JP7323178B2 - Ｌ型細菌における合成バクテリオファージゲノムの再起動 - Google Patents

Description

本発明は、バクテリオファージ、特に操作されたバクテリオファージを産生する又は増殖させる方法及び手段に関する。

バクテリオファージ（ファージ）は、細菌に排他的に感染し、細菌の天敵となるウイルスである。ほとんどのファージは、所与の細菌種の菌株の特定のサブセットに、その他の近縁の細菌を標的とすることなく感染する。ファージは、その並外れた特異性及び溶菌能力ゆえに、様々な生物医学的及び生物工学的適用に用いられている。一方では、ファージは、生きた細菌病原体を迅速に高感度で検出する診断ツールとして使用されている。また他方では、ビルレントファージは、特定の種の生物的防除に適用されており、工業生産過程及び食品から潜在する病原体を効果的に除去する。また、ＥＵ及びＵＳＡ（ＷＨＯ及びＣＤＣ）では年間推定４８，０００名が死亡するほどに抗生物質耐性が増しているため、代替の抗菌剤としてのファージの適用は、再興してきた対象の分野であり、ファージ療法による取り組みは有望な結果を示している。公衆衛生の脅威である耐性菌の存在の増加と併せて、伝統的な抗生物質の発見率の低さを考慮すると、ファージ療法の復興が続くことを想定するのが妥当である。ファージの属及び種特異性の高さ、自己複製する性質、並びに生産コストの低さにもかかわらず、ファージは、生物医学的環境におけるファージの使用を依然として制限する数多くの課題に直面している。すなわち、個々のファージの宿主範囲は限定されているため、ファージ反応混液を、病原性種のすべての医学的関連菌株をカバーするように設計する必要がある。一般的にファージ製品、特にファージ反応混液について規制当局の承認を得ることは難しく、規制の枠組みははっきりしていない。加えて、溶原性（テンペレート）ファージは、細胞溶菌を誘導することなく宿主ゲノムへ組み込むことができ、形質導入による抗生物質耐性の拡散の一因にもなることがあり、又は溶原変換によって細菌毒性を増大させることもあり、これによって、生物的防除剤としての溶原性ファージの使用は、事実上、除外されている。また、標的細胞は、過剰のファージ耐性機序、いくつか例を挙げると、受容体の多様化、バイオフィルム形成、及びＣＲＩＳＰＲ干渉などをコードすることができる。ファージのゲノムを改変することによって、これらの制限の多くを克服することができ、追加の有益な特性をファージゲノムへ含むことができる。

残念ながら、ビルレントファージのゲノム操作は、難しく、よくても作業集約的なプロセスである。ほとんどの場合、ファージゲノムは、感染中に、相同配列を保有するプラスミドとの相同組換え、及び所望の遺伝子変更によって改変される。ファージ複製は速く、組換え率は非常に低いことが多いため（１０^－４～１０^－１０）、組換えファージのスクリーニングは、労働集約的であり、レポーター遺伝子の組込みを必要とする。最近、研究者らによって、ファージゲノムを改変する簡潔な合成手法が示された。酵母人工染色体（ＹＡＣ）と、オーバーラップするファージゲノム断片とを酵母細胞でインビボで連結させて、ＹＡＣに捕捉された完全な組換えゲノムを作製した。続いて、ＹＡＣファージＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）へ形質転換して、これらのファージを再起動させた。今のところ、この手法は、グラム陰性細胞に感染し、宿主非依存性複製を特徴とするＴ７ファミリーのウイルスに限定されている。同様の手法が、様々なファージファミリー及び／又はグラム陽性細胞に感染するファージに適合可能であるかどうかは、現在は不明である。

したがって、グラム陽性宿主に伴うファージにも適用可能な完全な組換えファージゲノムを作製するための簡単で効率的な方法が必要である。

上述の背景に基づくと、本発明の目的は、特にグラム陽性宿主細胞に感染するバクテリオファージを含むバクテリオファージを増殖させる、簡単で効率的な方法及び手段を提供することである。

この目的は、請求項１又は請求項１０に記載の方法、及び請求項１２に記載の細胞壁欠損細菌によって達成される。
それらによれば、本発明の第１の態様は、バクテリオファージ、特に操作されたバクテリオファージを増殖させる方法に関する。この方法は、
標的細菌に感染することができるバクテリオファージの機能性ゲノムを用意するステップと、
レシピエント細菌を用意するステップと、
形質転換ステップで、レシピエント細菌を機能性ゲノムで形質転換し、形質転換されたレシピエント細菌を産するステップと、
第１のインキュベーションステップで、形質転換されたレシピエント細菌をインキュベートするステップであって、バクテリオファージが、形質転換されたレシピエント細菌内で増殖される、ステップと、
第２のインキュベーションステップで、形質転換されたレシピエント細菌を、標的細菌と共にさらにインキュベートするステップであって、増殖させたバクテリオファージが標的細菌に感染し、標的細菌内でさらに増殖される、ステップと
を含み、レシピエント細菌が細胞壁欠損細菌である、方法である。

本明細書の関連において「細胞壁欠損」細菌という用語は、浸透圧的に安定化させた培地中で細胞壁を欠損した状態で活発に増殖する、細胞壁のある細菌の細胞壁欠損変種を指す。細胞壁欠損細菌は、例えば大きなＤＮＡ分子を有する、グラム陽性菌の形質転換を通常制限している多層のペプチドグリカンエンベロープを欠く。細胞壁欠損細菌はまた、Ｌ型（Ｌ－ｆｏｒｍ）細菌、Ｌ型（Ｌ－ｐｈａｓｅ）細菌又はＬ型変種（Ｌ－ｐｈａｓｅ ｖａｒｉａｎｔ）としても公知である。

したがって、このような細胞壁欠損細菌は、特に、代謝の活発な細胞壁欠損細菌、及び／又は活発に増殖することができる細胞壁欠損細菌である。特に、このような細胞壁欠損細菌は、一時的に細胞壁欠損であっても永久に細胞壁欠損であってもよい。

本明細書の関連において「合成ゲノム」という用語は、人工ゲノム又は天然に存在しないゲノムを特に指す。同様に、本明細書の関連において「操作されたバクテリオファージ」という用語は、特に合成ゲノムを特徴とする、人工バクテリオファージ又は天然に存在しないバクテリオファージを特に指す。

特に、機能性ゲノムは、１つ又は複数の「裸の」核酸の形態、例えばタンパク質のキャプシド又はエンベロープを伴わない形態で形質転換される。

別法として、第２のインキュベーションステップで、増殖させたバクテリオファージが、標的細菌と共にインキュベートされ、増殖させたバクテリオファージが、形質転換されたレシピエント細菌から放出される、特に、例えば浸透圧ショックによって形質転換されたレシピエント細菌を溶解することによって放出される。

本発明の方法は、現行の最新技術と比較するとはるかに速く信頼性の高い、組換えバクテリオファージ又は天然に存在するバクテリオファージの産生、増殖、再活性化、又は操作の新規の手法である。本手法は、検出可能なレポーター遺伝子の正確な組換え又は組込みのためのスクリーニングは必要ではない。さらに、本手法は、グラム陽性生物に感染する、非常に広範なファージに適用可能である。本方法は、所望の生物医学的及び生物工学的特性を有する、目的に合わせたバクテリオファージの生成へ踏み出された大きな一歩である。本発明の方法は、公知の方法の限定を回避する点で有利であり、したがって、グラム陽性生物に感染するファージに広範囲に適用可能である。

特に、形質転換ステップ及び／又は第１のインキュベーションステップは、浸透圧保護培地中で実施される。

本明細書の関連において「浸透圧保護培地」という用語は、細胞壁欠損細菌の生存及び／又は増殖を可能にし、非毒性の水溶性の浸透圧活性化合物を、特に、細胞壁欠損細菌と該培地との間の浸透圧が細胞壁欠損細菌の破裂を起こす閾値を下回る濃度でさらに含む培地を特に指す。このような化合物の非限定的な例としては、コハク塩酸などの非毒性の有機酸若しくはそれらの塩、炭水化物、又は硫酸アンモニウム若しくは塩化ナトリウムなどの非毒性の塩が挙げられる。

