CN110514732A - 基于快速蒸发电离质谱技术鉴别沙棘产地和/或品种的方法 - Google Patents

基于快速蒸发电离质谱技术鉴别沙棘产地和/或品种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于快速蒸发电离质谱技术鉴别沙棘产地和/或品种的方法。该方法主要包括：使用iKnife电刀切入沙棘样品内部，形成气溶胶，将气溶胶引入质谱仪由质量分析器检测，获得沙棘质谱原始数据；将质谱原始数据经Live ID软件进行峰匹配、滤噪、中心化、质量校准和归一化处理，得到沙棘样品的质谱指纹图谱数据；再将所有沙棘样品的质谱指纹图谱数据导入数据统计Live ID软件，采用主成分分析结合线性判别分析方法，构建不同品种和/或不同产地的沙棘统计模型，并用于快速鉴定待检样本的品种来源和/或产地来源。本发明检测速度快、灵敏度和分辨率高，为沙棘果实的产地和种类鉴定提供了新的检测手段。

Description

基于快速蒸发电离质谱技术鉴别沙棘产地和/或品种的方法
技术领域
本发明属于分析检测领域。更具体地，涉及一种基于快速蒸发电离质谱(REIMS)技术获取沙棘质谱指纹图谱及鉴别沙棘产地和/或品种的方法。
背景技术
沙棘是一种药食同源的植物，为多年生落叶灌木或小乔木，是一种喜光、耐水、耐旱、生长性极好的小浆果植物，其果实多为橘黄色或橘红色，果实近圆球形或椭圆形，直径约5-10mm。沙棘果中包含β-胡萝卜素、不饱和脂肪酸、氨基酸、黄酮类、维生素、微量元素等多种成分，能够降低人体内胆固醇，预防动脉粥样硬化。目前我国山西、陕西、内蒙古、河北、甘肃、宁夏、辽宁、青海、四川、云南、贵州、新疆、西藏等19个省和自治区都有分布和种植，全国沙棘面积达4000万亩，种植面积占全球近95％以上，生态效益非常突出。目前我国各地种植的沙棘在品种上有较大差别，如新疆和东北地区的沙棘主要是大果沙棘，这些沙棘是以俄罗斯和蒙古国品种为母本，中国沙棘为父本，通过人工杂交，在其子代群体中选育出的生态适应性好、果实产量较高的生态经济型杂交品系，山西、陕西、四川、云南、西藏等地的沙棘主要还是中国沙棘。
沙棘中含有丰富的维生素C、β-胡萝卜素、有机酸和黄酮类物质等对人体有益的成分。研究表明，不同品种和产地的沙棘在有效成分上具有较大差异，Yang等(Yang B R,Kallio H,三个沙棘亚种果实中的生物活性成分分析,国际沙棘研究与开发，2005,3(1):1-4)比较了来自中国、芬兰、俄罗斯的3个沙棘亚种中一系列亲水性与亲脂性的生物活性成分的含量与组成，发现不同沙棘亚种中维生素C、黄酮、棕榈油酸、生育酚、甾醇等特征成分均存在差异。杨岚等(杨岚，杨玲，李邦耀，李海明，杨宁宁，包慧，靳磊，宁夏不同产地沙棘黄酮类物质含量及抗氧化活性的研究，安徽农学通报，2018，24(14)：22-24,31)比较了宁夏不同产地沙棘黄酮类物质含量，结果表明，不同产地沙棘叶片中黄酮含量差异显著。张元元等(张元元，吕珊，陈梦杰，沙棘酚类特征成分含量测定及其特征图谱质量表征关联分析研究,北京中医药大学学报,2018,41(5):383-394)对11批次的沙棘药材中的酚类特征成分进行含量测定，发现不同产地的沙棘中有效成分存在较大差异。Ma等(Ma XY,O Laaksonen,Zheng J,Yang W,Trépanier M,Kallio H,Yang BR,Flavonol glycosides in berries oftwo major subspecies of sea buckthorn(rhamnoides L.)and influenceof growth sites.Food Chemistry,2016,200:189-198)对中国四川、芬兰、加拿大等地的沙棘进行了鉴定和量化，发现沙棘中黄酮以异鼠李素和槲皮素为主要配基，共发现26种黄酮醇苷类化合物。Pop等(Pop R M,Socaciu C,Pintea A,Buzoianu A D,Sanders M G,Gruppen H,Vincken J-P,UHPLC/PDA–ESI/MS Analysis of the Main Berry and LeafFlavonol Glycosides from Different CarpathianrhamnoidesL.Varieties.Phytochem.Anal.2013,24:484-492)对6种沙棘中的黄酮成分进行定量和主成分分析，认为黄酮醇衍生物是区别不同品种的生物标志物，特别是识别浆果和叶子的成分。上述分析技术大多需要对沙棘中的主要成分进行提取、分离、鉴定，再进行定量比较，样品前处理步骤比较复杂，分析过程较长。
