CN110496129B - 利拉利汀的抗肿瘤活性及其新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明发现化合物利拉利汀对体外培养的多种人肿瘤细胞及荷人肿瘤细胞裸小鼠肿瘤生长均具有明显的抑制作用。利拉利汀能诱导肿瘤细胞周期阻滞并促进其凋亡从而达到良好的抗肿瘤作用，对多种体外培养的人肿瘤细胞具有明显的抑制作用，对人结直肠癌细胞HCT 116抑制率最高可达80.02±2.84％，对荷人结直肠癌细胞HCT 116裸小鼠肿瘤生长抑制率可达78.12±5.17％。该化合物可剂量依赖性地将癌细胞阻滞在G2‑M期并促进细胞凋亡，其抗肿瘤活性优选抗结直肠癌、脑胶质瘤、乳腺癌等活性，最优选抗结直肠癌活性。

Description

利拉利汀的抗肿瘤活性及其新用途
发明领域
本发明涉及利拉利汀的抗肿瘤活性及其在医药领域的新用途。
背景技术
利拉利汀(linagliptin)，化学名称为8-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-7-(2-丁炔基)-3，7-二氢-3-甲基-1-[(4-甲基-2-喹唑啉基)甲基]-1H-嘌呤-2，6-二酮，是一种白色至黄色粉末，略微吸潮固体物质，分子量472.54，溶于甲醇(大约60mg/mL)，微溶于乙醇(大约10mg/mL)、异丙醇(＜1mg/mL)和丙酮(大约1mg/mL)、水(0.9mg/mL)。2011年5月美国FDA批准了勃林格殷格翰研发的利拉利汀(商品名TRADJENTA)用于结合饮食和运动改善2型糖尿病患者的血糖控制能力[1]。临床上利拉利汀既可单独服用，也可与其他降糖药物如二甲双胍(metformin)、格列美脲(glimepiride)和吡格列酮(pioglitazone)等联合使用，单用和联合使用临床上均可取得较好的效果[2-6]。参考TRADJENTA说明书，利拉利汀对肝肾功能无明显影响，且在健康受试者对照临床试验期间，每天口服利拉利汀最高达600mg(相当于每天推荐剂量的120倍)无剂量相关药物不良反应。我们研究发现，利拉利汀对体外培养的多种人肿瘤细胞及荷瘤小鼠肿瘤生长均具有明显的抑制作用。
发明内容
本发明内容涉及化合物利拉利汀的抗肿瘤活性及其在制备癌症治疗和预防药物中的新用途。其特征为：利拉利汀具有明显而广泛的抗肿瘤活性，对体外培养的多种人体肿瘤细胞生长具有抑制作用，抑制率最高可达80.02±2.84％；该化合物可剂量依赖性地将癌细胞阻滞在G2-M期，且具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用；对荷人结直肠癌裸小鼠肿瘤生长的抑制率最大可达78.12±5.17％。其抗肿瘤活性优选抗结直肠癌、脑胶质瘤、乳腺癌等，最优选抗结直肠癌活性。本发明所涉及的利拉利汀抗肿瘤活性可被用于制备抗肿瘤药物和预防肿瘤发生的药物。
附图说明
图1是利拉利汀作用于人结直肠癌HCT 116细胞及HT-29细胞0～72h的生长曲线图。A为利拉利汀作用于HCT 116的生长曲线图，B为利拉利汀作用于HT-29的生长曲线图，由A，B可见，利拉利汀对人结直肠癌细胞生长具有明显的抑制作用。
图2是利拉利汀对人结直肠癌HCT 116细胞周期及凋亡的影响。A，B，C为不同浓度利拉利汀作用于HCT116的细胞周期图，由图可见利拉利汀可诱导HCT 116细胞发生G2-M期阻滞及凋亡。
图3是利拉利汀对人乳腺癌MCF7细胞0～72h的生长曲线图。由图可见利拉利汀对人乳腺癌MCF7细胞生长具有明显抑制作用。
图4是利拉利汀作用人神经胶质瘤U251细胞0～72h的生长曲线图。由图可见利拉利汀对人神经胶质瘤U251细胞具有明显抑制作用。
图5是利拉利汀作用于荷人结直肠癌HCT 116细胞裸小鼠肿瘤生长曲线图及其对肿瘤生长的抑制作用图。由图可见利拉利汀能够明显抑制小鼠肿瘤的生长。
具体实施方式
下面通过具体实施例来对本发明作进一步的说明，但这些实施例只是为了说明，而不是对本发明的限制。
实施例
1.利拉利汀对人结直肠癌HCT 116细胞及HT-29细胞活力的影响
采用MTT比色法比较利拉利汀对人结直肠癌HCT 116细胞及HT-29细胞的细胞毒性。两种细胞分别以1600个/孔的密度接种于96孔板，接种12～24h后，在0～100μM之间设置五个给药组，同时设空白对照组，每组4个复孔。分别测0h、24h、48h、72h四个时相各孔细胞的OD值，并做细胞生长曲线图。结果见图1，利拉利汀对人结直肠癌细胞HCT 116及HT-29细胞生长有明显抑制作用，其抑制作用均呈现剂量和时间依赖性。
图1不同浓度利拉利汀作用于人结直肠癌HCT 116细胞及HT-29细胞0～72h的生长曲线图：
A.不同浓度利拉利汀对人结直肠癌HCT 116细胞的生长曲线图
B.不同浓度利拉利汀对人结直肠癌HT-29细胞的生长曲线图
