CN110520437A - 重启l-型细菌中合成噬菌体基因组 - Google Patents

重启l-型细菌中合成噬菌体基因组 Download PDF

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Abstract

本发明涉及产生或繁殖工程化噬菌体的方法，包括以下步骤：提供能够感染靶细菌的工程化噬菌体的功能性合成基因组；提供受体细菌；在转化步骤中用所述功能性合成基因组转化所述受体细菌，产生转化的受体细菌；在第一孵育步骤中孵育所述转化的受体细菌，其中所述工程化噬菌体繁殖于所述转化的受体细菌内；和在第二孵育步骤中，用所述靶细菌进一步孵育所述转化的受体细菌或从所述转化的受体细菌中释放出的所述繁殖的工程化噬菌体，其中所述繁殖的工程化噬菌体感染所述靶细菌并在所述靶细菌内进一步繁殖，并且其中所述受体细菌是细胞壁缺陷型细菌。

Description

重启L-型细菌中合成噬菌体基因组
技术领域
本发明涉及用于产生或繁殖噬菌体，具体而言工程化噬菌体的方法和装置(mean)。
背景技术
细菌噬菌体(Bacteriophage)噬菌体(phage))是专门感染细菌并构成其天敌的病毒。大多数噬菌体感染给定细菌物种菌株的特异性亚群而不会靶向其他密切相关的细菌。由于其特殊的特异性和溶菌潜力，噬菌体被用于各种生物医学和生物技术应用。一方面，它们被用作快速而灵敏检测活细菌病原体的诊断工具。另一方面，毒性噬菌体被用于特异性物种的生物控制，有效地从工业生产链和食品中去除潜在的病原体。此外，由于抗生素耐药性的增加，欧盟和美国(WHO和CDC)每年估计有48,000例死亡，噬菌体作为替代抗微生物剂的应用是一个受关注的重新兴起的领域，而噬菌体治疗方法表现出有前景的效果。考虑到传统抗生素的低发现率，并结合存在的公共卫生威胁抗药性细菌的日益增加，则假设噬菌体治疗的复兴将会继续是合理的。尽管噬菌体具有高属-和种-特异性、自复制性和低生产成本，但噬菌体面临着许多挑战，这些挑战仍然限制它们在生物医学环境中的应用：由于单独噬菌体的宿主范围受限，噬菌体混合物需要进行设计才能覆盖致病物种的所有医学相关菌株。一般获得噬菌体产品，具体而言噬菌体混合物的监管批准具有挑战性，并且监管框架尚不清楚。此外，溶原性(温和)噬菌体能够整合到所述宿主基因组中而不会诱导细胞裂解，并且甚至可以通过转导促进抗生素抗药性的传播或通过溶原转化增加细菌毒力，有效地排除了它们作为生物控制剂的用途。此外，靶细胞能够编码繁多的噬菌体抗药性机制，包括受体多样化、生物膜形成和CRISPR干扰等。通过修饰噬菌体的基因组，能够克服许多这些限制，并能够将其他有益特性包括于噬菌体基因组中。
不幸的是，毒性噬菌体的基因组工程化大都是困难的且工作密集型的过程。在大多数情况下，噬菌体基因组在感染期间通过与携带同源序列和所需遗传更改的质粒的同源重组进行修饰。因为噬菌体复制很快并且重组率通常非常低(10-4～10-10)，筛选重组噬菌体是劳动密集型的，并需要引入报告基因。最近，研究人员提出了一种修饰噬菌体基因组的精美合成方法：酵母人工染色体(YAC)和重叠噬菌体基因组片段在体内组装于酵母细胞中从而产生捕获于YAC中的完整重组基因组。随后，YAC-噬菌体DNA转化至大肠杆菌中以重启(reboot)这些噬菌体。到目前为止，该方法限于感染革兰氏阴性细胞并具有宿主非依赖性复制特征的T7家族病毒。相似的方法是否适用于不同的噬菌体家族和/或感染革兰氏阳性细胞的噬菌体，目前还是未知的。
因此，产生也适用于适合革兰氏阳性宿主的噬菌体的完整重组噬菌体基因组的简单有效方法，仍存需要。
发明内容
基于上述背景，本发明的目的是提供用于繁殖噬菌体，具体而言包括感染革兰氏阳性宿主细胞的噬菌体的简单有效方法和装置。
该目的通过根据权利要求1或权利要求10的方法和根据权利要求12的细胞壁缺陷型细菌而实现。
据此，本发明的第一方面涉及用于繁殖噬菌体，具体而言工程化的噬菌体的方法。该方法包括以下步骤：
-提供能够感染目标细菌的噬菌体的功能性基因组，
-提供受体细菌，
-在转化步骤中用功能性基因组转化所述受体细菌，产生转化的受体细菌，
-在第一孵育(incubation)步骤中孵育(incubate)所述转化的受体细菌，其中所述噬菌体繁殖于所述转化的细菌内，和
-在第二孵育步骤中用所述靶细菌进一步孵育所述转化的受体细菌，其中所述繁殖的噬菌体感染所述靶细菌并在所述靶细菌内进一步繁殖，
其中所述受体细菌是细胞壁缺陷型细菌。
在本说明书的上下文中，所述术语“细胞壁缺陷型”细菌是指在渗透稳定的培养基中以细胞壁缺陷状态活跃增殖的其他带壁细菌的细胞壁缺陷型变体。它们缺乏所述多层肽聚糖包膜(envelope)，其通常限制例如用大DNA分子转化革兰氏阳性细菌。细胞壁缺陷型细菌也称为L-型细菌、L-期(phase)细菌或L-期变体。
因此，这种细胞壁缺陷型细菌具体而言是代谢活性细胞壁缺陷型细菌和/或能够活跃增殖的细胞壁缺陷型细菌。具体而言，这种细胞壁缺陷型细菌可以是暂时性或永久性细胞壁缺陷的。
在本说明书的上下文中，所述术语“合成基因组”具体而言是指人工或非天然存在的基因组。同样，在本说明书的上下文中，所述术语“工程化的噬菌体”具体而言是指人工或非天然存在的噬菌体，特别是以合成基因组为特征的噬菌体。
具体而言，所述功能性基因组以一种“裸”核酸或多种“裸”核酸的形式，例如，没有蛋白衣壳或包膜，进行转化。
可替代地，在所述第二孵育步骤中所述繁殖的噬菌体用所述靶细菌进行孵育，其中所述繁殖的噬菌体从所述转化的受体细菌中，具体而言通过裂解所述转化的受体细菌，例如，通过渗透压休克(osmotic shock)法释放出来。