近年来，原位电离技术逐渐成为质谱研究领域的热点。快速蒸发电离质谱技术(REIMS)是一种无须制备或液相色谱分离的新型原位电离质谱技术，其原理是利用带电的智能刀(iKinfe)切割组织样品，使组织样品产生气溶胶，将产生的气溶胶导入质谱离子源并离子化，从而进入质谱进行分析。该技术最初被应用于医学领域，用来快速分析被解剖的组织样本，作为癌症的诊断技术，近年来，也被用于食品分析领域，分析的样本主要是动物组织样本，如猪肉、鱼肉、牛肉的产地来源。该方法的优点一是不再需要繁杂的样品制备和耗时的色谱分离，分析速度非常快，一次数据采集过程仅需要3-5s时间，大大缩短样品分析周期，二是与以往的原位分析技术比较，该技术通过iKinfe切入样品内部，使样品内部和表皮的化合物同时被加热形成气溶胶，可同时获取样品内部及表皮的质谱信息，所获取的质谱信息更为全面。由于水果样本水分含量较大，不易产生气溶胶，因此，还未见将该技术应用于水果样本的分析报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于快速蒸发电离质谱(REIMS)技术获取沙棘质谱指纹图谱及鉴别沙棘产地和/或品种的方法。该方法采用智能刀切入沙棘样品内部，形成气溶胶，利用快速蒸发电离的方式，使气溶胶中的待分析物离子化，并进入质谱系统进行检测，进一步通过飞行时间质谱在高分辨率的条件下采集质谱数据，获得果实的质谱指纹图谱，通过对质谱指纹图谱进行统计分析，达到分辨沙棘果实产地和品种的目的。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种基于快速蒸发电离质谱技术鉴别沙棘产地和/或品种的方法，该方法包括如下步骤：
(1)将沙棘鲜果样品放置于可导电的锡箔纸上，使用iKnife电刀切入沙棘样品内部，形成气溶胶，所述气溶胶由Venturi泵氮气驱动，经PTFE管引入质谱端口后采用正交方式与辅助溶剂混合形成喷雾，喷雾中的小微粒与1.1Ω、3V、500℃的KanthalA1灯丝碰撞，使小微粒中的分子离子化，待测离子进入质谱仪由质量分析器检测；质谱仪扫描时间为1秒，扫描范围为m/z50-1200；以负电离模式收集数据，获得沙棘质谱原始数据；
(2)根据步骤(1)对不同产地和/或品种的沙棘果实进行分析，每一种样品重复分析十次，获得每次分析的质谱原始数据；
(3)将所有样品的质谱原始数据经Live ID软件进行峰匹配、滤噪、中心化、质量校准和归一化处理，得到相对含量为5％以上的离子峰的质荷比和峰面积信息，获得所有沙棘样品的质谱指纹图谱数据；
(4)将所有沙棘样品的质谱指纹图谱数据导入数据统计Live ID软件，采用主成分分析(Principal component analysis,PCA)结合线性判别分析(Linear discriminateanalysis,LDA)方法，按照样品的品种属性和产地属性不同，对已知样本的品种和/或产地进行定义，构建不同品种和/或不同产地的沙棘统计模型；
(5)利用不同品种和/或不同产地的沙棘统计模型，将待检样本的质谱指纹图谱数据与沙棘统计模型进行比对，快速鉴定待检样本的品种来源和/或产地来源。
可选的，上述方法中，步骤(1)中，所述iKnife电刀的工作电压为30-60V，所述iKnife电刀切割沙棘表面的切割长度为0.3-0.5cm，切割深度为1-3mm，持续时间为3-5秒，每次切割的总离子流强度应不低于1×10-7counts。
在本发明的一个具体实施方式中，选取切割顺畅，且切口不产生焦糊现象的55V作为最优切割电压。每次切割的总离子流强度应不低于1×10-7，以保证数据质量充足，结果稳定。
可选的，步骤(1)中，辅助溶剂经针泵注射进样器引入端口，所述辅助溶剂为含有亮氨酸脑啡肽的异丙醇溶液，其中，亮氨酸脑啡肽的浓度为1ng/μL，辅助溶剂的流速为0.1mL/min。
可选的，步骤(1)中，所述质谱仪为飞行时间质谱。
可选的，步骤(3)中，所述获取沙棘中指纹图谱的分析方法为：通过Live ID软件对沙棘质谱图中m/z 50-1200区域内的质谱图进行峰匹配、滤噪、中心化、质量校准和归一化处理，得到相对含量为5％以上的离子峰的质荷比和峰面积信息，设置精确质量误差<5ppm，同位素丰度误差<10％。
可选的，步骤(2)中，所述沙棘品种为大果沙棘深秋红和小果沙棘。
可选的，步骤(2)中，所述沙棘产地为新疆、黑龙江、吉林、辽宁、山西和四川中的两个或多个。
本发明的有益效果如下：