特に、第２のインキュベーションステップは、浸透圧保護培地の非存在下で実施される。

ある実施形態において、形質転換ステップは、液体培地中で実施される。ある実施形態において、第１のインキュベーションステップは、液体培地中で実施される。ある実施形態において、第２のインキュベーションステップは、液体培地中で実施される。

ある実施形態において、浸透圧保護培地は、コハク塩酸を、特に、０．０７５ｍｏｌ・ｌ^－１～０．５ｍｏｌ・ｌ^－１範囲の濃度で含む。ある実施形態において、浸透圧保護培地は、単糖、二糖、又は三糖、特に、グルコース又はショ糖を含む。ある実施形態において、浸透圧保護培地はグリセリンを含む。ある実施形態において、浸透圧保護培地は、０．２５ｍｏｌ・ｌ^－１～０．７５ｍｏｌ・ｌ^－１の範囲の濃度の、特に０．５ｍｏｌ・ｌ^－１の濃度のショ糖を含む。

ある実施形態において、レシピエント細菌は、グラム陽性菌の又はグラム陽性菌に由来した細胞壁欠損変種である。

本明細書の関連において「に由来した」という用語は、個々の細菌、例えば親の細胞壁のあるグラム陽性菌が、例えば、細胞壁合成を妨害する抗生物質の存在及び／又は浸透圧保護培地の存在下などの培養条件によって細胞壁欠損細菌へと形質転換されるプロセスを特に指す。

ある実施形態において、レシピエント細菌は、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の細胞壁欠損細菌である。ある実施形態において、レシピエント細菌は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の又はリステリア・モノサイトゲネスに由来した細胞壁欠損変種である。ある実施形態において、レシピエント細菌は、リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤ－ｅの又はリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤ－ｅに由来した細胞壁欠損変種である。ある実施形態において、レシピエント細菌は、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）の又はリステリア・イノキュアに由来した細胞壁欠損変種である。ある実施形態において、レシピエント細菌は、リステリア・イノキュア２０２１の又はリステリア・イノキュア２０２１に由来した、特にリステリア・イノキュア菌株ＳＬＣＣ５６３９（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｗｕｒｚｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に由来した、細胞壁欠損変種である。

ある実施形態において、標的細菌は、グラム陽性菌である。ある実施形態において、標的細菌は、リステリア属、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、又はスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）から選択される。ある実施形態において、標的細菌は、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・イノキュア、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、又はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓ ａｕｒｅｕｓ）から選択される。

ある実施形態において、レシピエント細菌と標的細菌とは、異なる種に属する又は由来する。ある実施形態において、レシピエント細菌と標的細菌とは、異なる属のメンバーに属する又は由来する。

ある実施形態において、レシピエント細菌は、リステリア属のメンバーに由来しており、標的細菌は、バチルス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、クロストリジウム属、又はスタフィロコッカス属から選択される属に属する。

ある実施形態において、機能性ゲノムは、天然に存在するバクテリオファージゲノムである。ある実施形態において、機能性ゲノムは、合成又は人工バクテリオファージゲノムであり、特に、操作されたバクテリオファージの合成又は人工バクテリオファージゲノムである。

本明細書の関連において「合成又は人工バクテリオファージゲノム」という用語は、人工の、天然に存在しない核酸構築物を特に指す。

このような合成又は人工バクテリオファージゲノムは、例えば、遺伝子、調節エレメント（例えばプロモーター）、オペロン、又はオープンリーディングフレームなどの１つ又は複数の異質の遺伝学的エレメントが組み込まれているか、及び／又は天然に存在する遺伝学的エレメントが置換、改変、及び／又は欠失されている、天然に存在するバクテリオファージゲノムに由来していてもよい。このような合成バクテリオファージゲノムはまた、複数の異なる生物に由来する複数の遺伝学的エレメントの寄せ集めであってもよい。

ある実施形態において、機能性ゲノム、特に、機能性合成又は人工ゲノムは、それらの断片のインビトロ又はインビボ連結によって用意される。特に、機能性ゲノムの断片は、デノボ合成、クローニング、又は増幅によって用意され得、次いで、用意された断片は、当技術分野で公知の方法によって機能性ゲノムへと連結され得る。インビトロ連結の非限定的な例としては、上述の断片が、断片を連結させるオーバーラッピング配列を共有している、ギブソンアセンブリー法がある。インビボ連結の非限定的な例としては、酵母細胞を、オーバーラッピング配列をやはり含む上述の断片で形質転換し、酵母細胞内でこれらの断片を連結させる、酵母連結法がある。

ある実施形態において、機能性ゲノム、特に、機能性合成又は人工ゲノムは、デノボ合成によって用意される。

ある実施形態において、合成又は人工バクテリオファージゲノムは、テンペレートバクテリオファージに由来しており、この合成又は人工バクテリオファージゲノムは、溶菌サイクル又は溶原性制御領域のリプレッサーの遺伝子を欠く。

ある実施形態において、機能性ゲノムは、線状又は環状核酸分子である。ある実施形態において、機能性ゲノムは、１本鎖又は２本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡ分子である。

ある実施形態において、機能性ゲノムは、少なくとも１０，０００塩基対の長さを有する。ある実施形態において、機能性ゲノムは、少なくとも３０，０００塩基対の長さを有する。ある実施形態において、機能性ゲノムは、少なくとも４０，０００塩基対の長さを有する。ある実施形態において、機能性ゲノムは、少なくとも１２０，０００塩基対の長さを有する。ある実施形態において、機能性ゲノムは、１０，０００塩基対～１６０，０００塩基対の範囲の長さを有する。ある実施形態において、機能性ゲノムは、３５，０００塩基対～１６０，０００塩基対の範囲の長さを有する。ある実施形態において、機能性ゲノムは、４０，０００塩基対～１３０，０００塩基対の範囲の長さを有する。

ある実施形態において、機能性ゲノムは、サイフォウイルス（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｕｓ）、特に、サイフォウイルスＴＰ２１－Ｌ、サイフォウイルス２６３８Ａ、サイフォウイルスＰ３５、サイフォウイルスＢ０２５、サイフォウイルスＢ０３５、サイフォウイルスＢ０５６、サイフォウイルスＰＳＡ、若しくはサイフォウイルスＰ７０、又はマイオウイルス（Ｍｙｏｖｉｒｕｓ）、特に、マイオウイルスＡ５１１、マイオウイルスＰ１００、マイオウイルス・バスティーユ（Ｍｙｏｖｉｒｕｓ Ｂａｓｔｉｌｌｅ）、若しくはファージＫ、又はポドウイルス（ｐｏｄｏｖｉｒｕｓ）に由来する。

ある実施形態において、形質転換ステップは、ポリエチレングリコールの存在下で実施される。ある実施形態において、ポリエチレングリコールは、１，０００ｇ・ｍｏｌ^－１～３０，０００ｇ・ｍｏｌ^－１の範囲の平均分子量を有する。ある実施形態において、ポリエチレングリコールは、７，０００ｇ・ｍｏｌ^－１～２０，０００ｇ・ｍｏｌ^－１の範囲の平均分子量を有する。ある実施形態において、ポリエチレングリコールは、ＰＥＧ－８０００である。ある実施形態において、形質転換ステップは、約６％（ｗ／ｖ）～約３６％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度のポリエチレングリコールの存在下で実施される。ある実施形態において、形質転換ステップは、約２４％（ｗ／ｖ）の濃度のポリエチレングリコールの存在下で実施される。

ポリエチレングリコールに関して「平均分子量」という用語は、個々のポリエチレングリコールの算術平均又は分子量分布の中央値を特に指す。このような平均分子量は、当業者に公知の方法によって、例えば、静的又は動的光散乱（ＳＬＳ、ＤＬＳ）、サイズ排除クロマトグラフィー、又はゲル電気泳動などによって決定され得る。

ある実施形態において、第１のインキュベーションステップは、４時間～９６時間の範囲の期間にわたって実施される。ある実施形態において、第１のインキュベーションステップは、２４時間～３２時間の範囲の期間にわたって実施される。

ある実施形態において、第１のインキュベーションステップは、１５℃～３７℃の範囲の温度で実施され、特に、２０℃～３２℃の範囲の温度で実施される。ある実施形態において、第２のインキュベーションステップは、１５℃～３７℃の範囲の温度で実施され、特に、２０℃～３２℃の範囲の温度で実施される。ある実施形態において、形質転換ステップは、１５℃～３７℃の範囲の温度で実施され、特に、２０℃～３７℃の範囲の温度で実施される。