本发明的所述方法是一种用于重组或天然噬菌体的生产、繁殖、再活化或工程化的新方法，与现有技术相比，其更快且更可靠。该方法不需要筛选合适的重组体或引入可检测的报告基因。此外，它适用于感染革兰氏阳性生物的非常宽范围的噬菌体。该方法是向生成具有所需生物医学和生物技术特性的定制噬菌体迈出的一大步。有利的是，本发明的所述方法克服了已知方法的局限，而因此广泛适用于感染革兰氏阳性生物的噬菌体。
具体而言，所述转化步骤和/或所述第一孵育步骤在渗透保护介质中进行实施。
在本说明书的上下文中，所述术语“渗透保护介质(osmoprotective medium)”具体而言指能够使所述细胞壁缺陷型细菌存活和/或生长的培养基，并且进一步包含特别是以所述细胞壁缺陷型细菌和所述培养基之间的渗透压低于阈值的浓度的无毒水溶性渗透活性化合物，高于该阈值就会发生细胞壁缺陷型细菌的破裂。此类化合物的非限制性实例包括无毒有机酸或其盐，如琥珀酸盐，碳水化合物或无毒盐，如硫酸铵或氯化钠。
具体而言，所述第二孵育步骤在渗透保护介质不存在的情况下进行实施。
在某些实施方式中，所述转化的步骤在液体培养基中进行实施。在某些实施方式中，所述第一孵育步骤在液体培养基中进行实施。在某些实施方式中，所述第二孵育步骤在液体培养基中进行实施。
在某些实施方式中，所述渗透保护介质包含，具体而言以浓度范围为0.075mol*L-1～0.5mol*L-1的琥珀酸盐。在某些实施方式中，所述渗透保护介质包含单糖、二糖或三糖，具体而言葡萄糖或蔗糖。在某些实施方式中，所述渗透保护介质包含甘油。在某些实施方式中，所述渗透保护介质包含浓度范围为0.25mol*L-1～0.75mol*L-1，具体而言0.5mol*L-1的蔗糖。
在某些实施方式中，所述受体细菌是革兰氏阳性细菌的细胞壁缺陷型变体或衍生自革兰氏阳性细菌的细胞壁缺陷型变体。
在本说明书的上下文中，所述术语“衍生自”具体而言是指相应细菌，例如，亲本细胞带壁革兰氏阳性细菌，通过，例如，培养条件下如存在细胞壁合成干扰抗生素时和/或在渗透保护介质存在下转化成细胞壁缺陷型细菌的过程。
在某些实施方式中，所述受体细菌是李斯特菌属(Listeria)的细胞壁缺陷型细菌。在某些实施方式中，所述受体细菌是单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的细胞壁缺陷型变体或衍生自单核细胞增生李斯特菌的细胞壁缺陷型变体。在某些实施方式中，所述受体细菌是单核细胞增生李斯特菌EGD-e(Listeriamonocytogenes EGD-e)的细胞壁缺陷型变体或衍生自单核细胞增生李斯特菌EGD-e的细胞壁缺陷型变体。在某些实施方式中，所述受体细菌是无害李斯特菌(Listeria innocua)的细胞壁缺陷变体或衍生自无害李斯特菌的细胞壁缺陷型变体。在某些实施方式中，所述受体细菌是无害李斯特菌2021(Listeria innocua 2021)，具体而言，无害李斯特菌菌株SLCC5639(Listeria innocua strain SLCC 5639)(特种李斯特菌培养物保藏中心(SpecialListeria Culture Collection)，维尔茨堡大学(Univ.of Wurzburg)，德国)的细胞壁缺陷型变体，或由其衍生的细胞壁缺陷型变体。
在某些实施方式中，所述靶细菌是革兰氏阳性细菌。在某些实施方式中，所述靶细菌选自李斯特菌属(Listeria)，芽孢杆菌属(Bacillus)，肠球菌(Enterococcus)，链球菌属(Streptococcus)，梭菌属(Clostridium)或葡萄球菌属(Staphylococcus)。在某些实施方式中，所述靶细菌选自单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)，伊万诺薇李斯特菌(Listeria ivanovii)，无害李斯特菌(Listeria innocua)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcos aureus)。
在某些实施方式中，所述受体细菌和所述靶细菌属于或衍生自不同种。在某些实施方式中，所述受体细菌和所述靶细菌属于或衍生自不同属的成员。
在某些实施方式中，所述受体细菌衍生自李斯特菌属的成员，而所述靶细菌属于选自芽孢杆菌属(Bacillus)，肠球菌属(Enterococcus)链球菌属(Streptococcus)，梭菌属(Clostridium)或葡萄球菌属(Staphylococcus)的属。
在某些实施方式中，所述功能性基因组是天然存在的噬菌体基因组。在某些实施方式中，所述功能性基因组是合成或人工噬菌体基因组，具体而言是工程化噬菌体。
在本说明书的上下文中，所述术语“合成或人工噬菌体基因组”具体而言是指人工非天然的核酸构建体。
这种合成或人工噬菌体基因组可以源自天然噬菌体基因组，其中引入了一种或多种外源遗传元件如基因、调节元件(例如，启动子)、操纵子或开放阅读框，和/或天然存在的遗传元件已被替换、修饰和/或删除。这种合成噬菌体基因组也可以是源自多种不同生物的多种遗传元件的嵌合体(mosaic)。
在某些实施方式中，所述功能性基因组，具体而言是功能性合成或人工基因组，通过体外或体内组装其片段而提供。具体而言，所述功能性基因组的片段可以通过从头合成法，克隆法或扩增法而提供，其中所提供的片段然后可以通过本领域已知的方法组装于所述功能性基因组中。体外组装的非限制性实例是所述吉布森(Gibson)组装，其中所述上述片段在对其进行组装时共享重叠序列。体内组装的非限制性实例是所述酵母组装，其中酵母细胞用上述也包含重叠序列的片段进行转化，并将所述片段组装于所述酵母细胞内。
在某些实施方式中，所述功能性基因组，具体而言所述功能性合成或人工基因组，通过从头合成法提供。
在某些实施方式中，所述合成或人工噬菌体基因组源自温和噬菌体，其中所述合成或人工噬菌体基因组缺乏所述裂解循环或所述溶原性控制区的阻遏子的基因。
