CN110498864B - 香柏多糖及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属中药技术领域，涉及香柏中五个均一多糖及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途。本发明从清热解毒中药香柏中分离得到五个均一多糖XB‑PS2、XB‑PS3、XB‑PS4、XB‑PS5和XB‑PS6，经实验证实该些香柏均一多糖对补体激活有显著的抑制作用，可进一步作为活性成分制备新型抗补体药物。

Description

香柏多糖及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途
技术领域
本发明属中药领域，涉及多糖及其制备方法和在制药中的用途，具体涉及香柏中五个天然均一多糖及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途。
背景技术
现有技术公开了补体系统是是人体免疫系统的重要组成部分，其正常激活在消灭外来微生物、清除机体内损伤或死亡的细胞和组织、维持机体的平衡中起着重要的作用。然而该系统的过度激活会引起人体免疫系统的过度反应，造成人体自身正常组织的损伤，如类风湿性关节炎、老年性痴呆、系统性红斑狼疮(SLE)以及器官移植后的排斥反应等。在多器官功能衰竭综合症，如缺血性再灌注、急性心肌梗死、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)等急性疾病中，补体的过度激活也起了重要作用。
目前临床上广泛使用的糖皮质激素、环磷酰胺、甲胺蝶吟等免疫抑制剂虽然对某些与补体过度激活相关的疾病有一定治疗作用，但由于该类药物并非专一的补体抑制剂，长期应用会降低机体的防御机能，导致抗感染能力下降，易继发感染和使潜在病灶扩散，产生多种并发症和副作用。因此临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。
自然界中广泛存在抗补体作用的活性成分，我国中药资源丰富,有许多中药对免疫系统有明显的调节作用,是寻找抗补体类药物前体的宝贵资源。在抗击SARS期间,中医、中药对SARS的防治取得显著效果香柏(Sabina pingii var.wilsonii)，为青藏高原地区柏科圆柏属植物的常用药物。圆柏，又称秀巴、徐巴、加秀、秀曰等，收载于《晶珠本草》味苦，能清热、祛湿、解毒，可用于治疗肺炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、胆囊炎、肾炎、炭疽病、痈疖肿毒、黄水病等，常与其他藏药配伍使用，如五味甘露汤、十味诃子丸、十四味羚牛角丸、二十八味槟榔丸等，尤其是五味甘露汤作为藏医药特色的药浴，对青藏高原多发的关节炎有很好的疗效。
基于现有技术的基础及尚未见对香柏中抗补体活性均一多糖分离制备的报道，本申请的发明人试图加强对相关中药的抗补体活性成分的研究,为补体相关的疾病的治疗提供物质基础，具体提供香柏多糖及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的基础，提供天然药物中具有抗补体作用的活性成分，具体涉及香柏多糖及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途，尤其是五个香柏均一多糖(XB-PS2、XB-PS3、XB-PS4、XB-PS5和XB-PS6)及其制备方法和在制备补体抑制药物中的用途。
本发明对常用清热解毒中药香柏枝叶的水提取物进行分离得到五个均一多糖，经体外实验证实五个多糖具有显著的补体抑制活性，可作为抗补体药物进行开发。
本发明中，所述的中药香柏是圆柏属植物香柏Sabina pingii var.wilsonii的枝叶
本发明所述的香柏多糖XB-PS2、XB-PS3、XB-PS4、XB-PS5和XB-PS6的结构特征描述如下：
(1)XB-PS2是由两种单糖组成的多糖，分子量约为24.6KDa；总糖含量为97.70％；蛋白含量为3.31％；糖醛酸含量为47.77％；不含硫酸基，单糖摩尔比为葡萄糖:半乳糖醛酸＝0.574:0.426。甲基化结果显示结构中含1,4,6-连接和末端连接葡萄糖，1,4-连接半乳糖醛酸，摩尔比为0.32:0.25:0.43。