ある実施形態において、レシピエント細菌は、細胞壁のある前駆細菌を、細胞壁合成を妨害する抗生物質の存在下でインキュベートし、レシピエント細菌を産することによって用意される。特に、前駆細菌は、細胞壁合成を妨害する抗生物質の存在下で、本条件での前駆細菌の倍加時間より長い期間にわたってインキュベートされる。ある実施形態において、前駆細菌は、細胞壁合成を妨害する抗生物質の存在下で、２日～５日の範囲の期間にわたって、特に、３日～４日の範囲の期間にわたってインキュベートされる。

ある実施形態において、細胞壁合成を妨害する抗生物質は、ベータラクタム系抗生物質、グリコペプチド系抗生物質、ホスホマイシン、又はサイクロセリンから選択される。

ある実施形態において、ベータラクタム系抗生物質は、セファロスポリン系、カルバセフェム系、モノバクタム系、又はペニシリン系から選択される。

ある実施形態において、細胞壁合成を妨害する抗生物質は、ペニシリンＧである。

別法として、レシピエント細菌は、細胞壁のある前駆細菌内においてタンパク質レベル又はゲノムレベルで細胞壁合成に関連するタンパク質を阻害することによって、又は細胞壁のある前駆細菌を、リゾチームなどの細胞壁分解又は溶解酵素の存在下及び浸透圧保護培地の存在下でインキュベートすることによって用意され得る。

本発明の別の態様によれば、リステリア属の細胞壁欠損細菌を作製する方法が提供される。この方法は、
遺伝子型［Δｌｍｏ０５８４ Δｌｍｏ１６５３－５４ Δｌｍ０１８６１］を特徴とする、若しくはｌｍｏ０５８４、ｌｍｏ１６５３－５４、及びｌｍｏ０１８６１の機能性相同体を含まないゲノムを特徴とする、リステリア属の細菌を用意するステップ、又は
リステリア・イノキュア種の細菌、特に、リステリア・イノキュアの菌株２０２１の細菌、さらにより具体的には、リステリア・イノキュア菌株ＳＬＣＣ５６３９（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｗｕｒｚｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用意するステップと、
細菌を、細胞壁合成を妨害する抗生物質の存在下で、任意選択で浸透圧保護培地の存在下で培養するステップと
を含む。

「ｌｍｏ０５８４」という用語は、リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤ－ｅの遺伝子（遺伝子ＩＤ：９８４６６１、ＮＣＢＩ遺伝子データベース）を指す。

「ｌｍｏ１６５３－５４」という用語は、リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤ－ｅの２つの遺伝子（遺伝子ＩＤ：９８５６７４及び遺伝子ＩＤ：９８５６７３、ＮＣＢＩ遺伝子データベース）を指す。

「ｌｍｏ０１８６１」という用語は、リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤ－ｅの遺伝子（遺伝子ＩＤ：９８５８３１、ＮＣＢＩ遺伝子データベース）を指す。

本明細書の関連において「機能性相同体」という用語は、同一の機能を有するが、核酸配列が異なる遺伝子を指す。

ある実施形態において、リステリア属の細菌は、遺伝子ｌｍｏ０５８４、ｌｍｏ１６５３－５４、及びｌｍｏ０１８６１、又はそれらの相同体を不活性化することによって用意される。ある実施形態において、遺伝子ｌｍｏ０５８４、ｌｍｏ１６５３－５４、及びｌｍｏ０１８６１、又はそれらの相同体の不活性化は、遺伝子ｌｍｏ０５８４、ｌｍｏ１６５３－５４、及びｌｍｏ０１８６１、又はそれらの相同体の欠失、遺伝子ｌｍｏ０５８４、ｌｍｏ１６５３－５４、及びｌｍｏ０１８６１、又はそれらの相同体内での、塩基置換、欠失、挿入、又は配列逆位によって実施される。

ある実施形態において、細胞壁合成を妨害する抗生物質は、ベータラクタム系抗生物質、特に、セファロスポリン系、カルバセフェム系、モノバクタム系、若しくはペニシリン系、グリコペプチド系抗生物質、ホスホマイシン、又はサイクロセリンから選択される。

ある実施形態において、リステリア属の細菌は、リステリア・モノサイトゲネスである。ある実施形態において、リステリア属の細菌は、リステリア・モノサイトゲネス菌株ＥＧＤ－ｅである。

ある実施形態において、細菌は、２０℃～３２℃の範囲の温度で培養される。

別法として、細胞壁欠損細菌は、タンパク質レベル又はゲノムレベルで細胞壁合成に関連するタンパク質を阻害することによって、又は細胞壁のある細菌をリゾチームなどの細胞壁分解又は溶解酵素の存在下及び浸透圧保護培地の存在下でインキュベートすることによって作製され得る。

本発明のさらに別の態様によれば、遺伝子型［Δｌｍｏ０５８４ Δｌｍｏ１６５３－５４ Δｌｍ０１８６１］を特徴とする、又はｌｍｏ０５８４、ｌｍｏ１６５３－５４、及びｌｍｏ０１８６１の機能性相同体を含まないゲノムを特徴とする、リステリア属の細胞壁欠損細菌が用意される。

ある実施形態において、細胞壁欠損細菌は、リステリア・モノサイトゲネスである。ある実施形態において、細胞壁欠損細菌は、リステリア・モノサイトゲネス菌株ＥＧＤ－ｅである。

ある実施形態において、細胞壁欠損細菌は、本発明の上記の態様による方法によって得られ得る又は得られる。

個々の分離可能な特徴についての選択肢が「実施形態」として本明細書において説明されている場合はいつでも、このような選択肢を自由に組み合わせて、本明細書において開示された本発明の個別の実施形態を構成することができることを理解されたい。

本発明は、以下の実施例及び図によってさらに例証され、これらからさらなる実施形態及び利点が引き出され得る。これらの実施例は、本発明を例証するが、その範囲を限定しないことが意図される。