在某些实施方式中，所述功能性基因组是线性或环状核酸分子。在某些实施方式中，所述功能性基因组是单链或双链RNA或DNA分子。
在某些实施方式中，所述功能性基因组具有至少10,000个碱基对的长度。在某些实施方式中，所述功能性基因组具有至少30.000个碱基对的长度。在某些实施方式中，所述功能性基因组具有至少40.000个碱基对的长度。在某些实施方式中，所述功能性基因组具有至少120,000个碱基对的长度。在某些实施方式中，所述功能性基因组具有10,000个碱基对～160,000个碱基对的长度范围。在某些实施方式中，所述功能性基因组具有35,000个碱基对～160,000个碱基对的长度范围。在某些实施方式中，所述功能性基因组具有40,000个碱基对～130,000个碱基对的长度范围。
在某些实施方式中，所述功能性基因组源自长尾病毒(Siphovirus)，具体而言长尾病毒TP21-L，长尾病毒2638A，长尾病毒P35，长尾病毒B025，长尾病毒B035，长尾病毒B056，长尾病毒PSA或长尾病毒P70，或肌尾病毒(Myovirus)，具体而言肌尾病毒A511，肌尾病毒P100，肌尾病毒Bastille(Myovirus Bastille)，或噬菌体K，或短尾病毒(podovirus)。
在某些实施方式中，所述转化步骤在聚乙二醇存在下进行实施。在某些实施方式中，所述聚乙二醇具有1,000g*mol-1～30,000g*mol-1的平均分子量。在某些实施方式中，所述聚乙二醇具有7,000g*mol-1～20,000g*mol-1的平均分子量。在某些实施方式中，所述聚乙二醇是PEG-8000。在某些实施方式中，所述转化步骤在浓度范围为约6％(w/v)～约36％(w/v)的聚乙二醇存在下进行实施。在某些实施方式中，所述转化步骤在浓度为约24％(w/v)的聚乙二醇存在下进行实施。
关于聚乙二醇的所述术语“平均分子量”具体而言是指所述相应聚乙二醇的分子量分布的算术平均或中值。这种平均分子量可以通过本领域技术人员已知的方法，例如，通过静态或动态光散射(SLS，DLS)、尺寸排阻色谱法或凝胶电泳法进行测定。
在某些实施方式中，所述第一孵育步骤在4小时至96小时范围的一段时间内进行实施。在某些实施方式中，所述第一孵育步骤在24小时至32小时范围的一段时间内进行实施。
在某些实施方式中，所述第一孵育步骤在15℃至37℃的温度下，具体而言在20℃至32℃的温度下进行实施。在某些实施方式中，所述第二孵育步骤在15℃至37℃的温度下，具体而言在20℃至32℃的温度下进行实施。在某些实施方式中，所述转化步骤在15℃至37℃的温度范围内，具体而言在20℃至37℃的温度范围内进行实施。
在某些实施方式中，所述受体细菌通过在细胞壁合成干扰抗生素存在的情况下孵育细胞带壁前体细菌(cell walled precursor bacterium)而提供，从而产生所述受体细菌。具体而言，所述前体细菌在细胞壁合成干扰抗生素存在下孵育大于前体细菌在本发明条件下的倍增时间的一段时间。在某些实施方式中，所述前体细菌在细胞壁合成干扰抗生素存在下孵育2天至5天，具体而言3天至4天。
在某些实施方式中，所述细胞壁合成干扰抗生素选自β-内酰胺抗生素、糖肽抗生素、磷霉素(fosfomycin)或环丝氨酸。
在某些实施方式中，所述β-内酰胺抗生素选自头孢菌素类(cephalosporins)、碳头孢烯类(carbacephems)、单环内酰胺类或青霉素类。
在某些实施方式中，所述细胞壁合成干扰抗生素是青霉素G。
可替代地，所述受体细菌可以通过在细胞带壁前体细菌内的蛋白水平或基因组水平上抑制与细胞壁合成相关的蛋白，或通过在细胞壁降解或裂解酶如溶菌酶存在下和渗透保护介质存在下孵育所述细胞带壁前体细菌而提供。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于生产李斯特菌属的细胞壁缺陷型细菌的方法。该方法包括以下步骤：
-提供以基因型[Δlmo0584 Δlmo1653-54 Δlm01861]或不包含lmo0584、lmo1653-54和lmo01861的功能性同源物的基因组为特征的李斯特菌属细菌，或
-提供无害李斯特菌种的细菌，具体而言无害李斯特菌菌株2021的细菌，更特具体而言无害李斯特菌菌株SLCC 5639(特种李斯特菌培养物保藏中心，德国维尔茨堡大学，德国)；和
-在细胞壁合成干扰抗生素存在下和可选地在渗透保护介质存在下培养所述细菌。
所述术语“lmo0584”是指单核细胞增生李斯特菌EGD-e中的基因(基因ID：984661，NCBI基因数据库)。
所述术语“lmo1653-54”是指单核细胞增生李斯特菌EGD-e中的两个基因(基因ID：985674和基因ID：985673，NCBI基因数据库)。
所述术语“lmo01861”是指单核细胞增生李斯特菌EGD-e中的基因(基因ID：985831，NCBI基因数据库)。
所述术语“功能性同源物”在本说明书的上下文中是指具有相同功能而所述核酸序列不同的基因。
在某些实施方式中，所述李斯特菌属细菌通过使基因lmo0584、lmo1653-54和lmo01861或其同源物失活而提供。在某些实施方式中，所述基因lmo0584、lmo1653-54和lmo01861或其同源物的失活通过所述基因或其同源物的删除，在所述基因或其同源物内的碱基取代、缺失、插入或序列倒位而进行实施。
在某些实施方式中，所述细胞壁合成干扰抗生素选自β-内酰胺抗生素，具体而言是头孢菌素类，碳头孢烯类，单环内酰胺类，或青霉素类，糖肽抗生素类，磷霉素或环丝氨酸。
在某些实施方式中，所述李斯特菌属细菌是单核细胞增生李斯特氏菌。在某些实施方式中，所述李斯特菌属细菌是单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e