(2)XB-PS3是由三种单糖组成的多糖，分子量约为86.04KDa；总糖含量为96.75％；蛋白含量为0.23％；糖醛酸含量为25.68％；不含硫酸基，单糖摩尔比为阿拉伯糖:半乳糖醛酸:甘露糖＝0.58:0.33:0.09，甲基化结果显示结构中含：1,3-连接阿拉伯糖，1,3,5-连接阿拉伯糖、末端连接阿拉伯糖、1,4-连接的半乳糖醛酸、1,2,4-连接甘露糖，摩尔比为0.38:0.09:0.15:0.30:0.08。
(3)XB-PS4是由三种单糖组成的多糖，分子量约为84.42KDa；总糖含量为96.12％；蛋白含量为2.15％；糖醛酸含量为25.8％；不含硫酸基，单糖摩尔比为阿拉伯糖:半乳糖醛酸:甘露糖＝0.48:0.35:0.17，甲基化结果显示结构中含：1,3-连接阿拉伯糖，1,3,5-连接阿拉伯糖、末端连接阿拉伯糖、1,4-连接的半乳糖醛酸、1,2,4-连接甘露糖、末端连接甘露糖，摩尔比为0.31:0.10:0.09:0.31:0.08:0.11。
(4)XB-PS5是由三种单糖组成的多糖，分子量约为67.77KDa；总糖含量为96.32％；蛋白含量为2.12％；糖醛酸含量为35.67％；不含硫酸基，单糖摩尔比为阿拉伯糖:半乳糖醛酸:甘露糖＝0.25:0.26:0.49，甲基化结果显示结构中含：1,3,5-连接阿拉伯糖、1,4-连接的半乳糖醛酸、1,4-连接甘露糖和末端连接的甘露糖，摩尔比为0.16:0.39:0.33:0.10。
(5)XB-PS6是由三种单糖组成的多糖，分子量约为18.84KDa；总糖含量为97.14％；蛋白含量为2.28％；糖醛酸含量为15.8％；不含硫酸基，单糖摩尔比为阿拉伯糖:半乳糖醛酸:半乳糖＝0.58:0.26:0.14。甲基化结果显示结构中含：端基连接阿拉伯糖、1,3-连接阿拉伯糖、1,3,5-连接阿拉伯糖、1,4-连接半乳糖醛酸、1,3-连接半乳糖，摩尔比为0.145:0.368:0134:0.237:0.116。
本发明所述的香柏多糖(XB-PS2、XB-PS3、XB-PS4、XB-PS5和XB-PS6)通过下述方法制备：
香柏以95％乙醇提取，滤过，残渣烘干后，用热水提取，提取液经滤过，浓缩，加入4倍体积的95％乙醇，静置，离心去上清，沉淀以水复溶，再以三氯醋酸去除蛋白，离心，上清液调至中性，浓缩，透析，冷冻干燥得粗多糖。粗多糖加蒸馏水溶解，用DEAE-cellulose柱色谱初步分离。以蒸馏水、0.1、0.4、0.8、1.6和2.0mol/L的NaCl溶液洗脱，收集各流份，浓缩，透析及冻干得6个次级组分：WATER-EP-XB、0.1M-EP-XB、0.4M-EP-XB、0.8M-EP-XB、1.6M-EP-XB及2.0M-EP-XB；
各个次级组分加入适量流动相溶解，离心，上清液用Sephacryl TM S300凝胶色谱(截留分子量2KDa-400KDa)进行分离，收集各流份。隔管检测490nm(硫酸-苯酚法显色后)下的吸光度值，合并流份，浓缩及冷冻干燥得到均一多糖；
经体外试验证实，香柏多糖XB-PS2、XB-PS3、XB-PS4、XB-PS5和XB-PS6对补体经典和旁路途径激活所引发的细胞溶血均有明显的抑制，即有明显的抗补体作用；
XB-PS2、XB-PS3、XB-PS4、XB-PS5和XB-PS6的CH50值(经典途径50％抑制溶血所需供试品的浓度)分别为134±43μg/mL、117±18μg/mL、197±34μg/mL、92±25μg/mL和73±9μg/mL；XB-PS5和XB-PS6的AP50值(旁路途径50％抑制溶血所需供试品的浓度)分别为39±1.8μg/mL、742±47μg/mL，XB-PS2、XB-PS3、XB-PS4无抗补体系统旁路途径活性。
本发明提供了香柏中五个均一多糖及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途，本发明的五个均一多糖为XB-PS2、XB-PS3、XB-PS4、XB-PS5和XB-PS6，经实验证实该些香柏均一多糖对补体激活有显著的抑制作用，可进一步作为活性成分制备新型抗补体药物。
附图说明
图1是XB-PS2(A)、XB-PS3(B)的HPGPC色谱图，
其中显示了，TSK-GEL GMPWXL凝胶柱(300×7.6mm)；洗脱液：0.1mol/L NaCl；流速：0.8ml/min。
图2是XB-PS4(A)、XB-PS5(B)和XB-PS6(C)的HPGPC色谱图，