Ｌ型菌株Ｒｅｖ２Ｌにおけるリステリアバクテリオファージゲノムの再起動を示す図である。（Ａ～Ｂ）Ｌ型菌株Ｒｅｖ２Ｌにおいてリステリアファージを再起動させる能力は、リステリアファージＰ３５のゲノムＤＮＡを使用して（Ａ）に図示したように評価した。 Ｌ型形質転換反応物は、（Ｂ）に示したように調製し、３２℃でインキュベートし、形質転換の２４時間後に、指示菌に対するプラーク形成を調べた。デオキシリボヌクレアーゼＩは、デオキシリボヌクレアーゼＩを使用したＰ３５ｇＤＮＡの３０分間の前消化を示す。（Ｃ）形質転換及び再起動の効率は、Ｐ３５ｇＤＮＡの希釈系列を使用して決定した。 （Ｄ）７個の追加のリステリアファージの１セットは５００～１０００ｎｇのｇＤＮＡを使用してＲｅｖ２Ｌにおいて再起動させ、指示菌としてリステリア・モノサイトゲネス又はリステリア・イバノビイを使用して検出した。ファージ特性を、表形式で記載する。 （Ｅ）Ｌ型におけるバクテリオファージ産生速度論を、３つファージについて、９６時間かけて評価した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。Φ＝ファージ、ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール、ｇＤＮＡ＝ゲノムＤＮＡ、ｔｒ＝末端重複、ｃｐ＝循環置換、ｃｏｓ＝付着末端部位、ｎｄ＝未特定。 リステリアＬ型における（Ａ）バチルスの再起動を示す図である。Ｒｅｖ２Ｌ細胞を、１～５μｇのファージｇＤＮＡで形質転換し、３２℃で２４時間インキュベートし、ファージのそれぞれの指示菌に対するファージ産生についてアッセイした。ｇＤＮＡ又はＬ型細胞のいずれかを欠く形質転換反応物を、対照として用いた。Φ＝ファージ。 リステリアＬ型における（Ｂ）スタフィロコッカスファージゲノムの再起動を示す図である。Ｒｅｖ２Ｌ細胞を、１～５μｇのファージｇＤＮＡで形質転換し、３２℃で２４時間インキュベートし、ファージのそれぞれの指示菌に対するファージ産生についてアッセイした。ｇＤＮＡ又はＬ型細胞のいずれかを欠く形質転換反応物を、対照として用いた。Φ＝ファージ。 リステリアＬ型における、合成したインビトロ連結バクテリオファージゲノムの再起動を示す図である。Ｒｅｖ２Ｌにおける合成ゲノムの再起動についての一般的なワークフローを（Ａ）に図示する。ファージのゲノムＤＮＡは、リステリア・モノサイトゲネスファージＰ３５、リステリア・イノキュアファージＢ０２５、及びバチルス・セレウスファージＴＰ２１－Ｌから抽出し、精製した。 ハイファイポリメラーゼを使用して、全長ゲノムを包含する、オーバーラップするＰＣＲ断片を生成し（Ｂ）、インビトロで連結させ、特段の指示がない限り、環状分子を生成した。連結反応物を、Ｒｅｖ２Ｌ細胞で形質転換し、再起動させ、不完全な連結物を対照として使用して、それぞれの指示菌にプレーティングした（Ｃ）。 ハイファイポリメラーゼを使用して、全長ゲノムを包含する、オーバーラップするＰＣＲ断片を生成し（Ｄ）、インビトロで連結させ、特段の指示がない限り、環状分子を生成した。連結反応物を、Ｒｅｖ２Ｌ細胞で形質転換し、再起動させ、不完全な連結物を対照として使用して、それぞれの指示菌にプレーティングした（Ｅ）。 ハイファイポリメラーゼを使用して、全長ゲノムを包含する、オーバーラップするＰＣＲ断片を生成し（Ｆ）、インビトロで連結させ、特段の指示がない限り、環状分子を生成した。ファージＴＰ２１－Ｌについて、再起動反応物を、指示菌を使用して２４時間後にファージ産生をアッセイし、又は（増幅）の記載があるものは、形質転換の６時間後に１０μｌのＨＥＲ１３９９静置培養物を再起動反応物に追加し、２４時間後にファージ産生をアッセイした（Ｇ）。 テンペレートリステリアファージＢ０２５の、テンペレートからビルレントへの生活様式の変換を示す図である。インビトロゲノム連結戦略を使用して、組込みのリプレッサーを欠く（Δｒｅｐ）又は溶原性制御領域全体を欠く（ΔＬＣＲ）テンペレートリステリアファージＢ０２５の変異体を作製した。ワークフローを（Ａ）に示す。野生型連結物の断片３は溶原性制御遺伝子を含有し、断片３をリプレッサーのみ又はＬＣＲ全体のいずれかを省いて２つのオーバーラップする断片に分割して、ゲノム連結のための５つのＰＣＲ断片を産した（Ｂ）。 組換えゲノムを再起動させ、得られたファージ変異体を精製し、ＰＣＲ及び配列決定を使用して正確な遺伝子型をアッセイした（Ｃ）。 軟寒天重層法を使用して、Ｌ．イバノビイＷＳＬＣ３００９に、数を増やした野生型、Δｒｅｐ、及びΔＬＣＲファージを感染させた。 生き残った細菌叢（Ｂ０２５ｗｔ）又はシングルコロニー（Ｂ０２５Δｒｅｐ及びＢ０２５ΔＬＣＲ）について、示したプライマー対を使用して、Ｂ０２５プロファージの存在又は非存在をアッセイした（Ｅ）。ＬＣＲ＝溶原性制御領域、ＰＦＵ＝プラーク形成単位、ａｔｔＢ＝プロファージ組込みのための細菌付着部位、ａｔｔＬ＝ＷＳＬＣ３００９：：Ｂ０２５における左側のプロファージフランキング領域。 Ｌ型菌株Ｒｅｖ２Ｌにおけるリステリアバクテリオファージゲノム再起動をさらに示す図である。各パラメーターが別々に最適化された、ファージゲノムの再起動の詳細なワークフローを（Ａ）に示す。 最適化したパラメーターには、形質転換前のＲｅｖ２Ｌ増殖時間（Ｂ）、形質転換時のＬ型培養物の吸光度（６００ｎｍ）調整（Ｃ）、ＤＭ３培地の添加前の最終ＰＥＧ濃度（Ｄ）が含まれる。 最適化したパラメーターには、インキュベーション前にＤＮＡ／Ｌ型／ＰＥＧ混合物に添加したＤＭ３の量（Ｅ）、及び使用したＰＥＧ鎖の平均分子量（Ｆ）が含まれる。選択した至適条件を示す（アスタリスク）。再起動のために使用したバクテリオファージＤＮＡの質は、パルスフィールドゲル電気泳動を使用して評価した（Ｇ）。 ファージＤＮＡの希釈系列を使用して、ファージＰ３５及びＡ５１１の再起動効率を比較した（Ｈ）。様々なリステリアファージの細胞壁のあるＲｅｖ２細胞に感染する能力は、Ｒｅｖ２又はファージ指示菌を含有する軟寒天重層上にファージ希釈液をスポットすることによって評価した。（Ｉ）ＰｅｎＧ＝ペニシリンＧ、ＯＤ＝吸光度、ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。 リステリアＬ型における、合成したインビトロ連結バクテリオファージゲノムの再起動を示す図である。投入材料としてゲノムＤＮＡ及びインビトロ連結ゲノムを使用して、ゲノム再起動の効率を比較した。すなわち、Ｒｅｖ２Ｌにおける再起動のために、Ｐ３５ｇＤＮＡの４倍希釈系列又はギブソンアセンブリー反応物を使用し、それぞれ、ｇＤＮＡには２μｇの投入材料を、アセンブリー反応物には１２５ｎｇの投入材料を用いて開始した。形質転換反応物当たりの総ｐｆｕを定量化し、比較した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。 ＴＰ２１－Ｌ溶原性制御遺伝子の欠失を示す図である。インビトロゲノム連結戦略を使用して、組込みのリプレッサーを欠く（Δｒｅｐ）、又は溶原性制御領域全体を欠く（ΔＬＣＲ）テンペレートバチルスファージＴＰ２１－Ｌの変異体を作製した。ワークフローを（Ａ）に示す。野生型連結物の断片３は溶原性制御遺伝子を含有し、断片３をリプレッサーのみ又はＬＣＲ全体のいずれかを省いて２つのオーバーラップする断片に分割して、ゲノム連結のための５つのＰＣＲ断片を産した。 組換えゲノムを再起動させ、得られたファージ変異体を精製し、ＰＣＲ及び配列決定を使用して正確な遺伝子型をアッセイした（Ｂ）。ＬＣＲ＝溶原性制御領域。 Ｌ型菌株Ｒｅｖ２（Ｌ．モノサイトゲネス）におけるリステリアバクテリオファージゲノムの再起動、及び非病原性リステリア・イノキュア２０２１（ＳＬＣＣ５６３９）から得られた可逆性Ｌ型における、リステリアバクテリオファージゲノムの再起動を示す図である。２つのＬ型培養物のそれぞれは、Ｌ．モノサイトゲネスバクテリオファージＰ７０のゲノムＤＮＡ（１μｇ）で形質転換し、３２℃で２４時間インキュベートし、指示菌としてＬ．モノサイトゲネスＬ９９を使用して、プラーク形成を調べた。軟寒天重層のプラーク（感染の２４時間後）を示す。

本発明は、新規のリステリア・モノサイトゲネスＬ型菌株Ｒｅｖ２Ｌが、ゲノム再起動をもたらす、すなわち、裸のＤＮＡからの感染性ビリオンの産生をもたらす、無傷の精製されたバクテリオファージＤＮＡで形質転換され得ることを示す。再起動は、ファージ指向性、形態、ゲノムサイズ、又はゲノム構造に依存しない、リステリア・モノサイトゲネス及びリステリア・イノキュアファージの不均質な群からなる一群に対して適用することができた。注目すべきことに、このゲノム再起動手法はまた、感染の属の壁を効果的に迂回して、バチルス及びスタフィロコッカスに感染する幾つかのファージに対しても成功した。合成生物学の手法において、野生型及び組換えウイルスの両方を生成するために、増幅させたオーバーラップする断片を使用して、バクテリオファージゲノムをインビトロで連結させ、続いて、Ｒｅｖ２Ｌ細胞において再起動させた。この戦略の概念実証として、発明者らは、テンペレートリステリアファージＢ０２５の溶原性制御遺伝子を削除し、組換えウイルスがビルレントの表現型を獲得したことを実証した。インビトロゲノム連結とＬ型形質転換とを組み合わせてバクテリオファージ操作することによって、グラム陽性病原体に感染するファージに関する基礎及び応用研究両方のための目的に合わせたファージの開発に拍車がかかることになるであろう。

