CN110468105A - 表达il-18r结合蛋白的免疫效应细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞，其特征在于，所述细胞表达特异性结合靶抗原的外源性受体和外源性IL‑18R结合蛋白，所述外源性IL‑18R结合蛋白能特异性结合IL‑18R且增强IL‑18R活性，所述靶抗原包括肿瘤抗原或病原体抗原。

Description

表达IL-18R结合蛋白的免疫效应细胞

技术领域

本发明属于免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及共表达IL-18R结合蛋白和外源性受体的细胞。

背景技术

近年来，根据CTL对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体(T CellReceptor，TCR)的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的抗体的scFv与T淋巴细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，并将其通过如慢病毒感染等方式基因修饰在T淋巴细胞表面。这种CAR T淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex，MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。

嵌合抗原受体包括胞外结合域，跨膜域和胞内信号域。通常胞外域包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜域采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号域采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ或FcεRIγ及共刺激信号分子CD28、CD27、CD137、CD134等的胞内信号域。

然而，由于生物体，特别是实体瘤的微环境的复杂性，在体外表现出优良效果的候选药物，在体内往往无法表现出相应的效果。尽管免疫效应细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但仍有其局限性，如部分患者不产生响应，复发、对实体瘤的疗效不佳，免疫效应细胞在肿瘤组织内的存活率较差、活性不高等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因工程化改造的免疫效应细胞，其表达特异性结合靶抗原的外源性受体和一种外源性IL-18R结合蛋白,增加免疫效应细胞在肿瘤组织中的驻留及其杀伤能力，进而增加抗肿瘤活性。

在本发明的第一方面，提供了一种细胞，其中，所述细胞表达特异性结合靶抗原的外源性受体和外源性IL-18R结合蛋白，所述外源性IL-18R结合蛋白能特异性结合IL-18R且增强IL-18R的活性，所述靶抗原包括肿瘤抗原或病原体抗原。

在一优选方式中，所述IL-18R结合蛋白选自IL-18或IL-18R的抗体。

在一优选方式中，所述IL-18R结合蛋白为外源性的IL-18。该外源性的IL-18可以是野生型的IL-18，也可以是经过人工改造的IL-18，该人工改造的IL-18与野生型的IL-18具有类似生物学活性。示例性的，人工改造的IL-18可以是能够结合IL18-R的截短的IL-18、突变型的IL-18。

在一优选方式中，所述IL-18R结合蛋白为IL-18，优选为hIL-18或mIL-18。

在一优选方式中，所述的IL-18具有SEQ ID NO:11所示的至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

在一优选方式中，所述的IL-18具有SEQ ID NO:29所示的至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

在一优选方式中，所述的外源性IL-18R结合蛋白是组成性表达。

在一优选方式中，所述的外源性IL-18R结合蛋白是诱导性表达。

在一优选方式中，所述的细胞为免疫效应细胞。

在具体实施例中，所述免疫效应细胞包括：T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞或骨髓源性吞噬细胞或其组合。优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞、或NKT细胞。更优选地，所述免疫效应细胞为T细胞。

在具体实施例中，所述免疫效应细胞来自自体

在具体实施例中，所述免疫效应细胞来自同种异体。

在一优选方式中，所述外源性IL-18R结合蛋白的活性受TCR信号活化调控。

在具体实施例中，所述外源性IL-18R结合蛋白的启动子活性受TCR信号活化调控。

在具体实施例中，所述外源性受体结合靶抗原后，所述的启动子调节所述外源性IL-18R结合蛋白的表达。

在具体实施例中，所述启动子包含依赖TCR信号活化的转录因子的结合基序。

在具体实施例中，所述启动子包含与依赖TCR信号活化的转录因子的结合基序可操作相连的最小启动子。

在具体实施例中，所述最小启动子为细胞因子最小启动子；优选的，所述细胞因子最小启动子包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子最小启动子，优选为IFN-γ、TNF-α或IL-2最小启动子；更优选，细胞因子最小启动子为IL-2最小启动子。

在具体实施例中，所述结合基序包括NFAT、NF-κB或AP-1结合基序或其组合，优选为NFAT结合基序，更优选为两个或多个NFAT结合基序，最优选为6个NFAT结合基序。

在一优选方式中，所述启动子包含与依赖TCR信号活化的转录因子的结合基序可操作相连的最小启动子；

进一步优选，所述结合基序具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：26所示的至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核苷酸序列，