其中显示了，TSK-GEL GMPWXL凝胶柱(300×7.6mm)；洗脱液：0.1mol/L M NaCl；流速：0.8ml/min。
具体实施方式
实施例1制备香柏多糖XB-PS2、XB-PS3、XB-PS4、XB-PS5和XB-PS6
香柏药材3Kg粉碎，以95％乙醇提取，滤过，药渣用水溶液提取3次，浓缩，离心，上清液加入4倍体积的95％乙醇，静置，离心去上清，沉淀以水复溶，减压回收，除去乙醇；复溶液再以三氯醋酸去除游离蛋白，离心，上清液调至中性，透析，浓缩，冷冻干燥即得粗多糖，粗多糖100g加蒸馏水溶解，离心，上清液用DEAE-cellulose柱色谱进行初步分离，以蒸馏水、0.1、0.4、0.8、1.6和2.0mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱体积大于2倍柱体积(约3L)，流速为10mL/min，收集各流份，隔管检测490nm(硫酸-苯酚法显色后)下的吸光度值。根据糖显色反应并结合紫外检测的结果，合并流分，浓缩，透析及冷冻干燥得6个次级组分：WATER-EP-XB、0.1M-EP-XB、0.4M-EP-XB、0.8M-EP-XB、1.6M-EP-XB及2.0M-EP-XB；
将2.0M-EP-XB(1.5g)加蒸馏水溶解，离心，上清液分次用Sephacryl TM S300色谱(截留分子量2KDa-400KDa)分离。0.1mol/L NaCl溶液洗脱，流速为0.8mL/min，收集各流分。隔管检测490nm(硫酸-苯酚法显色后)下的吸光度值，根据检测结果合并相同流分，浓缩、透析及冷冻干燥得均一多糖XB-PS2(70mg)；
将0.1M-EP-XB(6.8g)加蒸馏水溶解，离心，上清液分次用Sephacryl TM S300色谱分离。0.1mol/L NaCl溶液洗脱，流速为0.8mL/min，收集各流分。隔管检测490nm(硫酸-苯酚法显色后)下的吸光度值，根据检测结果合并相同流分，浓缩、透析及冷冻干燥得均一多糖XB-PS3(4500mg)；
将0.4M-EP-XB(4.7g)加蒸馏水溶解，离心，上清液分次用Sephacryl TM S300色谱分离。0.1mol/L NaCl溶液洗脱，流速为0.8mL/min，收集各流分，。隔管检测490nm(硫酸-苯酚法显色后)下的吸光度值，根据检测结果合并相同流分，浓缩、透析及冷冻干燥得均一多糖XB-PS4(200mg)；
将0.8M-EP-XB(2.1g)加蒸馏水溶解，离心，上清液分次用Sephacryl TM S300色谱分离。0.1mol/L NaCl溶液洗脱，流速为0.8mL/min，收集各流分，隔管检测490nm(硫酸-苯酚法显色后)下的吸光度值，根据检测结果合并相同流分，浓缩、透析及冷冻干燥得均一多糖XB-PS5(20mg)；
将1.6M-EP-XB(1.5g)加蒸馏水溶解，离心，上清液分次用Sephacryl TM S300色谱分离。0.1mol/L NaCl溶液洗脱，流速为0.8mL/min，收集各流分，隔管检测490nm(硫酸-苯酚法显色后)下的吸光度值，根据检测结果合并相同流分，浓缩、透析及冷冻干燥得均一多糖XB-PS6(60mg)；
经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)检测XB-PS2、XB-PS3、XB-PS4、XB-PS5和XB-PS6均为均一成分。
实施例2香柏多糖(XB-PS2、XB-PS3、XB-PS4、XB-PS5和XB-PS6)的结构表征
(1)分子量的测定
采用18角度激光光散射凝胶色谱系统对分子量进行检测，基本原理是均一多糖通过凝胶渗透色谱，形成对称的色谱峰，经18角度激光照射后形成光散射，光散射信号直接与分子量大小相关。数据用Astar(version 5.3.1)软件进行计算直接给出分子量；
实验方法：准确称取均一多糖5.0mg，配置成10mg/ml的溶液，进样前过0.45微米的微孔滤膜。色谱条件：流速0.5mg/ml，进样量20μl，0.1％的NaCl溶液为流动相，柱温25℃，激光波长设置为685nm，折光率参数(dn/dc)确定为0.138cm3/g；
(2)总糖、糖醛酸、蛋白及硫酸基含量测定
硫酸-苯酚法测定XB-PS2总糖含量为97.70％；XB-PS3总糖含量为96.75％；XB-PS4总糖含量为96.12％；XB-PS5总糖含量为96.32％和XB-PS6总糖含量为97.14％；