特に、下記の２段階のプロトコールが、遺伝子改変バクテリオファージの生成のために使用され得る。

第１のステップにおいて、合成バクテリオファージゲノムを、市販のギブソンアセンブリーをベースにした方法を使用してインビトロで連結させる。バクテリオファージゲノムは、天然のファージ複製の間に生じるＤＮＡ中間体を模倣して環状の２本鎖分子として連結させる。原理的には、合成ゲノムの形成をもたらすあらゆる方法がこの第１のステップのために使用され得、したがって、合成ゲノムはギブソンアセンブリーで連結させたゲノムに限定されない。

第２のステップにおいて、インビトロ連結ウイルスゲノム／合成ゲノムを、これらの合成ファージが再起動されて感染性粒子を産生するリステリア・モノサイトゲネス細胞へ形質転換する。この形質転換反応物のために、発明者らは、野生型リステリア細胞を使用せず、代わりに新規に同定したリステリア・モノサイトゲネスＬ型菌株Ｒｅｖ２Ｌに依った。この菌株は、浸透圧的に安定化させた培地が使用されて細菌の溶解を防止している限りは、無傷の細胞壁の非存在下で増殖し、分裂する能力を有する。Ｒｅｖ２Ｌは、無傷の細胞壁を欠いているため、無傷のバクテリオファージゲノムなどの大きなＤＮＡ分子で形質転換され得る。この形質転換反応物のために、発明者らは、プロトコールに基づいて、最適化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）を使用した。形質転換したＬ型細菌を、２４時間インキュベートして、ファージ再起動を可能にした。これらの反応物から、合成ファージを単離し、増幅させるために、続いて、Ｌ型を、当該ファージの本来の増殖菌株と混合し、インキュベートした。Ｌ型細胞は、ファージにコードされた酵素の活性、又は単に膜の浸透圧の不安定化のいずれかによって溶解されるため、子孫ファージをＬ型細胞から積極的に放出させる必要はない。

さらに重要なことには、この方法は、リステリアファージに限定されることなく、グラム陽性菌又はその他の細菌のその他のファージに適用され得る。

概念実証の詳細な説明
グラム陽性細胞におけるファージゲノム再起動に対処するために、発明者らは、食品媒介病原体リステリア・モノサイトゲネスに感染するビルレントサイフォウイルスＰ３５を使用した。通常、かなり低い効率でスーパーコイルプラスミドを１０ｋｂまでしか取り込まない細胞壁のあるリステリア細胞へのエレクトロポレーションには、Ｐ３５の３５，８２２ｂｐの線状ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は大きすぎる。したがって、発明者らは、細胞壁のある細胞と従来のエレクトロポレーションのプロトコールを使用して、ゲノム再起動に対処することができなかった。ペプチドグリカンエンベロープが、より大きなＤＮＡの形質転換に対する主な障害であるという仮定に基づき、発明者らは、精製された線状Ｐ３５ｇＤＮＡのためのレシピエントとして、代謝的に活性であるが細胞壁を欠損しているリステリアＬ型を使用することの可能性を検討した。Ｌ型は、浸透圧保護培地中で、細胞壁合成を標的とする抗生物質の存在下で、増殖させ、継代培養を長期間繰り返すことによって誘導される。本発明の方法のために、発明者らは、Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤ－ｅをＤＭ３培地中でペニシリンＧ（ｐｅｎＧ）に長期曝露することによって得られ、Ｌ型（Ｒｅｖ２Ｌと呼ぶ）としての増殖と細胞壁のある細菌（Ｒｅｖ２）としての増殖とを切り換える能力を有する、新規のリステリア菌株Ｒｅｖ２［Δｌｍｏ０５８４ Δｌｍｏ１６５３－５４ Δｌｍ０１８６１］を使用した。

発明者らは、ファージｇＤＮＡによるＬ型細菌のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）形質転換法のワークフローを考案し（図１Ａ及び図５Ａ）、Ｐ３５が、ｇＤＮＡ、Ｌ型、及びＰＥＧ依存性プロセスにおいて再起動されることを明らかにした（図１Ｂ）。この目的のために、精製したＰ３５ｇＤＮＡを、ペニシリンＧ（ｐｅｎＧ）で誘導したＲｅｖ２Ｌの増殖培養物及びＰＥＧ８０００溶液と混合した。続いて、ＰＥＧを浸透圧的に安定化させたＤＭ３培地で希釈し、この混合物を３２℃で２４時間インキュベートして、ファージ再起動を可能にした。このＬ型形質転換反応物を、指示菌としてファージＰ３５の増殖菌株（Ｌ．モノサイトゲネスＭａｃｋ）を使用して、再起動させたファージの存在についてアッセイした。

最も高いファージ収率を得るために、発明者らは、Ｐ３５ｇＤＮＡを使用する再起動プロトコールの各ステップを最適化した（詳細については、図５及び方法のセクションを参照されたい）。このような最適化した条件下で、発明者らは、（使用したＤＮＡが無傷のｇＤＮＡのみからなったと仮定して）約６６，０００ゲノムに相当する２．６ｐｇのＰ３５ｇＤＮＡの検出限界で、投入ＤＮＡとファージ産生との間の直線相関を見出した（図１Ｃ）。Ｐ３５に加えて、このＬ型形質転換プロトコールは、７種の追加のリステリアファージの不均質な群からなる一群の再起動も可能にした（図１Ｄ）。７種の追加のリステリアファージには、ビルレント（Ｐ７０、Ｐ１００、及びＡ５１１）及びテンペレート（Ｂ０２５、Ｂ０３５、Ｂ０５６、ＰＳＡ）の生活様式を有するファージが含まれ、１３０ｋｂを超える大きなゲノムを有するファージ（Ｐ１００、Ａ５１１）もあれば、収縮性のある尾部（マイオウイルス；Ｐ１００、Ａ５１１）か収縮性のない尾部（サイフォウイルス；その他すべて）のどちらかを有する、形態的に多様なファージもある。ファージＢ０２５は、付着性の、オーバーラップするゲノム末端（ｃｏｓ）を有する一方、その他の再起動されたファージは、循環置換を伴う又は伴わない末端重複ゲノムを有する。

これらの結果は、再起動がビリオンの形態、ファージゲノムサイズ、及びゲノム複製戦略には依存しないことを強く示唆している。さらに、発明者らは、Ｒｅｖ２細胞には通常は感染しないと思われるリステリアファージを産生させることができ（Ｂ０２５、Ｂ０３５、Ｂ０５６、及びＰＳＡ、図５）、このことは、受容体結合及び／又はゲノム転座が、細胞壁のある細胞の感染中にこれらのファージの産生を制限する唯一の障害であることを示唆している。再起動させたリステリアファージの多様な特徴を図１Ｄ（小さい表）にまとめたが、これらの特徴は、Ｒｅｖ２Ｌにおける再起動がリステリアファージに広範囲に適用可能であることを示している。

発明者らは、ファージＰ３５、Ｐ７０、及びＡ５１１の再起動速度論を比較し（図１Ｅ）、３つすべてのファージの産生が、細胞壁のある細胞における感染速度論と比較して遅い、形質転換の２４時間後に、最大に達することを明らかにした。比較のために記すと、Ａ５１１は、細胞壁のある細胞に感染した場合、バースト時間は６０分である。この大きな時間の差は、おそらく、Ｌ型の代謝が遅いことによって説明される。Ｌ型が無傷の細胞壁を欠いているために、子孫ビリオンは、ファージホリンタンパク質の作用によって、又はＤＭ３培地が浸透圧的に安定化していない軟寒天に希釈されている場合は浸透圧の不安定化によって、Ｒｅｖ２Ｌ細胞が溶解することにより放出される。これによって、自身の細胞壁溶解酵素でリステリア血清型１細胞壁を通常は分解しないと思われるファージの放出もまた可能となる。放出されたファージは、隣接細胞に結合することができず、それらの生存時間は、ＤＭ３培地における安定性に依存する（図１Ｅ）。