在某些实施方式中，所述细菌在范围为20～32℃的温度下培养。
可替代地，所述细胞壁缺陷型细菌可以通过在蛋白水平或基因组水平上抑制与所述细胞壁合成相关的蛋白，或通过在细胞壁降解或裂解酶如溶菌酶存在下和在渗透保护介质存在下孵育带壁细菌而生产。
根据本发明的另一方面，提供了一种李斯特菌属的细胞壁缺陷型细菌，其中所述细菌的特征在于所述基因型[Δlmo0584Δlmo1653-54Δlm01861]，或不包含lmo0584、lmo1653-54和lmo01861的功能性同源物的基因组。
在某些实施方式中，所述细胞壁缺陷型细菌是单核细胞增生李斯特菌。在某些实施方式中，所述细胞壁缺陷型细菌是单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e。
在某些实施方式中，所述细胞壁缺陷型细菌是通过根据本发明上述方面的方法能够获得的或通过根据本发明上述方面的方法获得。
无论何处将单个可分离特征的替代物作为“实施方式”在本文中列出，都应该理解的是这些替代物可以自由组合而形成本文公开的本发明的各个实施方式。
本发明通过以下实施例和附图进一步举例说明，由这些实施例和附图可以得出进一步的实施方式和优点。这些实施例旨在举例说明本发明，而非限制其范围。
附图说明
图1显示了以L-型菌株Rev2L的李斯特菌噬菌体基因组的重启。(A-B)重启L-型菌株Rev2L的李斯特菌噬菌体的能力使用李斯特菌噬菌体P35的基因组DNA如(A)中所述进行评价。L-型转化反应如(B)中所示进行准备，在32℃下孵育并在转化后24小时时测试所述指示菌株上的菌斑形成(plaque formation)。DNAseI指示P35 gDNA使用DNAseI的30分钟预先消化。(C)转化和重启的效率使用P35 gDNA的稀释系列进行测定。(D)另外七个李斯特菌噬菌体的组使用500～1000ng gDNA在Rev2L中重启，并使用单核细胞增生李斯特菌或伊万诺维李斯特菌(Listeria ivanovii)作为指示菌株进行检测。噬菌体属性以表格形式列出。(E)在96小时内评价三种噬菌体L-型的噬菌体产生动力学。数据是平均值±SD(n＝3)。Φ＝噬菌体，PEG＝聚乙二醇，gDNA＝基因组DNA，tr＝末端冗余(terminal redundancy)，cp＝环状排列(circular permutation)，cos＝粘性末端位点，nd＝未检测。
图2显示了李斯特菌L-型的(A)芽孢杆菌和(B)葡萄球菌噬菌体基因组的重启。Rev2L细胞用1～5μg噬菌体gDNA转化，在32℃下孵育24h，并测定其相应指示菌株上的噬菌体生产。缺乏所述gDNA或所述L-型细胞的转化反应用作对照物。Φ＝噬菌体。
图3显示了李斯特菌L-型的合成体外组装噬菌体基因组的重启。Rev2L中重启合成基因组的一般工作流程如(A)中所示。基因组噬菌体DNA从单核细胞增生李斯特菌噬菌体P35、无害李斯特菌噬菌体B025和蜡状芽孢杆菌噬菌体(Bacillus cereus phage)TP21-L中提取和纯化。除非另有说明，覆盖全基因组的重叠PCR片段使用高保真聚合酶(B，D，F)产生，并进行体外组装而产生环状分子。组装反应在Rev2L细胞中转化和重启，并使用不完整的组装体作为对照(C，E，G)铺板于相应的指示菌株上。对于噬菌体TP21-L，使用指示菌株在24小时后检测重启反应的噬菌体生产，或者，在指示(扩增)的情况下，在转化后6小时将10μL固定HER1399培养物加入所述重启反应中并测定24h时的噬菌体生产(G)。
图4显示了温和李斯特菌噬菌体B025由温和至毒性的生活方式转化。体外基因组组装策略用于产生缺乏整合抑制因子(Δrep)或完整溶原性控制区(ΔLCR)的所述温和李斯特菌噬菌体B025的突变体。工作流程如(A)中所示。所述野生型组装体的片段三含有溶原性控制基因，并分成省略仅阻遏子或完整LCR的两个重叠片段，从而产生用于基因组组装的五个PCR片段(B)。重组基因组进行重启，所述得到的噬菌体突变体进行纯化，并使用PCR和测序检测合适的基因型(C)。伊万诺维李斯特菌WSLC3009使用所述软琼脂覆盖技术，采用数量渐增的野生型、Δrep和ΔLCR噬菌体进行感染。使用所示的引物对测试存活细菌菌苔(lawn)(B025wt)或单菌落(B025Δrep和B025ΔLCR)是否存在B025原噬菌体(E)。LCR＝溶原性控制区，PFU＝噬斑形成单元，attB＝原噬菌体整合的细菌附着位点，attL＝WSLC3009::B025中的左侧原噬菌体侧翼区。
图5还显示了L-型菌株Rev2L中的李斯特菌噬菌体基因组的重启。用于重启噬菌体基因组的详细工作流程显示于(A)中，其中每个参数都被单独优化。优化的参数包括：转化前Rev2L生长的时间(B)，转化时L-型培养物的调节光密度(600nm)(C)，加入DM3培养基前的最终PEG浓度(D)，孵育前加入至所述DNA/L-型/PEG-混合物中的DM3体积(E)，和所使用的PEG链的平均分子量(F)。所选的最佳条件被指示出(星号)。重启所用的噬菌体DNA的质量使用脉冲场凝胶电泳进行评价(G)。使用噬菌体DNA的稀释系列，比较了噬菌体P35和A511的重启效率(H)。各种李斯特菌噬菌体感染带壁Rev2细胞的能力通过在含有Rev2或噬菌体指示菌株的软琼脂覆盖物上点样(spotting)噬菌体稀释液进行评价。(I)PenG＝青霉素G，OD＝光密度，PEG＝聚乙二醇。数据为平均值±SD(n＝3)。
图6显示了李斯特菌L-型的合成体外组装噬菌体基因组的重启。使用基因组DNA和体外组装的基因组作为输入材料进行基因组重启的效率进行了比较：使用P35 gDNA的4倍稀释系列或吉布森(Gibson)组装反应在Rev2L中重启，以2μg和125ng输入材料开始分别进行gDNA和组装反应。每个转化反应的总pfu进行量化和比较。数据为平均值±SD(n＝3)。