间羟联苯法测定检测糖醛酸含量，XB-PS2的糖醛酸含量为47.77％；XB-PS3的糖醛酸含量为25.68％；XB-PS4的糖醛酸含量为25.8％；XB-PS5的糖醛酸含量为35.67％；XB-PS6的糖醛酸含量为15.8％；
考马斯亮蓝法测定蛋白含量：XB-PS2的蛋白含量为3.31％；XB-PS3的蛋白含量为0.23％；XB-PS4的蛋白含量为2.15％；XB-PS5的蛋白含量为2.12％；XB-PS6的蛋白含量为2.28％；
BaCl2比浊法测定XB-PS2、XB-PS3、XB-PS4、XB-PS5和XB-PS6均不含硫酸基。
(3)糖组成分析
XB-PS2、XB-PS3、XB-PS4、XB-PS5和XB-PS6分别经2mol/L TFA于110℃全水解得到的产物，先后进行PMP衍生化后，进行液相分析；
XB-PS2是由两种单糖组成的多糖，葡萄糖:半乳糖醛酸＝0.574:0.426；
XB-PS3是由三种单糖组成的多糖，单糖摩尔比为阿拉伯糖:半乳糖醛酸:甘露糖＝0.58:0.33:0.09；
XB-PS4是由三种单糖组成的多糖，单糖摩尔比为阿拉伯糖:半乳糖醛酸:甘露糖＝0.48:0.35:0.17；
XB-PS5是由三种单糖组成的多糖，单糖摩尔比为阿拉伯糖:半乳糖醛酸:甘露糖＝0.25:0.26:0.49；
XB-PS6是由三种单糖组成的多糖，单糖摩尔比为阿拉伯糖:半乳糖醛酸:半乳糖＝0.58:0.26:0.14；
(4)甲基化分析
参照文献方法(Needs PW,Selvendran RR.Avoiding oxidative degradationduring sodium hydroxyl/dimethyl-iodide mediated carbohydrate methylation indimethyl sulfoxide.Carbohydr Res.1993,245:1-10)分别对多糖进行甲基化，甲基化后的产物用90％甲酸解聚，2mol/L TFA全水解，NaBH4还原和醋酐乙酰化制成部分甲基化的阿尔迪醇乙酸酯衍生物，然后进行GC-MS分析；
XB-PS2结构中含1,4,6-连接和末端连接葡萄糖，1,4-连接半乳糖醛酸，摩尔比为0.32:0.25:0.43；
XB-PS3结构中含：1,3-连接阿拉伯糖，1,3,5-连接阿拉伯糖、末端连接阿拉伯糖、1,4-连接的半乳糖醛酸、1,2,4-连接甘露糖，摩尔比为0.38:0.09:0.15:0.30:0.08；
XB-PS4甲基化结果显示结构中含：1,3-连接阿拉伯糖，1,3,5-连接阿拉伯糖、末端连接阿拉伯糖、1,4-连接的半乳糖醛酸、1,2,4-连接甘露糖，摩尔比为0.31:0.10:0.09:0.31:0.08:0.11；
XB-PS5甲基化结果显示结构中含：1,3,5-连接阿拉伯糖、1,4-连接的半乳糖醛酸、1,4-连接甘露糖和末端连接的甘露糖，摩尔比为0.16:0.39:0.33:0.10；
XB-PS6甲基化结果显示结构中含：端基连接阿拉伯糖、1,3-连接阿拉伯糖、1,3,5-连接阿拉伯糖、1,4-连接的半乳糖醛酸、1,3-连接半乳糖，摩尔比为0.145:0.368:0134:0.237:116。
实施例3经典途径补体抑制试验
取3个月龄豚鼠的血清，以VBS2+缓冲液(巴比妥缓冲液，pH＝7.4，含0.5mM Mg2+和0.15mM Ca2+)稀释为1:100，作为本次经典途径的补体来源。将兔抗羊红细胞的抗体以VBS2+缓冲液稀释为1:1000作为溶血素；保存于Alsever液中的羊红细胞(SRBC)配置成2％SRBC。精密称量多糖3mg，加入VBS2+缓冲液溶解，对倍稀释成8个浓度。不同浓度的多糖溶液200μL与已经稀释到1:100的补体200μL在37℃预孵育10min后，依次加入100μL溶血素(1:1000)和100μL 2％SRBC，在37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min。每管取200μL上清于96孔板中，在405nm测定吸光度。实验同时设置多糖对照组(200μL相应浓度的多糖加400μL VBS2+缓冲液)、补体对照组(以200μL VBS2+缓冲液代替多糖)和全溶血组(100μL 2％SRBC溶于500μL三蒸水中)。将各浓度的多糖组吸光度值扣除相应多糖对照组吸光度值后计算溶血抑制率。以多糖浓度的对数作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，得到的拟合曲线计算50％抑制溶血所需供试品的浓度(CH50值)。以肝素作为阳性对照药，结果显示五个均一多糖对补体经典途径激活都有显著的抑制活性(如表1所示)。
