CN110483548B - 荜茇酰胺衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荜茇酰胺衍生物及其制备方法和应用，属于医药化学技术领域。所述荜茇酰胺衍生物如式(I)所示：
Figure DDA0002177637180000011
所述荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐，其作为靶向Keap1分子探针，能够定位并结合裂解液中的Keap1蛋白，并可通过后期Western‑Blot中被检测，为研究荜拔酰胺的抗肿瘤作用机制提供新的手段。其以3‑羟基‑4‑硝基苯甲醛为原料，合成过程简单、高效、快捷，所制备的荜茇酰胺衍生物具有较高的产率。

Description

荜茇酰胺衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药化学技术领域，具体涉及一种荜茇酰胺衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
荜拔酰胺(Piperlongumine,PL)是从胡椒属植物荜拔中分离提取的活性天然产物，研究发现具有多种生物活性，如消炎、抗真菌、治疗焦虑和抑郁症、抗血小板凝集和抗肿瘤作用等。研究发现，荜拔酰胺选择性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞的毒性非常小，这一独特的选择性作用引起了国内外药物研究者的关注，以其为先导化合物研究开发新型抗肿瘤药物。
荜拔酰胺的抗肿瘤作用机制仍不明确，其广泛被认为是一类作用于多个靶点的小分子，如上调p53蛋白的表达、抑制NF-κB的DNA结合活性及抑制TrxR1蛋白发挥胃癌细胞SGC-7901增殖抑制活性等。对于其上调活性氧所介导的细胞内机制研究尚未得到明确的结论。所以，有必要设计合成一种分子探针，以期其能够与生物蛋白结合，并易于表达，从而提供一种新的研究荜拔酰胺的抗肿瘤作用机制的手段。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐，其作为制备靶向Keap1分子探针的中间体，为研究荜拔酰胺的抗肿瘤作用机制提供新的手段。
本发明还提供一种荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐，其作为靶向Keap1分子探针，能够定位并结合裂解液中的Keap1蛋白，并可通过后期Western-Blot中被检测，为研究荜拔酰胺的抗肿瘤作用机制提供新的手段。
本发明还提供一种荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐的制备方法，其以3-羟基-4-硝基苯甲醛为原料，合成过程简单、高效、快捷，所制备的荜茇酰胺衍生物具有较高的产率。
本发明还提供一种荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐，作为制备靶向Keap1分子探针试剂的中间体、以及作为靶向Keap1分子探针的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐，所述荜茇酰胺衍生物的结构如式(I)所示：
Figure BDA0002177637160000021
其中，R1选自碳原子数为2～10的炔基，R2选自卤素。
优选地，所述荜茇酰胺衍生物的结构如式(I-1)所示：
Figure BDA0002177637160000022
一种荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐，所述荜茇酰胺衍生物的结构如式(II)所示：
Figure BDA0002177637160000031
其中，R2选自卤素，R3选自硝基或氯乙酰胺基或丙烯酰胺基，R4选自氢或碳原子数为2～8的烷基。
优选地，所述荜茇酰胺衍生物的结构如式(II-1)所示：
Figure BDA0002177637160000032
其中，R3选自硝基或氯乙酰胺基或丙烯酰胺基。
优选地，所述荜茇酰胺衍生物的结构如式(II-2)所示：
Figure BDA0002177637160000041
其中，R5选自-CH2Cl或-CH＝CH2。
一种如上所述的荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐的制备方法，包括以下步骤：
以3-羟基-4-硝基苯甲醛和溴代炔为原料，制备带有炔基的产物1；
由产物1与丙二酸反应，并用稀盐酸沉淀，制备带有氯代丙烯酸基团的产物2；
