110542760A
Application number: CN201910761702.4A
Authority: CN
Inventors: 高洪伟; 孙英妮
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Ludong University
Priority date: 2019-08-19
Filing date: 2019-08-19
Publication date: 2019-12-06

Abstract

本发明公开了一组表达受药物dl‑PHPB调节的大脑蛋白，dl‑PHPB处理可显著改变AD模型小鼠大脑皮层和海马组织中如下一组蛋白的表达：histidine triad nucleotide‑binding protein 1、fatty acid‑binding protein、pyruvate dehydrogenase E1 component subunitα(PDHE1α)、peroxiredoxin‑6、cathepsin B、isocitrate dehydrogenase、dihydropyrimidinase‑related protein 2(DRP‑2)、dihydrolipoamide succinyltransferase、dihydropyrimidinase‑related protein 5(DRP‑5)、peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase NIMA‑interacting 1(Pin 1)、voltage‑dependent anion‑selective channel protein 1(VDAC1)、carbonic anhydrase 2、malate dehydrogenase、α‑enolase、cofilin‑2。

Description

一组表达受药物dl-PHPB调节的大脑蛋白

技术领域

本发明属于医学技术领域，涉及药物dl-PHPB对认知功能损伤的大脑皮层和海马组织蛋白表达的影响。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，俗称老年痴呆，是一种与年龄相关的神经退行性疾病，其发病机理目前尚不清楚，现存在多种假说：神经递质缺陷、炎症、自由基损伤、淀粉样蛋白神经毒性作用、激素缺乏、细胞凋亡等。此外，环境因素如文化、教养、吸烟、脑外伤、重金属接触史、低龄怀孕和病毒感染等均可增加患AD风险。目前，AD的治疗仍以药物为主，包括乙酰胆碱、胆碱酯酶抑制剂和促乙酰胆碱释放药物、抗炎药物、雌激素类药物、抗氧化药物及脑代谢激活剂等。这些药物只能暂时缓解AD患者的症状，但不能延缓或阻断病程的进展。

2-(α-羟基戊基)苯甲酸盐(Potassium 2-(1-Hydroxypentyl)-benzoate，dl-PHPB)是临床用抗缺血性脑卒中药物丁基苯酞(3-n-butylphathlide，dl-NBP)的前体。dl-PHPB在体内可通过生物酶系统作用转化为dl-NBP而发挥药效。dl-NBP是国家食品药品监督管理局于2002年批准的一类抗缺血性脑卒中新药，能够改善脑卒中患者缺血区脑梗塞体积，改善局部缺血引起的脑水肿以及改善缺血区能量代谢和软脑膜微循环障碍等。但dl-NBP是高沸点油状物无法制备有效的注射剂型，不适用于重症无法口服的患者，而其内酯环开环产物dl-PHPB具有较好的水溶性，可制成多种剂型，且dl-PHPB为固体结晶，经重结晶后可以纯化，易于大量制备，方便保存。dl-PHPB作为新型的抗脑缺血候选药物，能改善缺血区脑血流量，抑制自由基的产生，提高胆碱乙酰转移酶的活性及减少胶质细胞的活化，这些作用环节均与AD的发生密切相关。前期研究显示dl-PHPB对慢性脑低灌注大鼠、Aβ致痴呆小鼠及APP/PS1转基因小鼠的学习记忆均有明显改善作用。为进一步研究dl-PHPB的抗AD作用机制，明确dl-PHPB的抗AD作用靶点，我们利用药物蛋白质组学方法观察dl-PHPB对认知损伤的大脑皮层和海马组织蛋白表达的影响。

蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，主要是在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律，从生命本质的层次上研究生命活动的规律以及重要的生理与病理现象。由于药物的作用机制都直接或间接与蛋白质相关，因此，蛋白质组学在药物研究中具有重要意义。药物蛋白质组学主要指应用蛋白质组学的方法研究蛋白表达水平上药物对疾病的作用效果。通过比较药用活性化合物处理(治疗)前后，模型细胞或组织的蛋白质组的表达差异并鉴定发生了相应变化的蛋白质，可揭示药物的作用机理并进行新药筛选；通过对耐药和对药物敏感的致病菌蛋白质组的比较分析，可揭示致病菌耐药机制以及设计新的治疗药物。此外，药物蛋白质组学也可用于发现新的药靶蛋白及进行药物的毒理学研究等。