リステリアに感染するファージの再起動に加えて、発明者らは、Ｒｅｖ２Ｌ細胞を使用して、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門の様々な属のグラム陽性生物に感染するファージを再起動させることができることを実証している。系統発生的に、バチルスはリステリアにきわめて近縁であり、発明者らは、バチルス・セレウスの小さな３７．４６ｋｂのサイフォウイルスＴＰ２１－Ｌ、及びバチルス・チューリンゲンシスの大きな１５３．９６ｋｂのマイオウイルス・バスティーユを、基質としてゲノムＤＮＡを使用して、Ｒｅｖ２Ｌで再起動させることができたことを明らかにした（図２Ａ）。

次に、発明者らは、リステリアＬ型が、ヒト病原体スタフィロコッカス・アウレウスに感染するファージに対する再起動プラットフォームとしても使用され得たことを明らかにした。発明者らは、４１．３２ｋｂのサイフォウイルスである２６３８Ａ、及び大きな１２７．４０ｋｂのマイオウイルスであるファージＫを再起動させることに成功したのである（図２Ｂ）。これまでの結果は、Ｒｅｖ２Ｌが、大きなウイルスゲノムの取込み、及び裸の線状ｇＤＮＡからのグラム陽性生物のファージの属交差再起動のための、汎用性の高い宿主であることを実証している。

次に、発明者らは、本発明のＬ型プラットフォームを利用して、合成ゲノムが、再起動のための基質としても使用することができるかどうかに対処した（ワークフローを図３Ａに示す）。まず、発明者らは、Ｐ３５ＤＮＡのオーバーラップするセグメントを増幅させ、精製し、ギブソン法を用いて合成ゲノムを連結させた。ほとんどのファージは、環状の複製中間体を使用しているため、断片間のオーバーラップが末端で連結（閉環）できるように設計した。それでも、コンカテマー又は末端に重複をもつ線状ＤＮＡの形成は排除することができない。Ｐ３５ゲノムを連結させるために、発明者らは約６ｋｂの６つの断片又は約１２ｋｂの３つの断片を使用し（図３Ｂ）、Ｐ３５が合成ＤＮＡから効率的に再起動されたことを明らかにした（図３Ｃ）。対照として、発明者らは、１つの断片を欠く不完全な連結物を使用した。Ｐ３５については、閉環がもはや必要ではないため、又は環状ＤＮＡが線状分子より効率的に形質転換されるため、合成ＤＮＡを使用することが、精製したｇＤＮＡと比較してより一層効率的であった（検出限界＝１．１ｐｇＤＮＡ、図６）。

Ｐ３５に加えて、発明者らは、この合成手法もまた使用して、テンペレートＬ．イノキュアファージＢ０２５のゲノムを連結させ、再起動させた（図３Ｄ～Ｅ）。Ｂ．セレウスファージＴＰ２１－Ｌのインビトロ連結及び属交差再起動（図３Ｆ～Ｇ）はＲｅｖ２Ｌにおいても成功し、宿主細胞を形質転換の６時間後に再起動反応物に追加すると、ファージの産生が増幅されたことがわかった（図３Ｇ）。リステリア又はスタフィロコッカスに感染するどのファージもＤＭ３培地中では感染できないため、この増幅戦略は、リステリア又はスタフィロコッカスに感染するファージについては成功しなかった。また、ＴＰ２１－Ｌを使用して、合成ファージが、設計した閉環の非存在下でも、産生されることも示した（図３Ｇ）。

Ｌ型における合成ゲノム連結と再起動とのユニークな組合せは、ファージゲノム操作のためのプラットフォームを提供する。この手法を探究するために、発明者らは、合成した改変ゲノムを使用して、溶原性から溶解性へのテンペレートリステリアファージの生活様式の切り換えを試みた。このために、発明者らは、テンペレートリステリアファージＢ０２５のゲノムを連結させたが、プロファージの組込みを制御し、媒介する遺伝子を省いた。Ｂ０２５において、これらの遺伝子は、２．７ｋｂの推定の溶原性制御領域（ＬＣＲ）にコードされており、溶菌サイクルのリプレッサー（Ｂ０２５Δｒｅｐ）か、ファージインテグラーゼを含むＬＣＲ全体（Ｂ０２５ΔＬＣＲ）のどちらかを削除した。ゲノム連結戦略を図４Ａに図示し、ファージ変異体の連結のための断片を図４Ｂに示す。組換えファージゲノムを連結させ、うまく再起動させ、得られたファージを、ＬＣＲ領域のＰＣＲ及び配列決定によって検証した（図４Ｃ）。プラーク形態における明らかな違いはないものの（図４Ｃ）、組換え体は、もはや遺伝子を組み込めず、合成「ビルレント」ファージとして複製することはできなかった（図４Ｄ）。すなわち、Ｂ０２５野生型連結物から再起動させたファージを使用した場合、プロファージの組込みによって、高い感染多重度での宿主の死滅が効果的に防止された（図４Ｄ；１０^５ｐｆｕ）。結果として、重複感染に対して耐性であったＢ０２５溶原菌（ＷＳＬＣ３００９：：Ｂ０２５）からなる、見たところでは非感染性である細菌叢が観察された。対照的に、同一の感染多重度での軟寒天重層アッセイにおいて、Ｂ０２５変異体は、増大した死滅を示し、ほぼすべての宿主細胞を溶解することができた。溶原性制御変異体での感染後、ごくわずかの生き残った菌だけが増殖した。再増殖した際、これらの生き残った菌は、Ｂ０２５に対して耐性ではなく、組込み部位が空のであり（図４Ｅ）、これは、ＬＣＲ変異体は実際に溶解性であり、宿主ゲノムへ組み込めなかったことを証明している。同様の手法は、２ｋｂのＬＣＲ全体又はリプレッサーのみを削除しているＢ．セレウスファージＴＰ２１－Ｌに対して、うまく適用した（図７）。ファージの生活様式をテンペレートからビルレントへ切り換えることは、生物医学的環境において又は病原体検出のために潜在的に使用され得る抗菌活性を増強させた溶菌ファージの在庫を増大するための、迅速で広範囲に適用可能な方法である。

本発明のゲノム操作プラットフォームは、組換えバクテリオファージの合理的設計、及び迅速なレポーター無しでの産生を可能にする。組換えをベースとした技術とは対照的に、組換えファージのための厄介なスクリーニングはもはや必要ではない。将来的には、この技術によって、抗菌特性を増強させたファージを仕立て、病原体検出用に高感度のレポーター遺伝子をファージゲノムへ組み込み、おそらく受容体結合タンパク質を切り換えることによって宿主範囲を改変することが可能になるであろう。主に、ファージタンパク質の変異、欠失、及び分子タグ付けのための効率的な遺伝学的ツールが乏しいことから、基本的なファージ生物学の多くの側面はまだほとんど理解されてない。これは、特にグラム陽性菌のビルレントファージに当てはまる。したがって、ここで示した手法は、これらのナノマシーンの生物学の理解を深めることに実質的に寄与し、これらのナノマシーンの生物的防除及び検出剤としての使用を越えた、新規のファージベースの生物工学的適用のための道を開くであろう。

材料及び方法
細菌株及び増殖条件
リステリア・モノサイトゲネスＷＳＬＣ１０４２及びＭａｃｋ、リステリア・イバノビイＷＳＬＣ３００９、バチルス・チューリンゲンシスＨＥＲ１２１１、並びにバチルス・セレウスＨＥＲ１３９９は、０．５×ＢＨＩ培地中で、３０℃で増殖させた。スタフィロコッカス・アウレウスＡＴＣＣ１９６８５及びスタフィロコッカス・アウレウス２６３８Ａは、０．５×ＢＨＩ培地中で、３７℃で増殖させた。新規のリステリア・モノサイトゲネスＬ型菌株Ｒｅｖ２Ｌは、我々はカザミノ酸の代わりにトリプトンを使用した、軽微の改変型であるＤＭ３培地（５ｇＬ^－１トリプトン、５ｇＬ^－１酵母エキス、０．０１％のＢＳＡ、５００ｍＭコハク酸、５ｇＬ^－１グルコース、２０ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４、１１ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３に調整）中で、３２℃で増殖させた。