图7显示了TP21-L溶原性控制基因的缺失。使用体外基因组组装策略产生缺乏整合阻遏子(Δrep)或完整溶原性控制区(ΔLCR)的所述温和芽孢杆菌噬菌体TP21-L突变体。工作流程如(A)中所示。所述野生型组装体的片段三含有所述溶原性控制基因，并被分成省略仅阻遏子或完整LCR的两个重叠片段，从而产生用于基因组组装的五个PCR片段。重组基因组进行重启，所述得到的噬菌体突变体进行纯化，并使用PCR和测序测试合适的基因型(B)。LCR＝溶原性控制区。
图8显示了L-型菌株Rev2(单核细胞增生李斯特氏菌)和由非致病性无害李斯特菌2021(SLCC 5639)获得的可逆L-型中的李斯特噬菌体基因组的重启。所述两种L-型培养物的每一种用单核细胞增生李斯特菌噬菌体P70的基因组DNA(1μg)进行转化，在32℃下孵育24h，并使用单核细胞增生李斯特菌L99作为指示菌株测试菌斑形成。软琼脂覆盖层(感染后24小时)的菌斑被显示出来。
具体实施方式
实施例
本发明表明，新的单核细胞增生李斯特菌L-型菌株Rev2L能够用导致基因组重启，即由裸DNA产生感染性病毒粒子的完整纯化噬菌体DNA转化。重启适用于单核细胞增生李斯特菌和无害李斯特菌噬菌体的异源组(与噬菌体向性(phage tropism)、形态、基因组尺寸或基因组结构无关)。值得注意的是，这种基因组重启方法对于感染芽孢杆菌和葡萄球菌的多种噬菌体也是成功的，有效地绕过了感染的属屏障。为了在合成生物学方法中产生野生型和重组病毒，噬菌体基因组使用扩增的重叠片段进行体外组装，并随后在Rev2L细胞中重启。作为该策略的概念证明，本发明人删除了所述温和李斯特菌噬菌体B025的溶原性控制基因，并验证了所述重组病毒的所获得的毒力表型。将体外基因组组装和L-型转化组合以工程化噬菌体将会促进定制噬菌体的开发，其用于感染革兰氏阳性病原体的噬菌体的基础和应用研究。
具体而言，所述以下两步方案可以用于产生遗传修饰的噬菌体：
·在第一步中，合成噬菌体基因组使用基于商购获得的吉布森(Gibson)组装的方法进行体外组装。噬菌体基因组被组装成环状的双链分子，模拟在天然噬菌体复制期间出现的DNA中间体。原则上，任何导致合成基因组形成的方法都可以用于这个第一步骤，因此它不限于吉布森(Gibson)组装的基因组。
·在第二步中，体外组装的病毒基因组/合成基因组被转化至单核细胞增生李斯特氏菌细胞中，其中这些合成噬菌体被重启而产生感染颗粒。对于这种转化反应，本发明人不使用野生型李斯特菌细胞，而相反却依赖于新识别的单核细胞增生李斯特菌L型菌株Rev2L。只要使用渗透稳定的培养基防止细菌裂解，则该菌株就具有在不存在完整细胞壁的情况下进行生长和分裂的能力。由于缺乏完整细胞壁，Rev2L能够用大DNA分子如完整噬菌体基因组进行转化。对于这种转化反应，本发明人使用了优化的聚乙二醇(PEG8000)类方案。转化的L-型细菌孵育24小时以使噬菌体重启。为了从这些反应中分离和扩增合成噬菌体，随后将L-型与所关注的噬菌体的天然繁殖菌株一起进行混合和孵育。没有必要从所述L-型细胞中活跃释放出后代噬菌体，因为它们由于噬菌体编码的酶的活性或仅通过所述膜的渗透失稳而被裂解。
重要的是，这种方法不限于李斯特菌噬菌体，而能够应用于革兰氏阳性细菌或其他细菌的其他噬菌体。
概念证明的详细描述
为了解决革兰氏阳性细胞中的噬菌体基因组重启，本发明人使用了感染食源性病原体单核细胞增生李斯特氏菌的毒性长尾病毒P35。P35的所述35'822bp线性基因组DNA(gDNA)太大而不能电穿孔进入带壁李斯特菌细胞，其通常以非常低的效率摄取最高达10kb超螺旋质粒。因此，本发明人无法使用采用带壁细胞的常规电穿孔方案解决基因组重启。基于所述肽聚糖包膜是较大DNA转化的主要障碍的假设，他们研究了使用代谢活性的，细胞壁缺陷型李斯特菌L型作为纯化的线性P35 gDNA的受体的可能性。L-型在细胞壁合成靶向抗生素存在下在渗透保护介质中通过延长的重复传代培养(subcultivation)进行诱导。对于本发明的所述方法，本发明人使用了通过在DM3培养基中长期暴露单核细胞增生李斯特菌EGD-e于青霉素G(penG)而获得的并具有在作为L型(命名为Rev2L)和带壁细菌(Rev2)生长之间切换的能力的新型李斯特菌菌株Rev2[Δlmo0584 Δlmo1653-54 Δlm01861]。
本发明人设计了用噬菌体gDNA进行L-型细菌的聚乙二醇(PEG)介导转化的工作流程(图1中的A和图5中的A)，并发现P35重启于gDNA-、L-型-和PEG依赖性过程中(图1中的B)。为此目的，纯化的P35 gDNA与生长的青霉素G(penG)-诱导Rev2L培养物和PEG-8000溶液混合。随后PEG用渗透稳定的DM3培养基稀释，并将所述混合物在32℃下孵育24小时以使噬菌体重启。使用噬菌体P35的所述繁殖株作为指示菌株(单核细胞增生李斯特菌Mack)测试所述L-型转化反应的重启噬菌体的存在。
为了获得最高的噬菌体产率，本发明人使用P35 gDNA优化了所述重启方案的每个步骤(详见图5和方法部分)。在这样的优化条件下，本发明人发现输入DNA和噬菌体生产之间存在线性相关性(图1中的C)，检测限2.6pg P35 gDNA对应于约66`000基因组(假设所使用的DNA仅由完整的gDNA组成)。除了P35之外，该L-型转化方案允许重启另外七个李斯特菌噬菌体异源组(图1中的D)。这些包括具有毒力(P70，P100和A511)和温和(B025，B035，B056，PSA)生命方式的噬菌体，一些具有超过130kb的大基因组的噬菌体(P100，A511)，以及具有收缩性尾(肌尾病毒；P100，A511)或非收缩性尾(长尾病毒；所有其他病毒)的形态多样噬菌体。噬菌体B025具有内聚重叠基因组端(cohesive overlapping genome ends)(cos)，而其他重启的噬菌体具有末端冗余基因组，具有或没有环状排列。