由产物2与草酰氯反应，并将所得产物与卤代七元内酰胺环反应，制备如式(I-1)所示的荜茇酰胺衍生物；
将如式(I-1)所示的荜茇酰胺衍生物与生物素-PEG4-叠氮反应，制备如式(II-1)所示的荜茇酰胺衍生物，其中，R3为硝基；
将R3为硝基的如式(II-1)所示的荜茇酰胺衍生物，在氯化铵和铁粉存在下还原，并将还原产物与氯乙酰氯或丙烯酰氯反应，制备如式(II-2)所示的荜茇酰胺衍生物，其中，R5选自-CH2Cl或-CH＝CH2。
一种如上所述的荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐在制备靶向Keap1分子探针制剂中的应用。
一种如上所述的荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐作为靶向Keap1分子探针的应用。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种荜茇酰胺衍生物及其制备方法和应用，有益效果是：本发明设计并合成了一种荜茇酰胺衍生物，其可以作为在细胞及其裂解液中靶向Keap1蛋白的活性小分子探针，可靶向Keap1并在链霉素琼脂糖珠中富集，在后期Western-Blot中被检测，从而得知Keap1表达量并辅助验证Keap1在细胞中的活动，为荜拔酰胺调节细胞活性氧的作用机制提供了可能的潜在靶点，为后期进一步研究荜拔酰胺衍生物的蛋白-蛋白相互作用和荜拔酰胺衍生物靶点相关研究等提供新的依据。本发明合成上述荜茇酰胺衍生物的方法，以3-羟基-4-硝基苯甲醛为原料，通过加成、取代、还原等反应过程，合成目标产物，合成过程简单、高效、快捷，所制备的荜茇酰胺衍生物具有较高的产率。
附图说明
图1为一实施例中如式(II-1)所示的荜茇酰胺衍生物的核磁氢谱图。
图2为一实施例中如式(II-2)所示的荜茇酰胺衍生物的核磁氢谱图。
图3为一实施例中如式(II-2)所示的荜茇酰胺衍生物的液相纯度。
图4为一实施例中如式(II-2)所示的荜茇酰胺衍生物的核磁氢谱图。
图5为一实施例中如式(II-2)所示的荜茇酰胺衍生物的液相纯度。
图6为如式(II-2)所示的荜茇酰胺衍生物钓取细胞裂解液中Keap1蛋白的Western-Blot结果图。
具体实施方式
以下结合本发明的附图，对发明的技术方案以及其技术效果做进一步的详细阐述。
一具体实施方式中，一种荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐，所述荜茇酰胺衍生物的结构如式(I)所示：
Figure BDA0002177637160000061
其中，R1选自碳原子数为2～10的炔基，R2选自卤素。
例如，所述荜茇酰胺衍生物的结构式如(I-1)所示：
Figure BDA0002177637160000062
一种如式(I-1)所述的荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐的制备方法，包括以下步骤：
a.以3-羟基-4-硝基苯甲醛和溴丙炔为原料，制备带有丙炔基的产物1；
b.由产物1与丙二酸反应，并用稀盐酸沉淀，制备带有氯代丙烯酸基团的产物2；
c.由产物2与草酰氯反应，并将所得产物与氯代七元内酰胺环反应，制备如式(I-1)所示的荜茇酰胺衍生物。
具体地：
(1)将3-羟基-4-硝基苯甲醛和溴丙炔(Propargyl bromide)溶解于DMF(二甲基甲酰胺)中，加入碳酸钾(K2CO3)，室温下反应数小时后，加入5倍体积纯净水并用乙酸乙酯萃取。合并有机层并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后拌样上柱，以乙酸乙酯:石油醚1:4将产物洗脱，得黄色固体，即为产物1，产率约100％。其反应机理如下：
Figure BDA0002177637160000071
(2)将(1)中得到的产物1溶于吡啶(pyridine)，加入丙二酸(Propanedioic acid)及催化量哌啶(Piperidine)后于一定温度下反应4小时。TLC(Thin LayerChromatography，薄层色谱)监测直至原料耗干，加入1mol/L稀盐酸(Oxalyl chloride)直至沉淀不再析出，静置沉淀后抽滤可得白色固体物质，即为产物2，收率约为78％。其反应机理如下：
Figure BDA0002177637160000072