蛋白质组学技术的发展为dl-PHPB抗AD作用靶点的发现、作用机制的探索提供了可能性。因此，我们选用APP/PS1双转基因小鼠作为AD模型，从蛋白质组角度出发，采用双向凝胶电泳技术和质谱分析技术等蛋白质组学手段，研究AD模型小鼠经dl-PHPB干预前后皮层及海马组织蛋白表达的差异改变，以期在蛋白表达水平上阐明dl-PHPB抗AD的可能的作用机制及作用靶点。美金刚是NMDA受体拮抗剂，多奈哌齐是胆碱酯酶抑制剂，它们是目前临床上治疗AD的常用药物。在本研究中，我们也考察了美金刚和多奈哌齐给药后转基因小鼠脑组织中上述差异蛋白的表达情况，从而比较dl-PHPB和现有阳性药的药理作用靶点是否有相似之处，找到可用于新药设计的新的药物靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一组表达受药物dl-PHPB调节的大脑蛋白。本发明所采用的技术方案是选用APP/PS1双转基因小鼠作为AD模型，从蛋白质组角度出发，采用双向凝胶电泳技术和质谱分析技术(LC-MS/MS)等蛋白质组学手段，研究AD模型小鼠经dl-PHPB干预前后皮层及海马组织整个蛋白质组的差异改变。其特征在于：dl-PHPB可显著改变认知损伤小鼠大脑皮层和海马组织中如下一组蛋白的表达：histidine triad nucleotide-bindingprotein 1、fatty acid-binding protein、pyruvate dehydrogenase E1componentsubunitα(PDHE1α)、peroxiredoxin-6、cathepsin B、isocitrate dehydrogenase、dihydropyrimidinase-relatedprotein 2(DRP-2)、dihydrolipoamidesuccinyltransferase、dihydropyrimidinase-relatedprotein 5(DRP-5)、peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1(Pin 1)、voltage-dependent anion-selective channel protein 1(VDAC1)、carbonic anhydrase 2、malate dehydrogenase、α-enolase、cofilin-2。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

1.实验动物

雄性B6C3-Tg(APPswe，PSEN1dE9)85Dbo/J(APP/PS1)转基因小鼠，同龄野生型(WT)小鼠，购自美国Jackson Lab公司，并在南京大学模式动物中心进行保种，繁育、饲养及基因型鉴定。当小鼠饲养至9月龄时，在清洁级包装内空运至实验中心，每3-5只放置一笼，室温保持在24±1℃，湿度50-60％，每日8:00-20:00光照，20:00-次日8:00关闭关照，自由进食和饮水。

2.实验方法

动物随机分为5组，每组8-10只，分别为对照组(WT小鼠)，模型组(APP/PS1小鼠)和dl-PHPB治疗组(APP/PS1小鼠)、美金刚治疗组(APP/PS1小鼠)、多奈哌齐治疗组(APP/PS1小鼠)，治疗组小鼠根据组别每天灌胃给予dl-PHPB(30mg/kg)，美金刚(30mg/kg)，多奈哌齐(30mg/kg)，对照组和模型组小鼠每天给予等体积去离子水，连续灌胃90天后，采用Morris水迷宫测试小鼠定位航行及空间搜索等学习记忆和记忆保持能力。之后处死动物，取材。

Morris水迷宫方法如下：实验在隔音、非直射光、较暗的房间内进行，水池位置、房间明暗度等各种实验条件保持不变。预先在水池中注入自来水，水深20cm，且水面高出平台表面1cm(使小鼠不能见到平台)，因为小鼠为黑颜色，为了便于记录，水池中加入约500g奶粉，搅拌均匀，使水池中的水呈乳白色，水温控制在21±2℃，平台位于第二象限的中央。实验共进行5天，每天随机选取入水点，共进行4次实验，将小鼠头朝池壁入水，同时摄像机开始记录，找到平台的小鼠在平台上停留30s，经60s未找到平台者，将其引领至平台，放置30s，引导其学习记忆。数据采集及图像分析均由图像自动监视和处理系统完成。实验结束，记录各组动物到达平台的逃避潜伏期、游泳路程及速度。