实施例4旁路途径补体抑制试验
取健康成年男性志愿者血清，以VBS-Mg-EGTA缓冲液(巴比妥缓冲液，pH＝7.4，含5mM Mg2+和8mM EGTA)稀释为1:8，作为旁路途径的补体来源。保存于3.8％枸橼酸钠溶液的兔红细胞以VBS-Mg-EGTA缓冲液配置成0.5％兔红细胞。精密称量多糖约3mg，加入VBS-Mg-EGTA缓冲液，对倍稀释成8个浓度。不同浓度的多糖溶液150μL与1:8的补体150μL在37℃预孵育10min后，加入200μL 0.5％兔红细胞，在37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min。每管取200μL上清于96孔板中，在405nm测定吸光度。实验同时设置多糖对照组(150μL相应浓度的多糖溶液加350μL VBS-Mg-EGTA缓冲液)、补体对照组(以150μL VBS-Mg-EGTA缓冲液代替多糖溶液)和全溶血组(200μL0.5％兔红细胞溶于300μL三蒸水中)。将各浓度的多糖组吸光度值扣除相应多糖对照组吸光度值后计算溶血抑制率。以多糖浓度的对数作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，得到的拟合曲线计算50％抑制溶血所需供试品的浓度(AP50值)。以肝素作为阳性对照药，结果如见表所示。
表1五种香柏多糖对补体激活的抑制作用
Figure BDA0001664093920000081
CH50和AP50值表达为：平均值±SD(n＝3)；NA：No active。

Claims (2)

1.香柏多糖在制备补体抑制药物中的用途；所述的香柏多糖是XB-PS2、XB-PS3、XB-PS4、XB-PS5或XB-PS6，分别具有以下结构特征：
（1）XB-PS2的结构特征为：两种单糖组成的多糖，单糖摩尔比为葡萄糖:半乳糖醛酸=0.574: 0.426，分子量为24.6 KDa；总糖含量为97.70 %；蛋白含量为3.31 %；糖醛酸含量为47.77 %；不含硫酸基；
（2）XB-PS3的结构特征为：三种单糖组成的多糖，单糖摩尔比为阿拉伯糖:半乳糖醛酸:甘露糖= 0.58:0.33:0.09，分子量为86.04 KDa；总糖含量为96.75 %；蛋白含量为0.23 %；糖醛酸含量为25.68 %；不含硫酸基；
（3）XB-PS4的结构特征为：三种单糖组成的多糖，单糖摩尔比为阿拉伯糖:半乳糖醛酸:甘露糖= 0.48:0.35:0.17，分子量为84.42 KDa；总糖含量为96.12 %；蛋白含量为2.15 %；糖醛酸含量为25.8 %；不含硫酸基；
（4）XB-PS5的结构特征为：三种单糖组成的多糖，单糖摩尔比为阿拉伯糖:半乳糖醛酸:甘露糖= 0.25:0.26:0.49，分子量为67.77 KDa；总糖含量为96.32 %；蛋白含量为2.12 %；糖醛酸含量为35.67 %；不含硫酸基；
（5）XB-PS6的结构特征为：三种单糖组成的多糖，单糖摩尔比为阿拉伯糖:半乳糖醛酸:半乳糖= 0.58:0.26:0.14，分子量为18.84 KDa；总糖含量为97.14 %；蛋白含量为2.28 %；糖醛酸含量为15.8 %；不含硫酸基。
2.权利要求1所述的用途，其特征是，所述的香柏多糖通过以下步骤制备：
香柏枝叶以乙醇提取，滤过，药渣用热水提取，滤过，浓缩，离心，上清液加入适量乙醇，乙醇终浓度70%~80%，静置，离心去上清，沉淀以水复溶，除去游离蛋白，即得粗多糖；粗多糖加水溶解，分次用DEAE-cellulose色谱进行初步分离，依次用蒸馏水、0.1、0.4、0.8、1.6和2.0 mol/L的NaCl溶液洗脱，根据流出液的糖显色反应和紫外检测结果合并相同的多糖组分；将0.1、0.4、0.8、1.6和2.0 mol/L的NaCl溶液洗脱所得的5个多糖组分，分别用截留分子量在2KDa-400KDa的凝胶色谱进一步纯化，以0.1 mol/L的NaCl溶液洗脱，根据糖显色反应和紫外检测的结果合并相同流分，并进行抗补体活性检测，最终得到抗补体活性均一多糖。
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