结论：由图1比较可知，在1～100μM范围内，利拉利汀对人结直肠癌HCT 116细胞及HT-29细胞的生长抑制作用呈现明显的时间及剂量依赖性。
2.利拉利汀对人结直肠癌HCT 116细胞周期及凋亡的影响
本实验采用细胞PI染色、流式细胞仪检测的方法测定利拉利汀对结直肠癌HCT116细胞周期的影响。与MTT实验相同密度的结直肠癌HCT 116细胞接种于直径10cm的平皿中，接种12～24h后，加利拉利汀至终浓度为50μM、100μM，作用48h，另设溶剂空白对照组。收集全细胞，磷酸盐缓冲液洗2遍，70％冰乙醇4℃固定保存过夜。1000r/min离心5min弃去固定液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次。用500μL PBS重悬细胞，加入RNaseA使终浓度为20μg/mL，37℃水浴，45min。加入PI染液使终浓度为50μg/mL，4℃避光染色60min。流式细胞仪检测。结果见图2，与阴性对照相比较，加药组周期显著改变，低浓度组细胞G2/M期比例增大而G1和S期比例减小，且有一定的凋亡；高浓度组细胞G2-M期和S期比例增大而G1比例减小。
图2利拉利汀对人结直肠癌HCT 116细胞周期及凋亡的影响
A空白对照
B 50μM利拉利汀作用48h
C 100μM利拉利汀作用48h
结论：由图2，利拉利汀作用人结直肠癌HCT116细胞48h，空白对照组G2-M期细胞的比例为19.97％；50μM利拉利汀组G2-M期的细胞比例为25.11％；100μM利拉利汀组G2-M期的细胞比例为31.07％，说明利拉利汀可以一定程度诱导人结直肠癌HCT116细胞发生G2-M期阻滞，影响其正常生长。另由图可见利拉利汀也有明显诱导人结直肠癌HCT116细胞凋亡的作用。
3.利拉利汀对人乳腺癌MCF7细胞活力的影响
采用MTT比色法检测利拉利汀对人乳腺癌MCF7细胞的细胞毒性。以1600个/孔的密度接种于96孔板，接种12～24h后，药物按10μM、30μM、50μM、100μM设四个给药组，同时设空白对照组，每组4个复孔。分别测0h、24h、48h、72h四个时相各孔细胞的OD值做细胞生长曲线图。结果见图3，对于MCF7细胞，利拉利汀在高浓度(100μM)和长时间(72h)达到最大抑制率60.00±5.15％。
图3利拉利汀作用人乳腺癌MCF7细胞0～72h的生长曲线图
结论：由图3可知，在1～100μM剂量范围内，利拉利汀对人乳腺癌MCF7细胞的杀伤作用有一定剂量和时间依赖性。
4.利拉利汀对人神经胶质瘤U251细胞的影响
采用MTT比色法检测利拉利汀对人神经胶质瘤细胞U251的细胞毒性作用。以1600个/孔的密度接种于96孔板，接种12～24h后，利拉利汀按1μM、10μM、20μM、50μM、100μM设五个给药组，同时设空白对照组，每组4个复孔。分别测0h、24h、48h、72h四个时相各孔细胞的OD值做细胞生长曲线图。结果见图4，对于U251细胞，利拉利汀在高浓度(100μM)和长对间(72h)达到最大抑制率67.00±4.21％。
图4利拉利汀作用人神经胶质瘤细胞U251 0～72h的生长曲线图
结论：由图4可知，利拉利汀在1～100μM浓度范围内对人神经胶质瘤U251细胞的杀伤作用有一定剂量和时间依赖性。
5.利拉利汀对荷人结直肠癌HCT116细胞移植瘤裸小鼠肿瘤生长的影响
裸小鼠适应环境1周，取HCT116人结直肠癌细胞，稀释成107个/mL，裸小鼠背部皮下接种0.1mL/只。待瘤体积长至10-50mm3后开始给药。随机分4组，每组6只，分别为利拉利汀高(500mg/kg体重)、利拉利汀低(50mg/kg体重)、PBS空白对照(16mL/kg)、环磷酰胺阳性对照(30mg/kg体重)组。裸小鼠称重、编号，接瘤后按组别进行利拉利汀灌胃给药，每日给药1次，环磷酰胺组腹腔注射，两天给药1次，连续2周，其他正常饲养。裸小鼠于末次给药当晚禁食不禁水，第二天解剖。实验过程中记录裸小鼠体重和瘤体积，观察裸小鼠生长情况。实验终点断颈椎处死裸鼠，取肿瘤组织，测量肿瘤体积并计算抑制率，抑制率＝(对照组瘤体积-加药组瘤体积/对照组瘤体积)×100％。结果见图5，利拉利汀高、低剂量组均可以明显抑制荷瘤裸小鼠肿瘤的生长。
图5利拉利汀作用荷人结直肠癌HCT 116细胞裸小鼠肿瘤生长曲线图及其对肿瘤生长的抑制作用图
结论：由图5可知，利拉利汀对荷人结直肠癌HCT 116细胞裸小鼠肿瘤生长具有明显的抑制效果，其抑制率最高可达78.12±5.17％。
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Claims (1)

1.利拉利汀在制备预防和/或治疗结直肠癌药物中的用途。
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