(3)将(2)中所得产物2溶于干燥的二氯甲烷中，加入催化量DMF，冰浴下缓慢加入草酰氯，缓慢升至室温，TLC监测原料耗干后在干燥环境下减压蒸干后，的产物3备用。将氯代七元内酰胺环溶于无水THF(Tetrahydrofuran，四氢呋喃)中并氮气保护，降温后加入正丁基锂，反应数分钟。将产物3用无水THF溶解后缓慢滴加至反应瓶内，在低温下反应2小时。加入5倍体积纯净水并用乙酸乙酯萃取。合并有机层并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后拌样上柱，以乙酸乙酯:石油醚1:3将产物洗脱，得淡黄色固体，即为如式(I-1)所示的荜茇酰胺衍生物，收率28％。其反应机理如下：
Figure BDA0002177637160000081
又一具体实施方式中，一种荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐，所述荜茇酰胺衍生物的结构如式(II)所示：
Figure BDA0002177637160000082
其中，R2选自卤素，R3选自硝基或氯乙酰胺基或丙烯酰胺基，R4选自氢或碳原子数为2～8的烷基。
例如，所述荜茇酰胺衍生物的结构如式(II-1)所示：
Figure BDA0002177637160000091
其中，R3选自硝基或氯乙酰胺基或丙烯酰胺基。
例如，所述荜茇酰胺衍生物的结构如式(II-2)所示：
Figure BDA0002177637160000092
其中，R5选自-CH2Cl或-CH＝CH2。
一种如上所述的荜茇酰胺衍生物，包括其这些形式的任意混合物或其药用盐的制备方法，包括以下步骤：
d.将如式(I-1)所示的荜茇酰胺衍生物与生物素-PEG4-叠氮反应，制备如式(II-1)所示的荜茇酰胺衍生物，其中，R3为硝基；
e.将R3为硝基的如式(II-1)所示的荜茇酰胺衍生物，在氯化铵和铁粉存在下还原，并将还原产物与氯乙酰氯或丙烯酰氯反应，制备如式(II-2)所示的荜茇酰胺衍生物，其中，R5选自-CH2Cl或-CH＝CH2。
具体地：
(4)将如式(I-1)所示的荜茇酰胺衍生物溶解于叔丁醇中，加入硫酸铜，加入生物素-PEG4-叠氮，氮气保护。将维生素C钠(C6H7NaO6)溶于纯净水中，缓慢滴加至反应瓶内，室温下反应数小时，TLC监测原料耗干，加入5倍体积纯净水并用乙酸乙酯萃取。合并有机层并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后用二氯甲烷/甲醇10:1进行厚硅胶制备板分离得粗品，将粗品于反向液相柱(YMC-ODS Pack,250×10mml.D.,s-5m)下精制，流动相为乙腈/水75:25，流速：2mL/min，得淡黄色油状液，即为(II-1)所示的荜茇酰胺衍生物，其中，R3为硝基，纯度>95％。其反应机理如下所示：
Figure BDA0002177637160000101
(5)将(4)中合成的产物溶解于乙醇/水5:1溶液中，加入氯化铵和还原铁粉并在一定温度下反应数小时，TLC监测原料耗干，将反应液置于硅藻土上进行过滤，加乙酸乙酯洗涤并用食盐水洗，无水硫酸钠干燥后拌样上柱，以乙酸乙酯:石油醚1:3将产物洗脱，得黄色固体，为产物4，收率56％；
将所得产物4溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺，冰浴下加入氯乙酰氯或丙烯酰氯，TLC监测反应完全，加入5倍体积纯净水并用乙酸乙酯萃取。合并有机层并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后用乙酸乙酯/石油醚1:2进行厚硅胶制备板分离，可分别得到如式(II-2)所示的荜茇酰胺衍生物，收率分别为70％和65％。其反应机理如下所示：
Figure BDA0002177637160000111
其中，R5选自-CH2Cl或-CH＝CH2。
值得说明的是，上述合成过程仅仅提供了其中一种同分异构体或相似结构的合成过程，其中，将溴丙炔用其他碳原子数为3-10的炔类物质替换，可以合成具有不同烷基支链的化合物，其效果与本发明实施例中所提供的化合物的性质相似。其中，用其他卤素原子的替代氯原子，可以得到具有不同活性基团的的化合物，但其中，以氯原子和关键活性位点的化合物，且与keap1的靶向效果最为突出。其中，连接苯环和七元内酰胺环的不饱和双键为反式双键是，与keap1的靶向效果最佳。
以下结合具体实施例，进一步说明本发明制备如式(I)以及如式(II)所示的荜茇酰胺衍生物的过程以及验证所述荜茇酰胺作为Keap1分子探针的应用效果。值得说明的是，以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，通过对本发明中的荜茇酰胺衍生物的关键活性位点采取的，利用性质相似的基团或原子进行替换的方式，或以其他方式在不付出创造性劳动的基础上，对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。