与现有技术比较，本发明首次提出采用快速蒸发电离质谱(REIMS)技术进行水果产地和品种鉴定，建立了一种快速和有效鉴别沙棘果实产地和种类的新方法，解决了目前沙棘产地和种类鉴别难的问题，对进一步推动沙棘原产地保护、促进沙棘产业健康发展提供了解决手段，同时为沙棘果实质量等级划分提供了思路。
本发明采用iKnife电刀切割沙棘表皮并进入内部组织直接取样，形成气溶胶，并将离子化的待分析物由管路传输至质量分析器进行实时检测。质谱仪仅扫描1秒即可得到质谱轮廓图，通过统计分析，可对不同产地和品种的沙棘进行定义。本发明检测速度快、灵敏度和分辨率高、结果稳定，可满足快速、高通量、实时检测的需求。
附图说明
图1示出实验流程图。
图2示出大果沙棘与小果沙棘品种统计分析模型。
图3示出大果沙棘产地统计分析模型。
图4示出小果沙棘产地统计分析模型。
图5示出沙棘原浆与品种统计分析模型对比结果。
图6示出沙棘原浆与大果沙棘产地统计分析模型对比结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
1.1试剂与仪器
Xevo G2-XS四极杆飞行时间质谱仪，配有iKnife手持采样装置(美国Waters公司)；Pump11 elite针泵注射进样器(美国Harvard公司)；SGE 10mL注射器(澳大利亚TRAJAN)，Milli Q超纯水处理系统(美国Millipore公司)；Masslynx 4.1数据采集软件、Live ID统计分析软件(美国Waters公司)。甲醇、乙腈、异丙醇(色谱纯，美国Merck公司)；亮氨酸脑啡肽(Sigma公司)，实验用水为经Millipore超纯水仪制备的超纯水；大果沙棘深秋红12份，小果沙棘4份，分别来自新疆、黑龙江、吉林、辽宁四个产地，均为沙棘鲜果。
1.2质谱条件
使用iKnife电刀切入沙棘样品内部，切割长度为0.3-0.5cm，切割深度为1-3mm，持续时间为3-5秒，生成含有大量复杂离子混合物的气溶胶，该气溶胶由Venturi泵氮气驱动，经PTFE管引入质谱端口后采用正交方式与辅助溶剂(含亮氨酸脑啡肽的异丙醇溶液，氨酸脑啡肽1ng/μL)混合形成喷雾，喷雾中的小微粒与KanthalA1灯丝(1.1Ω，3V，500℃)碰撞，使小微粒中的分子离子化，随后待测离子进入质谱仪(TOF mass Spectrometry)由质量分析器检测分析，实验装置如图1；iKnife电刀工作电压为55V；含亮氨酸脑啡肽的异丙醇溶液流速为0.1mL/min；质谱仪扫描时间为1秒；扫描范围：m/z 50-1200；电离模式：负电离模式。
1.3数据分析
对不同产地和品种的沙棘果实进行分析，每一种样品重复分析10次。将质谱原始数据导入Live ID软件，通过Live ID软件对沙棘质谱图中m/z 50-1200区域内的质谱图进行峰匹配、滤噪、中心化、质量校准和归一化处理，筛选得到相对含量为5％以上的离子峰的质荷比和峰面积信息，设置精确质量误差<5ppm，同位素丰度误差<10％，获得沙棘质谱指纹图谱数据。将质谱指纹图谱数据导入数据统计Live ID软件进行分析。采用主成分分析(Principal component analysis,PCA)结合线性判别分析(Linear discriminateanalysis,LDA)方法构建化学计量学模型，从而对不同产地和品种的沙棘果实进行分类。
2.结果与讨论
(1)利用REIMS技术建立不同品种沙棘统计分析模型
对12份大果沙棘深秋红和4份小果沙棘进行检测，每一种样品重复分析十次。获取沙棘果实的指纹图谱信息，将指纹图谱信息导入Live ID软件，选取信噪比大于10的信号峰，采用主成分分析(Principal component analysis，PCA)结合线性判别分析(Lineardiscriminate analysis，LDA)对样品进行模型构建，统计分析模型见附图2，从图中可见，大果沙棘和小果沙棘可明显区分，所得统计分析模型R2＝0.8402,Q2＝0.7075。
(2)利用REIMS技术建立大果沙棘的产地统计分析模型
对来自新疆、黑龙江、吉林、辽宁四个产地的12份大果沙棘深秋红的质谱信息导入Live ID软件，选取信噪比大于10的信号峰，采用主成分分析(Principal componentanalysis，PCA)结合线性判别分析(Linear discriminate analysis，LDA)对样品进行模型构建，统计分析模型见附图3，从图中可见，新疆、黑龙江、辽宁、吉林四个产地的大果沙棘可得到明显区分，所得统计分析模型R2＝0.7941，Q2＝0.6599。
(3)利用REIMS技术建立小果沙棘的产地统计分析模型