这些结果强烈表明，重启与病毒体形态、噬菌体基因组尺寸和基因组复制策略无关。此外，本发明人能够生产通常将不会感染Rev2细胞的李斯特菌噬菌体(B025，B035，B056和PSA，图5)，表明受体结合和/或基因组易位是限制这些噬菌体在感染带壁细胞期间生产的唯一障碍。所述重启的李斯特菌噬菌体的多种特征总结于图1中的D(小表)中，并表明Rev2L中的重启广泛适用于李斯特菌噬菌体。
本发明人比较了噬菌体P35、P70和A511的重启动力学(图1中的E)，并发现转化后24小时所有三种噬菌体的生产均达到峰值，这与带壁细胞中的感染动力学相比是较慢的。为了比较，当带壁细胞受感染时，A511具有60min的突发时间(burst time)。这种大的时间差异很可能是由L型的代谢缓慢所致。因为L-型缺乏完整细胞壁，则子代病毒粒子通过噬菌体穴蛋白(phage holing protein)的作用裂解Rev2L细胞，或当在渗透性未稳定化的软琼脂中稀释DM3培养基时通过渗透失稳而释放。这也将允许释放其细胞壁裂解酶通常不会降解李斯特菌血清变型(Listeria serovar)1细胞壁的噬菌体。释放的噬菌体不能与相邻细胞结合，其存活依赖于在DM3培养基中的稳定性(图1中的E)。
除了感染李斯特菌的噬菌体重启之外，本发明人证实，Rev2L细胞能够用于重启感染厚壁菌(Firmicutes)门内不同属的革兰氏阳性生物的噬菌体。在系统发生学上，芽孢杆菌与李斯特菌最接近，并且本发明人发现，使用基因组DNA作为底物，蜡状芽孢杆菌的小型37.46kb长尾病毒TP21-L以及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的所述大型153.96kb肌尾病毒Bastille(Myovirus Bastille)能够在Rev2L中重启(图2中的A)。
接着，本发明人发现，李斯特菌L-型也能够用作感染人类病原体金黄色葡萄球菌的噬菌体的重启平台：他们成功地重启了2638A、41.32kb长尾病毒以及噬菌体K、大型127.40kb肌尾病毒(图2中的B)。到目前为止的所述结果证实，Rev2L是一种用于摄取大型病毒基因组和由裸线性gDNA进行革兰氏阳性生物噬菌体的跨属重启的高度通用宿主。
接着，本发明人利用本发明的所述L-型平台解决了合成基因组是否也能够用作重启的底物(工作流程如图3中的A所示)。首先，他们扩增和纯化P35 DNA的重叠区段并使用吉布森(Gibson)方法组装合成基因组。因为大多数噬菌体使用环状复制中间体，片段之间的重叠经过设计而允许末端连接(关环(circular closure))。然而，形成串联(concatemeric)或末端冗余的线性DNA却不能被排除。为了组装所述P35基因组，本发明人使用了约6kb的六个片段或约12kb的三个片段(图3中的B)，并据发现，P35由合成DNA进行有效重启(图3中的C)。作为对照物，他们使用了缺少一个片段的不完整组装体。对于P35，与纯化的gDNA(检测限＝1.1pg DNA，S图(SFigure)6)相比，使用合成DNA甚至更有效，这是因为不再需要进行关环(ring-closure)或因为环状DNA比线性分子转化更有效。
除了P35之外，本发明人还使用该合成方法组装和重启温和无害李斯特菌噬菌体B025的基因组(图3中的D-图3中的E)。蜡状芽孢杆菌噬菌体TP21-L在Rev2L中的体外组装和跨属重启(图3中的F-图3中的G)也是成功的，并据发现，当在转化后6h将宿主细胞加入到所述重启反应中时噬菌体的生产被扩增(图3中的G)。这种扩增策略对于任何感染李斯特菌或葡萄球菌的噬菌体都不成功，这是因为它们未能在DM3培养基中感染。TP21-L还用于证实，即使在没有所设计的关环存在下也产生了合成噬菌体(图3中的G)。
在L-型中合成基因组的组装和重启的独特组合为噬菌体基因组工程化提供了平台：为了探索这种方法，本发明人尝试使用合成修饰基因组将温和李斯特菌噬菌体的生命方式从溶原型转变为裂解型。为此，他们组装了温和李斯特菌噬菌体B025的基因组，但删除了控制和介导原噬菌体整合的基因。在B025中，这些基因编码于2.7kb推定溶原性控制区(LCR)上，并且删除了裂解循环的阻遏子(B025Δrep)或包括噬菌体整合酶的整个LCR(B025ΔLCR)。所述基因组组装策略如图4中的A中所示，而组装噬菌体突变体的片段如图4中的B中所示。重组噬菌体基因组经过组装，成功重启，并通过PCR和LCR区测序验证了所获得的噬菌体(图4中的C)。尽管菌斑形态没有明显差异(图4中的C)，但所述重组体不再能够作为合成“毒力”噬菌体进行整合和复制(图4中的D)：当使用来自B025野生型组装体的重启噬菌体时，原噬菌体整合有效地预防了高度多重感染下的宿主杀灭(图4中的D；105pfu)。因此，观察到了看似未感染的细菌菌苔，其由对超级感染(super-infection)具有抗性的B025溶菌原(WSLC3009::B025)组成。相对而言，所述B025突变体显示出增强的杀灭作用并能够在相同的多重感染时在软琼脂覆盖测试中裂解几乎所有的宿主细胞。在用溶原性控制突变体感染后，只有少数存活者生长。当再生长时，这些存活者对B025没有抗性并具有空的整合位点(图4中的E)，证明所述LCR突变体确实是裂解的，而并不能整合到所述宿主基因组中。类似的方法成功应用于蜡状芽孢杆菌噬菌体TP21-L中，其中仅所述完整2kb LCR或所述阻遏子被删除(图7)。噬菌体的生命方式从温和向毒力的转变是一个快速广泛适用的方法，以能够提高具有增强抗微生物活性的裂解噬菌体的库(arsenal)(其能够潜在地用于生物医学环境或病原体检测)。