实施例1：如式(I-1)所示的荜茇酰胺衍生物的制备
将1.07g(1.0当量)3-羟基-4-硝基苯甲醛和0.9g(1.2当量)溴丙炔溶解于10mLDMF，加入0.2g(2.0当量)碳酸钾，室温下反应4小时后加入5倍体积纯净水并用乙酸乙酯萃取。合并有机层并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后拌样上柱，以乙酸乙酯:石油醚1:4将产物洗脱，得黄色固体状产物1计1.3g，收率100％。
将得到的产物1溶于8mL吡啶，加入丙二酸1.2g(1.8当量)及催化量哌啶后于60℃下反应4小时。TLC监测直至原料耗干，加入1mol/L稀盐酸直至沉淀不再析出，静置沉淀后抽滤可得白色固体状产物2计1.2g，收率78％。
将所得产物2溶于5mL干燥的二氯甲烷中，加入催化量DMF，冰浴下缓慢加入2mL草酰氯，缓慢升至室温，TLC监测原料耗干后在干燥环境下减压蒸干后备用。
将氯代七元内酰胺环(1.1g)溶于无水THF中并氮气保护，降温至-78℃，加入1mol/L的正丁基锂1ml(0.8当量)反应10分钟。将步骤(3)所得酰氯用无水THF溶解后缓慢滴加至反应瓶内，在-78℃下反应2小时。加入5倍体积纯净水并用乙酸乙酯萃取。合并有机层并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后拌样上柱，以乙酸乙酯:石油醚1:3将产物洗脱，得淡黄色固体状产物，即为如式(I-1)所示的荜茇酰胺衍生物，共计470mg，收率28％。
实施例2：如式(II-1)所示的荜茇酰胺衍生物(R3为硝基)的制备
将产物(I-1)30mg溶解于5mL叔丁醇中，加入8mg(1.0当量)硫酸铜，加入30mg(0.8当量)生物素-PEG4-叠氮，氮气保护。将25mg(3.0当量)维生素C钠溶于5mL纯净水中，缓慢滴加至反应瓶内，室温下反应4小时，TLC监测原料耗干，加入5倍体积纯净水并用乙酸乙酯萃取。合并有机层并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后用二氯甲烷/甲醇10:1进行厚硅胶制备板分离得粗品，将粗品于反向液相柱(YMC-ODS Pack,250×10mml.D.,s-5m)下精制，流动相为乙腈/水75:25，流速：2mL/min，得淡黄色油状液6mg，即为如式(II-1)所示的荜茇酰胺衍生物(R3为硝基)，其核磁氢谱谱图如图1所示，其中：
1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ:1.40-1.43(m,2H,CH2),1.56-1.60(m,4H,2CH2),1.98-2.01(m,2H,CH2),2.18-2.21(t,2H,J＝7.3Hz,CH2C＝O),2.42-2.46(q,2H,J＝7.4Hz,CH2),2.68-2.70(d,1H,J＝12.7Hz,CH),2.89-2.92(dd,1H,J1＝5.0Hz,J2＝5.3Hz,CH),3.17-3.20(m,1H,SCH),3.33-3.35(m,2H,CH2S),3.49-3.51(t,2H,J＝5.6Hz,CH2),3.56-3.59(m,12H,3OCH2CH2O),3.89-3.91(t,2H,J＝4.5Hz,CH2),3.98-4.00(t,2H,J＝6.2Hz,CH2),4.28-4.30(m,1H,CH),4.47-4.49(m,1H,CH),4.61-4,63(t,2H,J＝5.0Hz,CH2),5.43(s,2H,OCH2),6.94-6.96(t,1H,J＝8.5Hz,＝CH),7.34-7.36(m,1H,Ar-H),7.50-7.52(d,1H,J＝15.8Hz,＝CH),7.68-7.71(d,1H,J＝15.8Hz,＝CH),7.69-7.70(s,1H,Ar-H),8.20(s,1H,Ar-H)。
所得化合物产率约50％，纯度>95％。
实施例3：如式(II-2)所示的荜茇酰胺衍生物(R3为-CH2Cl或-CH＝CH2)的制备
将实施例2所得产物150mg溶解于乙醇/水5:1溶液中，加入107mg(5.0当量)氯化铵和112mg(5.0当量)还原铁粉并在55℃下反应6小时，TLC监测原料耗干，将反应液置于硅藻土上进行过滤，加乙酸乙酯洗涤并用食盐水洗，无水硫酸钠干燥后拌样上柱，以乙酸乙酯:石油醚1:3将产物洗脱，得黄色固体78mg，收率约50％。