蛋白质组分析和质谱鉴定方法如下：

2.1皮层及海马组织总蛋白的制备

小鼠断头处死后快速取出全脑，冰浴中迅速分离海马和皮层。每只小鼠海马加入300μl预冷的蛋白裂解液，采用超声破碎(60w，6s×4次，间隔30s)方法制备组织匀浆；每只小鼠皮层加入1ml预冷的蛋白裂解液，采用电动匀浆(12,000g，6s×4次，间隔30s)方法制备组织匀浆。离心(1,000g×10min，2次)，上清液即为总蛋白，以上操作均在4℃进行。用2-DQuant Kit试剂盒测定蛋白浓度，分装，-80℃保存备用。

2.2双向电泳

2.2.1等电聚焦

银染上样量为120μg/胶条，Blue Silver胶体考染法上样量为1mg/胶条。上样蛋白与水化液充分混合，总体积为350μl，加入IPG胶条槽，用pH 3-10NL，18cm干胶条，胶面向下覆盖其上，加覆盖液后置于IPG phor电极板上，水化和聚焦过程均在20℃进行，参数如下:

Immobiline dry strip IEF parameters for IPGphor isoelectric focusingsystem.

2.2.2平衡

等电聚焦结束后，将IPG胶条依次放入10ml平衡液A(6M Urea,30％Glycerol，2％SDS，50mM Tris-HCl pH 8.8，0.002％Bromophenol blue，临用前加0.2％DTT)和平衡液B(6M Urea，30％Glycerol，2％SDS，50mM Tris-HCl pH 8.8，0.002％Bromophenol blue，临用前加2.5％Iodoacetamide)中各平衡15min。

2.2.3SDS-PAGE

第二相垂直SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE)，将平衡好的IPG胶条经去离子快速润洗后，移至200×200×1.0mm³的12.5％的均匀分离胶上，用1％琼脂糖封胶固定，先以2W/胶恒功率电泳1h，之后以15W/胶电泳恒功率电泳至溴酚蓝前沿距底边约1.5cm处。

2.2.4染色

(1)银染——分析型凝胶用银染法检测，检测步骤依据GE healthcare公司银染试剂盒说明书，具体步骤如下：

以上各步骤在20℃振荡下进行。

(2)考染——制备型凝胶用Blue Silver胶体考染法检测，具体步骤如下：

2.2.5凝胶扫描和图像分析

利用Umax扫描仪以300bpi分辨率扫描染色后的凝胶，用ImageMaster 2DPlatinum Software 7.0对图象进行点检测、背景消减、二维校正、点配对，差异点的分析、筛选，以及数据保存。差异点的筛选标准为：通过比较蛋白点的相对灰度值(即volume％值)，当Ratio值≥2，即变化率为2倍或2倍以上的蛋白为差异蛋白。

2.3胶内酶解及质谱分析(LC-MS/MS)