本发明的所述基因组工程化平台允许进行重组噬菌体的合理设计和快速无报告子(reporter-free)生产。与重组类技术相对，不再需要对重组噬菌体进行繁琐筛选。将来，该技术将使我们能够定制具有增强的抗微生物特性的噬菌体，将敏感的报告基因整合到噬菌体基因组中用于病原体检测，和可能通过切换受体结合蛋白而允许宿主范围修改。基本噬菌体生物学的许多方面仍然知之甚少，主要是由于缺乏用于噬菌体蛋白的突变、缺失和分子标记的有效遗传工具。对于革兰氏阳性细菌的毒性噬菌体尤其如此。因此，本文介绍的方法将基本有助于增强对这些纳米机器生物学的理解，并为超出其作为生物控制剂和检测剂的用途的新噬菌体类生物技术应用铺平道路。
材料和方法
细菌菌株和生长条件
单核细胞增生李斯特氏菌WSLC1042和Mack，伊万诺维李斯特菌WSLC3009，苏云金芽孢杆菌HER1211和蜡状芽孢杆菌HER1399在30℃下生长于0.5x BHI培养基中。金黄色葡萄球菌ATCC19685和金黄色葡萄球菌2638A在37℃下生长于0.5x BHI培养基中。新型单核细胞增生李斯特菌L型菌株Rev2L在32℃下生长于DM3培养基的轻微修饰版中，为此我们使用胰蛋白胨代替酪蛋白氨基酸(casamino acid)(5gL-1胰蛋白胨，5gL-1酵母提取物，0.01％BSA，500mM琥珀酸，5gL-1葡萄糖，20mM K2HPO4，11mM KH2PO4，20mM MgCl2，调节至pH 7.3)。
噬菌体繁殖和DNA提取
噬菌体使用软琼脂覆盖法繁殖，并用SM缓冲液(100mM NaCl，8mM MgSO4和50mMTris，pH 7.4)从板中提取。噬菌体P35在室温下使用LC(补充有10mM CaCl2的LB琼脂)作为底部和顶部琼脂(LC/LC)繁殖于单核细胞增生李斯特菌Mack中。所有其他噬菌体使用0.5xBHI作为底层琼脂和LC作为顶层琼脂进行繁殖。噬菌体PSA在30℃下繁殖于单核细胞增生李斯特菌WSLC1042中，并且所有其他李斯特菌噬菌体在30℃下繁殖于伊万诺维李斯特菌WSLC3009上。芽孢杆菌噬菌体Bastille和TP21-L在30℃下分别繁殖于HER1211和HER1399上，而金黄色葡萄球菌噬菌体K和2638A在37℃下分别繁殖于ATCC19685和S2638A上。对于DNA提取，将过滤消毒的裂解物用DNaseI(10μg/mL)和RNaseA(1U，10mL中)在37℃下消化30min。噬菌体随后通过PEG沉淀(7％PEG8000和1M NaCl)浓缩，用蛋白酶K(200μg/mL，50℃，30min，在SM缓冲液+10mM EDTA中，pH 8)消化，并使用高纯病毒核酸试剂盒(High PureViral Nucleic Acid Kit)(Roche Life Science)纯化。为了从大型噬菌体基因组中纯化DNA(ΦP100，ΦA511，ΦBastille，ΦK)，PEG沉淀的噬菌体使用步进式CsCl梯度超速离心进行纯化，针对1000x过量SM缓冲液进行透析，用蛋白酶K进行消化，并且DNA使用如前所述的有机溶剂进行提取。
Rev2菌株和可逆的无害李斯特菌L-型菌株的产生
简而言之，李斯特菌EGD-e或无害李斯特菌2021(SLCC 5639)的过夜培养物铺板于补充有青霉素(200μg*mL-1)的DM3琼脂上。孵育约2周后，出现单一菌落，将其转移到含有青霉素G(PenG)的液体DM3培养基中，并进一步无摇动地孵育。耗时约一个星期，直至所述细菌第一次生长于液体培养基中。在液体DM3+PenG培养基中生长L-型后，将它们传代到不含青霉素G的液体DM3培养基中。所得到的L-型在DM3液体培养基中没有回复其带壁形式，但仅在DM3琼脂孔板(不存在青霉素G)上回复。在液体DM3培养基中生长两天后，所述L-型铺板于无青霉素的DM3板上，其中通常在2～5天后出现回复菌落(带壁细胞)。这些被挑选出并接种于液体BHI培养基中，其中由于不存在渗透保护剂，则任何残留的L-型细胞都会破裂(burst)。从该培养物，制备冷冻原液并测试所述菌株在补充青霉素G的DM3培养基中生长的能力。用EGD-e产生的所述可逆L-型称为Rev2(带壁)或Rev2L(L-型)。
L-型转化和基因组重启
在32℃下DM3培养基中存在200μg*mL-1PenG时将Rev2细胞诱导成L-型状态，并且每3～4天以1:1000稀释传代L-型细胞于新制DM3培养基中。对不同L-型代传测试了其在转化时产生感染性噬菌体颗粒的能力。我们观察到第5代的噬菌体生产是最大的，并因此使用由该代制备的冷冻原液(-80℃)进行所有实验。将小体积(4～5μL)的所述冷冻培养物接种于1mL预温热的DM3+PenG中，使用涡旋混合器低速悬浮，并在32℃下无搅拌地孵育96h。所述产生的L-型培养物通过移液进行悬浮，并使用DM3培养基将OD600nm调节至0.15。100μL OD-调节的Rev2L培养物与10～20μL噬菌体基因组DNA混合于50mL Falcon管中。加入150μL无菌40％PEG8000溶液并通过移液充分混合。孵育5min后，加入10mL预温热的DM3培养基，用血清移液管悬浮，并且所述转化反应在32℃下无搅拌地孵育24h，除非另有说明，。所述L-型转化反应通过移液再悬浮，并使用软琼脂覆盖法测试成熟噬菌体颗粒：5mL熔融LC软琼脂与50～500μL所述转化反应和200μL合适噬菌体繁殖株(指示菌株)的新鲜固定相培养物混合。该软琼脂混合物倾倒于固体琼脂板上，并在所述指示菌株的最佳生长温度下孵育，以允许噬菌体繁殖和可见菌斑形成。
合成基因组的体外组装