将所得产物20mg溶解于5mL二氯甲烷中，加入25L(3.0当量)三乙胺，冰浴下加入6L(1.2当量)氯乙酰氯或8L(1.2当量)丙烯酰氯，TLC监测反应完全，加入5倍体积纯净水并用乙酸乙酯萃取。合并有机层并用饱和食盐水洗。
无水硫酸钠干燥后用二氯甲烷:甲醇10:1进行厚硅胶制备板分离得粗品，将粗品于反向液相柱(YMC-ODS Pack,250×10mml.D.,s-5m)下精制，流动相为乙腈:水75:25，流速：2mL/min，得淡黄色油状液12mg，即为如式(II-2)所示的产物，其中，R3为-CH2Cl，收率分别为37％，纯度大于95％。其核磁氢谱谱图及液相纯度如图2和图3所示，其中：
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ:1.40-1.46(m,2H,CH2),1.58-1.74(m,4H,2CH2),1.99-2.04(m,2H,CH2),2.18-2.22(t,2H,J＝6.8Hz,CH2C＝O),2.41-2.46(q,2H,J＝7.5Hz,CH2),2.69-2.72(d,1H,J＝12.5Hz,CH),2.90-2.94(dd,1H,J1＝5.2Hz,J2＝5.0Hz,CH),3.17-3.21(m,1H,SCH),3.33-3.35(m,2H,CH2S),3.49-3.52(t,2H,J＝5.6Hz,CH2),3.55-3.57(m,12H,3OCH2CH2O),3.90-3.92(t,2H,J＝4.4Hz,CH2),3.98-4.01(t,2H,J＝6.2Hz,CH2),4.20-4.32(m,3H,CH2Cl,CH),4.47-4.50(m,1H,CH),4.62-4,65(t,2H,J＝5.0Hz,CH2),5.39(s,2H,OCH2),6.92-6.96(t,1H,J＝7.4Hz,＝CH),7.24-7.26(m,1H,Ar-H),7.38-7.42(d,1H,J＝15.7Hz,＝CH),7.49(s,1H,Ar-H),7.69-7.73(d,1H,J＝15.7Hz,＝CH),8.20-8.22(m,2H,Ar-H).HRMS:calcd for C40H54Cl2N8O10S:908.3100,found:.HPLC purity:>98％,Rt＝7.403min,UV254nm,80％methanol,flowrate:0.5mL/min.
无水硫酸钠干燥后用二氯甲烷:甲醇10:1进行厚硅胶制备板分离得粗品，粗品于反向液相柱(YMC-ODSPack,250×10mml.D.,s-5m)下精制，流动相为乙腈:水75:25，流速：2mL/min，得淡黄色油状液6mg，即为即为如式(II-2)所示的产物，其中，R3为-CH＝CH2产率18％，纯度95％。其核磁氢谱谱图及液相纯度如图4和图5所示，其中：
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ:1.40-1.46(m,2H,CH2),1.58-1.72(m,4H,2CH2),2.00-2.03(m,2H,CH2),2.18-2.22(t,2H,J＝6.7Hz,CH2C＝O),2.42-2.47(q,2H,J＝7.5Hz,CH2),2.69-2.73(d,1H,J＝13.0Hz,CH),2.90-2.95(dd,1H,J1＝5.0Hz,J2＝5.0Hz,CH),3.17-3.21(m,1H,SCH),3.51-3.58(m,16H,2CH2,3OCH2CH2O),3.90-3.93(t,2H,J＝4.8Hz,CH2),3.99-4.02(t,2H,J＝7.6Hz,CH2),4.29-4.32(m,1H,CH),4.49-4.51(m,1H,CH),4.60-4,62(m,2H,CH2),5.40(s,2H,OCH2),5.80-5.83(d,1H,J＝10.6Hz,＝CH),6.36-6.41(d,1H,J＝16.9Hz,＝CH),6.57-6.64(dd,1H,J1＝9.2Hz,J2＝10.5Hz,＝CH),6.94-6.98(t,1H,J＝7.0Hz,＝CH),7.25-7.28(d,1H,J＝8.7Hz,Ar-H),7.38-7.42(d,1H,J＝15.8Hz,＝CH),7.49(s,1H,Ar-H),7.71-7.74(d,1H,J＝15.8Hz,＝CH),8.22-8.26(m,2H,Ar-H).HRMS:calcd for886.3450,found:886.3462.HPLC purity:95.1％,Rt＝7.345min,UV 254nm,80％methanol,flowrate:0.5mL/min.