バクテリオファージ増殖及びＤＮＡ抽出
ファージは、軟寒天重層法を使用して増殖させ、ＳＭバッファー（１００ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭのＭｇＳＯ_４、及び５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４）を用いてプレートから抽出した。ファージＰ３５は、下層及び上層寒天（ＬＣ／ＬＣ）としてＬＣ（１０ｍＭのＣａＣｌ_２を補充したＬＢ寒天）を使用して、Ｌ．モノサイトゲネスＭａｃｋ中で、室温で増殖させた。その他のファージはすべて、下層寒天として０．５×ＢＨＩを、上層寒天としてＬＣを使用して増殖させた。ファージＰＳＡは、Ｌ．モノサイトゲネスＷＳＬＣ１０４２中で、３０℃で増殖させ、その他のリステリアファージはすべて、Ｌ．イバノビイＷＳＬＣ３００９上で、３０℃で増殖させた。バチルスファージバスティーユ及びＴＰ２１－Ｌは、それぞれＨＥＲ１２１１及びＨＥＲ１３９９上で、３０℃で増殖させ、一方、スタフィロコッカス・アウレウスファージＫ及び２６３８Ａは、それぞれＡＴＣＣ１９６８５及びＳ２６３８Ａ上で、３７℃で増殖させた。ＤＮＡ抽出のために、ろ過滅菌したライセートを、デオキシリボヌクレアーゼＩ（１０μｇ ｍｌ^－１）及びリボヌクレアーゼＡ（１０ｍｌ中１Ｕ）で、３７℃で３０分間消化した。続いて、ファージをＰＥＧ沈殿（７％ＰＥＧ８０００及び１ＭのＮａＣｌ）によって濃縮し、プロテイナーゼＫで消化し（ｐＨ８のＳＭバッファー＋１０ｍＭのＥＤＴＡ中、２００ｕｇ／ｍｌ、５０℃、３０分）、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｖｉｒａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して精製した。大きなバクテリオファージゲノム（ΦＰ１００、ΦＡ５１１、Φバスティーユ、ΦＫ）からＤＮＡを精製するために、ＰＥＧ沈殿したファージを、段階的なＣｓＣｌ勾配超遠心分離法を使用して精製し、１０００倍過剰のＳＭバッファーに対して透析し、プロテイナーゼＫで消化し、既述のように有機溶媒を使用してＤＮＡを抽出した。

Ｒｅｖ２菌株及び可逆性Ｌ．イノキュアＬ型菌株の生成
簡潔に述べると、一晩インキュベートしたリステリアＥＧＤ－ｅ又はリステリア・イノキュア２０２１（ＳＬＣＣ５６３９）を、ペニシリン（２００μｇ・ｍｌ^－１）を補充したＤＭ３寒天上にプレーティングした。約２週間の培養後、出現したシングルコロニーを、ペニシリンＧ（ＰｅｎＧ）を含有するＤＭ３液体培地に移し、振盪せずにさらにインキュベートした。初めて液体培地中で細菌が増殖するまでに、約１週間かかった。Ｌ型をＤＭ３＋ＰｅｎＧ液体培地中で増殖させた後、Ｌ型を、ペニシリンＧを含まないＤＭ３液体培地中へ継代した。得られたＬ型は、ＤＭ３液体培地中では細胞壁のある形態に戻らなかったが、（ペニシリンＧの非存在下の）ＤＭ３寒天プレート上でのみ細胞壁のある形態に戻った。ＤＭ３液体培地中で２日間増殖させた後、このＬ型を、ペニシリンを含まないＤＭ３プレート上にプレーティングし、ここでは、復帰変異体コロニー（細胞壁のある細胞）が、通常、２～５日後に出現した。これらのコロニーを掻き取り、浸透圧保護剤が存在ないために、残存するＬ型細胞がすべて破裂すると思われるＢＨＩ液体培地中に接種した。この培養物から、凍結保存物を調製し、菌株がペニシリンＧを補充したＤＭ３培地中で増殖する能力について調べた。ＥＧＤ－ｅを用いて生成させた可逆性Ｌ型を、Ｒｅｖ２（細胞壁のある）又はＲｅｖ２Ｌ（Ｌ型）と呼ぶ。

Ｌ型形質転換及びゲノム再起動
Ｒｅｖ２細胞のＬ型状態への誘導は、３２℃で、ＤＭ３培地中で、２００μｇ・ｍｌ^－１のＰｅｎＧの存在下で実施し、Ｌ型細胞は、新鮮なＤＭ３培地中に、１：１０００の希釈で３～４日ごとに継代した。様々なＬ型継代物を、形質転換でそれらの感染性ファージ粒子を産生する能力についてアッセイした。我々は、ファージ産生が第５継代物で最大であったことを観察し、したがって、この継代物から調製した凍結保存物（－８０℃）を、すべての実験に使用した。少量（４～５ｕｌ）の凍結培養物を、１ｍｌの予熱したＤＭ３＋ＰｅｎＧへ接種し、低速のボルテックススミキサーを使用して懸濁し、３２℃で９６時間、撹拌せずにインキュベートした。得られたＬ型培養物を、ピペッティングによって懸濁し、ＤＭ３培地を用いてＯＤ_{６００ｎｍ}を０．１５に調整した。１００μｌのＯＤ調整済みＲｅｖ２Ｌ培養物を、５０ｍｌファルコンチューブ中で、１０～２０μｌのファージゲノムＤＮＡと混合した。無菌の４０％ＰＥＧ８０００溶液１５０ｕｌを添加し、ピペッティングによって徹底的に混合した。５分間のインキュベーション後、１０ｍｌの予熱したＤＭ３培地を添加し、血清ピペットを使用して懸濁し、特段の指示がない限り、形質転換反応物は、３２℃で２４時間、撹拌せずにインキュベートした。Ｌ型形質転換反応物を、ピペッティングによって再懸濁し、軟寒天重層法を使用して、成熟したファージ粒子をアッセイした。すなわち、５ｍｌの溶かしたＬＣ軟寒天を、５０～５００μｌの形質転換反応物及び２００μｌの好適なファージ増殖菌株（指示菌）の新鮮な静止期培養物と混合した。この軟寒天混合物を、固形寒天プレート上に注ぎ、ファージ増殖及び目に見えるプラークの形成が可能になるように、指示菌の至適増殖温度でインキュベートした。