噬菌体基因组在计算机上分成携带40bp重叠末端的相似尺寸的三至六个片段。对于具有环状排列(permutation)的噬菌体基因组随机选择片段。对于具有未排列(non-permuted)基因组的噬菌体(TP21-L和B025)设计基因组片段以允许使用长重叠引物在其物理末端进行人工环化(circularization)。使用Phusion DNA聚合酶(Thermo Scientific)通过PCR由噬菌体gDNA扩增基因组片段，并随后使用二氧化硅柱进行纯化。使用所述NEBuilder HiFi DNA组装克隆试剂盒(NewEngland Biolabs)在50℃下组装合成基因组1h。对于每个组装反应，在20μL反应中每个片段使用150～250ng纯化DNA，并且15μL用于重启。

Claims (15)

1.一种产生或繁殖工程化噬菌体的方法，包括以下步骤：
-提供能够感染靶细菌的工程化噬菌体的功能性合成基因组，
-提供受体细菌，
-在转化步骤中用所述功能性合成基因组转化所述受体细菌，产生转化的受体细菌，
-在第一孵育步骤中孵育所述转化的受体细菌，其中所述工程化噬菌体繁殖于所述转化的受体细菌内，和
-在第二孵育步骤中，用靶细菌进一步孵育所述转化的受体细菌或从所述转化的受体细菌释放的繁殖的所述工程化噬菌体，其中繁殖的所述工程化噬菌体感染所述靶细菌并在所述靶细菌内进一步繁殖，
其中所述受体细菌是细胞壁缺陷型细菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受体细菌是革兰氏阳性细菌的或由其衍生的细胞壁缺陷型变体，具体而言是李斯特菌属(Listeria)细菌，具体而言单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的或由其衍生的细胞壁缺陷型变体。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶细菌是革兰氏阳性细菌，具体地选自李斯特菌属(Listeria)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、梭菌属(Clostridium)或葡萄球菌属(Staphylococcus)，更具体而言单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、伊万诺维李斯特菌(Listeriaivanovii)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受体细菌和所述靶细菌属于或衍生自不同种或不同属的成员。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述功能性合成基因组通过其片段的体外或体内组装或通过从头合成法而提供。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述功能性合成基因组具有至少10,000个碱基对，具体而言至少30,000个碱基对，更具体而言至少40,000个碱基对的长度。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转化步骤在聚乙二醇，具体而言平均分子量范围为1,000g*mol-1～30,000g*mol-1，更具体而言7,000g*mol-1～20,000g*mol-1的聚乙二醇，具体而言PEG-8000存在下进行。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一孵育步骤在范围为4～9h的时间段内，具体而言在范围为24～32h的时间段内进行实施。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受体细菌通过在细胞壁合成干扰抗生素，特别是选自β-内酰胺抗生素、糖肽抗生素、环丝氨酸、或磷霉素，和可选的渗透保护介质存在下孵育细胞带壁前体细菌而提供，产生所述受体细菌。
10.一种用于生产李斯特菌属细胞壁缺陷型细菌的方法，包括以下步骤：
-提供以基因型[Δlmo0584 Δlmo1653-54 Δlm01861]或不包含lmo0584、lmo1653-54和lmo01861的功能性同源物的基因组为特征的李斯特菌属细菌，具体而言单核细胞增生性李斯特氏菌，更具体而言单核细胞增生性李斯特氏菌菌株EGD-e，或
-提供无害李斯特菌种的细菌，具体而言无害李斯特菌的菌株2021的细菌；和
-在细胞壁合成干扰抗生素存在下和可选地在渗透保护介质存在下培养所述细菌。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述细胞壁合成干扰抗生素选自包括β-内酰胺抗生素、糖肽抗生素、环丝氨酸、或磷霉素的组中，具体而言是青霉素G。
12.一种李斯特菌属的细胞壁缺陷型细菌，其特征在于基因型[Δlmo0584Δlmo1653-54Δlm01861]或不包含lmo0584、lmo1653-54和lmo01861的功能性同源物的基因组。
13.所述细胞壁缺陷型细菌，其中所述细菌是单核细胞增生性李斯特氏菌，具体而言单核细胞增生性李斯特氏菌菌株EGD-e。
14.根据权利要求12或13所述的细胞壁缺陷型细菌，能够通过权利要求10或11所述的方法获得。
15.一种产生或繁殖噬菌体的方法，包括以下步骤：
-提供能够感染靶细菌的噬菌体的功能性基因组，
-提供受体细菌，
-在转化步骤中用所述功能性基因组转化所述受体细菌，产生转化的受体细菌，
-在第一孵育步骤中孵育所述转化的受体细菌，其中所述噬菌体繁殖于所述转化的受体细菌内，和
-在第二孵育步骤中，用所述靶细菌进一步孵育所述转化的受体细菌，其中繁殖的所述噬菌体感染所述靶细菌并在所述靶细菌内进一步繁殖，
其中所述受体细菌是细胞壁缺陷型细菌，并且所述受体细菌和所述靶细菌属于或衍生自不同种或不同属的成员。
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