实施例4：如式(II-2)所示的荜茇酰胺衍生物钓取Panc-1细胞裂解液中Keap1蛋白
(1)细胞培养条件
选用胰腺癌细胞Panc-1，购自ATCC。使用细胞培养基(含10％胎牛血清、0.1mg/ml链霉素和100U/ml青霉素的DMEM高糖培养基(购自Hyclone)，在含37℃/5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养细胞。
(2)探针分子钓取Keap1靶点的Pull-down实验
将1～2×107数量的胰腺癌Panc-1细胞消化并重悬于一离心管内，加入400L IP细胞裂解液(购自Biosharp)，并加入1％磷酸酶抑制剂和1％蛋白酶抑制剂。将蛋白用BCA试剂盒(购自Thermo)定量至14g/L，分别取50L总蛋白至5个1.5mL离心管中，取一组作为对照组，余下四组加入不同浓度的探针(0,0.05,0.5,5mol/L)，将样品置于37℃下孵育40分钟。每组加入10L链霉素琼脂糖珠(购自Thermo)，混匀后放入4℃摇床过夜。第二天将各组离心管置于4℃离心机下，500g离心5分钟，弃上清，沉淀加入200L 0.25％TritonX-100(购自碧云天)，500g离心5分钟，重复清洗三次。向每组离心管内加入20mL IP裂解液/Loading buffer混合液(1:1，Loading buffer购自生工)，混匀后于100℃水浴下煮沸样品10分钟。后置于4℃离心机下，8000rmp离心5分钟，每组取上清15mL进行SDS-PAGE凝胶电泳。经转膜封闭操作后加入抗Keap1一抗(购自Proteintech)，将膜4℃下孵育过夜，第二天收集一抗，将膜用TBST清洗三次，每次5分钟。加入兔二抗于室温下孵育膜45分钟。如图6所示，结果在LI-COR(购自Odyssey)扫描成像系统下呈现，其中，上层是R3为-CH2Cl的靶向结果扫描成像，下层为R3为-CH＝CH2的靶向结果扫描成像。
由图6可以显而易见的看出，如式(II-2)所示的荜茇酰胺衍生物能够靶向作用于细胞裂解液中Keap1蛋白，并在链霉素琼脂糖珠中富集，在后期Western-Blot中被检测，从而得知Keap1表达量并辅助验证Keap1在细胞中的活动，为荜拔酰胺调节细胞活性氧的作用机制提供了可能的潜在靶点，为后期进一步研究荜拔酰胺衍生物的蛋白-蛋白相互作用和荜拔酰胺衍生物靶点相关研究等提供新的依据。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。

Claims (7)

1.一种荜茇酰胺衍生物，其特征在于，所述荜茇酰胺衍生物的结构如式(I)所示：
Figure FDA0004105418790000011
其中，R1选自碳原子数为2～10的炔基，R2选自卤素。
2.如权利要求1所述的荜茇酰胺衍生物，其特征在于，所述荜茇酰胺衍生物的结构如式(I-1)所示：
Figure FDA0004105418790000012
3.一种靶向Keap1的荜茇酰胺衍生物探针，其特征在于，所述荜茇酰胺衍生物探针的结构如式(II)所示：
Figure FDA0004105418790000021
其中，R2选自卤素，R3选自硝基或氯乙酰胺基或丙烯酰胺基，R4选自氢或碳原子数为2～8的烷基。
4.如权利要求3所述的靶向Keap1的荜茇酰胺衍生物探针，其特征在于，所述荜茇酰胺衍生物探针的结构如式(II-1)所示：
Figure FDA0004105418790000022
其中，R3选自硝基或氯乙酰胺基或丙烯酰胺基。
5.如权利要求4所述的靶向Keap1的荜茇酰胺衍生物探针，其特征在于，所述荜茇酰胺衍生物探针的结构如式(II-2)所示：
Figure FDA0004105418790000031
其中，R5选自-CH2Cl或-CH＝CH2。
6.一种如权利要求3或4所述的靶向Keap1的荜茇酰胺衍生物探针在制备靶向Keap1分子探针制剂中的应用。
7.一种如权利要求3或4所述的靶向Keap1的荜茇酰胺衍生物探针作为靶向Keap1分子探针的应用。
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