对来自四川、山西、吉林、辽宁四个产地的4份小果沙棘的质谱信息导入Live ID软件，选取信噪比大于10的信号峰，采用主成分分析(Principal component analysis，PCA)结合线性判别分析(Linear discriminate analysis，LDA)对样品进行模型构建，统计分析模型见附图4。从图中可见，四川、山西、辽宁、吉林四个产地的小果沙棘可得到明显区分，所得统计分析模型R2＝0.7851，Q2＝0.5786。
(4)利用不同品种沙棘统计分析模型鉴别沙棘原浆的品种来源
对沙棘原浆进行检测，获取沙棘原浆的指纹图谱数据，并导入不同品种沙棘统计分析模型进行比对，结果见图5，从图中可见，大果沙棘和小果沙棘可明显分为两大区域，沙棘原浆数据点落于大果沙棘的区域，说明该沙棘原浆的原料来自于大果沙棘。实际进行数据分析时，图为彩色，通过颜色能很快鉴定出待检样本类型。
(5)利用大果沙棘产地模型鉴别沙棘原浆的产地来源
对沙棘原浆进行检测，获取沙棘原浆的指纹图谱数据，并导入大果沙棘的产地模型(如(2)中获得的模型)进行比对，结果见图6，从图中可见，沙棘原浆数据点落于新疆的区域，说明该沙棘原浆的原料来自于新疆。实际进行数据分析时，图为彩色，通过颜色能很快鉴定出待检样本类型。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一种基于快速蒸发电离质谱技术鉴别沙棘产地和/或品种的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将沙棘鲜果样品放置于可导电的锡箔纸上，使用iKnife电刀切入沙棘样品内部，形成气溶胶，所述气溶胶由Venturi泵氮气驱动，经PTFE管引入质谱端口后采用正交方式与辅助溶剂混合形成喷雾，喷雾中的小微粒与1.1Ω、3V、500℃的KanthalA1灯丝碰撞，使小微粒中的分子离子化，待测离子进入质谱仪由质量分析器检测；质谱仪扫描时间为1秒，扫描范围为m/z50-1200；以负电离模式收集数据，获得沙棘质谱原始数据；
(2)根据步骤(1)对不同产地和/或品种的沙棘果实进行分析，每一种样品重复分析十次，获得每次分析的质谱原始数据；
(3)将所有样品的质谱原始数据经Live ID软件进行峰匹配、滤噪、中心化、质量校准和归一化处理，得到相对含量为5％以上的离子峰的质荷比和峰面积信息，获得所有沙棘样品的质谱指纹图谱数据；
(4)将所有沙棘样品的质谱指纹图谱数据导入数据统计LiveID软件，采用主成分分析结合线性判别分析方法，按照样品的品种属性和产地属性不同，对已知样本的品种和/或产地进行定义，构建不同品种和/或不同产地的沙棘统计模型；
(5)利用不同品种和/或不同产地的沙棘统计模型，将待检样本的质谱指纹图谱数据与沙棘统计模型进行比对，快速鉴定待检样本的品种来源和/或产地来源。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述iKnife电刀的工作电压为30-60V，所述iKnife电刀切割沙棘表面的切割长度为0.3-0.5cm，切割深度为1-3mm，持续时间为3-5秒，每次切割的总离子流强度应不低于1×10-7counts。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，辅助溶剂经针泵注射进样器引入端口，所述辅助溶剂为含有亮氨酸脑啡肽的异丙醇溶液，其中，亮氨酸脑啡肽的浓度为1ng/μL，辅助溶剂的流速为0.1mL/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述质谱仪为飞行时间质谱。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述获取沙棘中指纹图谱的分析方法为：通过Live ID软件对沙棘质谱图中m/z 50-1200区域内的质谱图进行峰匹配、滤噪、中心化、质量校准和归一化处理，得到相对含量为5％以上的离子峰的质荷比和峰面积信息，设置精确质量误差<5ppm，同位素丰度误差<10％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述沙棘品种为大果沙棘深秋红和小果沙棘。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述沙棘产地为新疆、黑龙江、吉林、辽宁、山西和四川中的两个或多个。
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