具体过程如下：需要鉴定的双向蛋白点被切成大约1mm³左右的胶粒并转移至1.5mlAxygen EP管中。在EP管中加入100μl脱色液(100mM碳酸氢铵与纯乙腈按照1:1的体积比混合)置于涡旋混合器上振荡大约30min直至大部分蓝色脱去(此步操作将根据具体脱色程度进行重复)。弃去脱色液，在EP管中加入500μl纯乙腈并在室温振荡进行脱水直至胶粒皱缩变白。待乙腈挥发后，在EP管中加入适量20mM DTT置于56℃水浴中还原30min，冷却至室温后加入55mM碘乙酰胺避光进行烷基化反应20min。反应完毕后加入纯乙腈再次对胶粒进行脱水，并加入适量的胰蛋白酶覆盖脱水后的胶粒使胰酶溶液充分吸入胶粒。将EP管置于37℃的恒温振荡器上孵育过夜。酶解后的胶粒通过100μl的肽段提取液(5％的甲酸与纯乙腈按照1:2的体积比进行混合)进行抽提。抽提液置于旋转干燥仪上浓缩至大约20μl。浓缩后的肽段抽提液通过C18-HPLC偶联的液质联用质谱仪LTQ进行分析。通过Xcalibur软件包中的EXTRACTMS程序自动进行“峰值列表(peak list)”的生成，并且只有总离子流强度高于500的MS/MS图谱被用于搜索数据库NCBI RefSeq mouse，检索软件为Bioworks3.31软件包中的TurboSEQUEST算法。设定的具体检索参数为：i)母离子碎片质量误差为2.0amu；ii)子离子碎片质量误差为1.0amu；iii)允许最多2个不完全酶切位点；iv)设定固定修饰为半胱氨酸巯基羧甲基化修饰(增加质量57.02amu)，设定可变修饰为蛋氨酸氧化修饰(增加质量15.99amu)。通过对检索结果进行筛选，符合下列要求的肽段被认为是正确鉴定的蛋白：i)+1价，+2价及+3价肽段的Xcorr系数分别高于1.8，2.2，3.0；ii)最佳匹配肽段的Δ相关系数必须大于0.1；iii)Sp值必须高于500。正确鉴定的蛋白需要包含至少两个不同的肽段，所有鉴定到蛋白的二级质谱的b，y离子系列都通过手动进行验证。

3.结果统计及分析：

所有结果以mean±SEM数据表示。蛋白质组学差异点分析采用GE Healthcare公司的统计软件，结果以Ratio值≥2，Student ttest<0.05为有意义的差异蛋白；其它比较实验采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，结合Dunnett's post hoc test检验，比较各组间差异，p<0.05认为存在显著性差异。

Morris水迷宫实验结果显示，小鼠游泳速度各组之间无明显变化，说明小鼠各组之间身体健康状况无明显差别。随训练时间增加，各组小鼠寻找到隐蔽平台的潜伏期均逐渐下降，对照组小鼠的潜伏期从47.15±2.99s减少到24.68±2.79s，而模型组小鼠潜伏期从51.06±2.53s降低至35.10±2.35s，相比同龄野生型小鼠显著延长(p<0.01)，提示AD转基因小鼠有明显的学习记忆缺失。而给药后，dl-PHPB治疗组潜伏期降为26.16±2.92s，美金刚治疗组潜伏期降为28.12±2.25s，多奈哌齐治疗组潜伏期降为29.03±2.01s，提示dl-PHPB对APP/PS1转基因小鼠的学习记忆缺失有明显的改善作用。

利用药物蛋白质组学方法，以APP/PS1双转基因小鼠为AD动物模型，采用双向凝胶电泳技术与质谱技术(LC-MS/MS)相结合的方法分析dl-PHPB给药前后模型小鼠大脑皮层和海马组织中整个蛋白质组的改变，鉴定出一组表达受dl-PHPB影响的蛋白。结果如下：histidine triad nucleotide-binding protein 1、fatty acid-binding protein、pyruvate dehydrogenase E1component subunit uvate dehy、peroxiredoxin-6、cathepsin B、isocitrate dehydrogenase、dihydropyrimidinase-related protein 2(DRP-2)、dihydrolipoamide succinyltransferase、dihydropyrimidinase-relatedprotein 5(DRP-5)、peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1(Pin1)、voltage-dependent anion-selective channel protein 1(VDAC1)、carbonicanhydrase 2、malate dehydrogenase、α-enolase、cofilin-2。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一组表达受药物dl-PHPB调节的大脑蛋白，其特征在于：dl-PHPB处理显著改变如下一组蛋白在AD模型小鼠的大脑皮层和海马组织中的表达：histidine triad nucleotide-binding protein1、fatty acid-binding protein、pyruvate dehydrogenase E1component subunitα(PDHE1α)、peroxiredoxin-6、cathepsin B、isocitratedehydrogenase、dihydropyrimidinase-related protein2(DRP-2)、dihydrolipoamidesuccinyltransferase、dihydropyrimidinase-related protein5(DRP-5)、peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting1(Pin1)、voltage-dependent anion-selective channel protein1(VDAC1)、carbonic anhydrase2、malate dehydrogenase、α-enolase、cofilin-2。