合成ゲノムのインビトロ連結
バクテリオファージゲノムを、インシリコで、４０ｂｐのオーバーラップする末端を保有する、類似サイズの３～６つの断片へ分割した。循環置換を有するファージゲノムのために、断片を無作為に選択した。非置換のゲノムを有するファージ（ＴＰ２１－Ｌ及びＢ０２５）のためには、オーバーラップする長いプライマーを使用して、ゲノム断片の物理的末端での人為的環状化が可能になるように、ゲノム断片を設計した。ゲノム断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するＰＣＲによってファージｇＤＮＡから増幅させ、続いて、シリカカラムを用いて精製した。合成ゲノムは、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒハイファイＤＮＡアセンブリークローニングキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、５０℃で１時間、連結させた。連結反応物ごとに、反応物２０μｌ中、断片当たり１５０～２５０ｎｇの精製ＤＮＡを使用し、再起動には１５μｌを使用した。
さらなる実施形態は以下のとおりである。
［実施形態１］
操作されたバクテリオファージを産生する又は増殖させる方法であって、
標的細菌に感染することができる操作されたバクテリオファージの機能性合成ゲノムを用意するステップと、
レシピエント細菌を用意するステップと、
形質転換ステップで、前記レシピエント細菌を前記機能性合成ゲノムで形質転換し、形質転換されたレシピエント細菌を産するステップと、
第１のインキュベーションステップで、前記形質転換されたレシピエント細菌をインキュベートするステップであって、前記操作されたバクテリオファージが、前記形質転換されたレシピエント細菌内で増殖される、ステップと、
第２のインキュベーションステップで、前記形質転換されたレシピエント細菌、又は前記形質転換されたレシピエント細菌から放出された前記増殖させた操作されたバクテリオファージを、標的細菌と共にさらにインキュベートするステップであって、前記増殖させた操作されたバクテリオファージが、前記標的細菌に感染し、前記標的細菌内でさらに増殖される、ステップと
を含み、
前記レシピエント細菌が細胞壁欠損細菌である、方法。
［実施形態２］
前記レシピエント細菌が、グラム陽性菌の又はグラム陽性菌に由来した細胞壁欠損変種であり、特に、リステリア属の細菌、特に、リステリア・モノサイトゲネスの又はリステリア・モノサイトゲネスに由来した細胞壁欠損変種である、実施形態１に記載の方法。
［実施形態３］
前記標的細菌が、グラム陽性菌であり、特に、リステリア、バチルス、エンテロコッカス、ストレプトコッカス、クロストリジウム、又はスタフィロコッカスの属、より具体的には、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イバノビイ、リステリア・イノキュア、バチルス・スブチリス、バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシス、又はスタフィロコッカス・アウレウスから選択されるグラム陽性菌である、実施形態１又は２に記載の方法。
［実施形態４］
前記レシピエント細菌と前記標的細菌が、異なる属の異なる種又はメンバーに属する又は由来する、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態５］
前記機能性合成ゲノムが、それらの断片のインビトロ若しくはインビボ連結によって、又はデノボ合成によって用意される、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態６］
前記機能性合成ゲノムが、少なくとも１０，０００塩基対、特に、少なくとも３０，０００塩基対、より具体的には、少なくとも４０，０００塩基対の長さを有する、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態７］
前記形質転換ステップが、ポリエチレングリコール、特に、１，０００ｇ・ｍｏｌ ^－１ ～３０，０００ｇ・ｍｏｌ ^－１ の範囲の平均分子量のポリエチレングリコール、より具体的には、７，０００ｇ・ｍｏｌ ^－１ ～２０，０００ｇ・ｍｏｌ ^－１ の範囲の平均分子量のポリエチレングリコール、特に、ＰＥＧ８０００の存在下で実施される、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態８］
前記第１のインキュベーションステップが、４時間～９時間の範囲の期間にわたって実施され、特に、２４時間～３２時間の範囲の期間にわたって実施される、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態９］
前記レシピエント細菌が、細胞壁のある前駆細菌を、特にベータラクタム系抗生物質、グリコペプチド系抗生物質、サイクロセリン、又はホスホマイシンから選択される細胞壁合成を妨害する抗生物質の存在下で、任意選択で浸透圧保護培地の存在下でインキュベートして、前記レシピエント細菌を産することによって用意される、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態１０］
リステリア属の細胞壁欠損細菌を作製する方法であって、
遺伝子型［Δｌｍｏ０５８４ Δｌｍｏ１６５３－５４ Δｌｍ０１８６１］を特徴とする、若しくはｌｍｏ０５８４、ｌｍｏ１６５３－５４及びｌｍｏ０１８６１の機能性相同体を含まないゲノムを特徴とするリステリア属の細菌、特に、リステリア・モノサイトゲネス、より具体的には、リステリア・モノサイトゲネス菌株ＥＧＤ－ｅを用意するステップ、又は
リステリア・イノキュア種の細菌、特に、リステリア・イノキュアの菌株２０２１の細菌を用意するステップと、
前記細菌を、細胞壁合成を妨害する抗生物質の存在下で、任意選択で浸透圧保護培地の存在下で培養するステップと
を含む、方法。
［実施形態１１］
前記細胞壁合成を妨害する抗生物質が、ベータラクタム系抗生物質、グリコペプチド系抗生物質、サイクロセリン、又はホスホマイシンを含む群から選択され、特に、ペニシリンＧである、実施形態１０に記載の方法。
［実施形態１２］
遺伝子型［Δｌｍｏ０５８４ Δｌｍｏ１６５３－５４ Δｌｍ０１８６１］を特徴とする、又はｌｍｏ０５８４、ｌｍｏ１６５３－５４、及びｌｍｏ０１８６１の機能性相同体を含まないゲノムを特徴とする、リステリア属の細胞壁欠損細菌。
［実施形態１３］
前記細菌が、リステリア・モノサイトゲネス、特に、リステリア・モノサイトゲネス菌株ＥＧＤ－ｅである、細胞壁欠損細菌。
［実施形態１４］
実施形態１０又は１１に記載の方法によって得られうる、実施形態１２又は１３に記載の細胞壁欠損細菌。
［実施形態１５］
バクテリオファージを産生する又は増殖させる方法であって、
標的細菌に感染することができるバクテリオファージの機能性ゲノムを用意するステップと、
レシピエント細菌を用意するステップと、
形質転換ステップで、前記レシピエント細菌を前記機能性ゲノムで形質転換し、形質転換されたレシピエント細菌を産するステップと、
第１のインキュベーションステップで、前記形質転換されたレシピエント細菌をインキュベートするステップであって、前記バクテリオファージが、前記形質転換されたレシピエント細菌内で増殖される、ステップと、
第２のインキュベーションステップで、前記形質転換されたレシピエント細菌を、前記標的細菌と共にさらにインキュベートするステップであって、前記増殖させたバクテリオファージが前記標的細菌に感染し、前記標的細菌内でさらに増殖される、ステップと
を含み、
前記レシピエント細菌が細胞壁欠損細菌であり、前記レシピエント細菌と前記標的細菌が異なる属の異なる種又はメンバーに属する又は由来する、方法。

Claims (13)

1. 操作されたバクテリオファージを産生する又は増殖させる方法であって、
   標的細菌に感染することができる操作されたバクテリオファージの機能性合成ゲノムを用意するステップと、
   レシピエント細菌を用意するステップと、
   形質転換ステップで、前記レシピエント細菌を前記機能性合成ゲノムで形質転換し、形質転換されたレシピエント細菌を産するステップと、
   第１のインキュベーションステップで、前記形質転換されたレシピエント細菌をインキュベートするステップであって、前記操作されたバクテリオファージが、前記形質転換されたレシピエント細菌内で増殖される、ステップと、
   第２のインキュベーションステップで、前記形質転換されたレシピエント細菌、又は前記形質転換されたレシピエント細菌から放出された前記増殖させた操作されたバクテリオファージを、標的細菌と共にさらにインキュベートするステップであって、前記増殖させた操作されたバクテリオファージが、前記標的細菌に感染し、前記標的細菌内でさらに増殖される、ステップと
   を含み、
   前記レシピエント細菌が、リステリア属の細菌の又はリステリア属の細菌に由来した細胞壁欠損変種である、方法。
2. 前記リステリア属の細菌が、リステリア・モノサイトゲネスである、請求項１に記載の方法。
3. 前記標的細菌が、グラム陽性菌である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記標的細菌が、リステリア、バチルス、エンテロコッカス、ストレプトコッカス、クロストリジウム、又はスタフィロコッカスの属から選択される、請求項３に記載の方法。
5. 前記標的細菌が、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イバノビイ、リステリア・イノキュア、バチルス・スブチリス、バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシス、又はスタフィロコッカス・アウレウスである、請求項４に記載の方法。
6. 前記レシピエント細菌と前記標的細菌が、異なる属の異なる種又はメンバーに属する又は由来する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記機能性合成ゲノムが、それらの断片のインビトロ若しくはインビボ連結によって、又はデノボ合成によって用意される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記機能性合成ゲノムが、少なくとも１０，０００塩基対の長さを有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記形質転換ステップが、ポリエチレングリコールの存在下で実施される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記第１のインキュベーションステップが、４時間～９６時間の範囲の期間にわたって実施される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記レシピエント細菌が、細胞壁のある前駆細菌を、細胞壁合成を妨害する抗生物質の存在下でインキュベートして、前記レシピエント細菌を産することによって用意される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記インキュベートが浸透圧保護培地の存在下で行われる、請求項１１に記載の方法。
13. バクテリオファージを産生する又は増殖させる方法であって、
    標的細菌に感染することができるバクテリオファージの機能性ゲノムを用意するステップと、
    レシピエント細菌を用意するステップと、
    形質転換ステップで、前記レシピエント細菌を前記機能性ゲノムで形質転換し、形質転換されたレシピエント細菌を産するステップと、
    第１のインキュベーションステップで、前記形質転換されたレシピエント細菌をインキュベートするステップであって、前記バクテリオファージが、前記形質転換されたレシピエント細菌内で増殖される、ステップと、
    第２のインキュベーションステップで、前記形質転換されたレシピエント細菌を、前記標的細菌と共にさらにインキュベートするステップであって、前記増殖させたバクテリオファージが前記標的細菌に感染し、前記標的細菌内でさらに増殖される、ステップと
    を含み、
    前記レシピエント細菌が、リステリア属の細菌の又はリステリア属の細菌に由来した細胞壁欠損変種であり、前記レシピエント細菌が、前記標的細菌とは異なる属の種又はメンバーに属する又は由来する、方法。