进一步优选，所述最小启动子具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：27所示的至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核苷酸序列。

在一优选方式中，所述的靶抗原为肿瘤抗原。

在一优选方式中，所述肿瘤抗原为实体瘤相关抗原。

在具体实施例中，所述的肿瘤抗原选自：促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1；神经节苷脂GD3；Tn抗原；CD19；CD20；CD 22；CD 30；CD 70；CD 123；CD138；CD33；CD44；CD44v7/8；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)，B7H6；KIT(CD117)；白介素13受体亚单位α(IL-13Rα)；白介素11受体α(IL-11Rα)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；癌胚抗原(CEA)；NY-ESO-1；HIV-1Gag；MART-1；gp100；酪氨酸酶；间皮素；EpCAM；蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)；血管内皮生长因子受体；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)，MUC6；表皮生长20因子受体家族及其突变体(EGFR，EGFR2，ERBB3，ERBB4，EGFRvIII)；神经细胞粘附分子(NCAM)；碳酸酐酶IX(CAIX)；LMP2；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer；TGS5；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体；肿瘤血管内皮标记25 1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)；Claudin 6，Claudin18.2、Claudin18.1；ASGPR1；CDH16；5T4；8H9；αvβ6整合素；B细胞成熟抗原(BCMA)；CA9；κ轻链(kappa light chain)；CSPG4；EGP2，EGP40；FAP；FAR；FBP；胚胎型AchR；HLA-A1，HLA-A2；MAGEA1，MAGE3；KDR；MCSP；NKG2D配体；PSC1；ROR1；Sp17；SURVIVIN；TAG72；TEM1；纤连蛋白；腱生蛋白；肿瘤坏死区的癌胚变体；G蛋白偶联受体C类5组-成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受5体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；p53突变10体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；细胞色素P4501B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)；由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OYTES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

在一优选方式中，所述抗原选自GPC3、claudin 6、间皮素、EGFR、EGFRvIII或claudin 18.2中的任意；更优选的，所述实体瘤相关抗原为GPC3。

在具体实施例中，所述病原体抗原选自：病毒、细菌、真菌、原生动物，或寄生虫的抗原。在一具体实施方式中，所述病原体抗原为病毒抗原，该病毒抗原选自：巨细胞病毒抗原、爱泼斯坦-巴尔病毒抗原、人类免疫缺陷病毒抗原或流感病毒抗原。

在具体实施例中，所述实体瘤选自结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，肿瘤血管发生，脊椎肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌。优选的，所述实体瘤选自肝癌，肺癌，鳞状细胞癌。

在一优选方式中，所述的肿瘤选自肝癌、肺癌、胰腺癌、鳞状细胞癌。

在一优选方式中，所述外源性受体包含胞外抗原结合域、跨膜域和胞内结构域。

在具体实施例中，所述外源性受体为嵌合受体，选自：嵌合抗原受体(CAR)、修饰的T细胞(抗原)受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)或它们的组合。

在具体实施例中，所述外源性受体为嵌合抗原受体,其中:

(i)所述胞外抗原结合域包含：抗体，抗体片段，scFv，Fv，Fab，(Fab')2，单结构域抗体(SDAB)，VH或VL结构域，或骆驼科VHH结构域，或相应抗原的天然配体，或其组合；和/或

(ii)所述跨膜域包含选自以下组成的蛋白质的跨膜结构域:T细胞受体的α、β或ζ链、CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137,CD154,KIRDS2,OX40,CD2,CD27,LFA-1(CD11a,CD18),ICOS(CD278),4-1BB(CD137),GITR,CD40,BAFFR,HVEM(LIGHTR),SLAMF7,NKp80(KLRF1),CD160,CD19,IL2Rβ,IL2Rγ,IL7Rα,ITGA1,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,TNFR2,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,PAG/Cbp,NKp44,NKp30,NKp46,NKG2D,和NKG2C；和/或

(iii)所述胞内结构域包括：一级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域，其中：(1)所述一级信号传导结构域包含选自：CD3ζ,CD3γ,CD3δ,CD3ε,常见FcRγ(FCER1G),FcRβ(FcεR1b),CD79a,CD79b,FcγRIIa,DAP10,和DAP12的蛋白质的功能信号传导结构域，或其组合；和/或(2)所述共刺激信号传导结构域包含选自如下的蛋白质的功能信号传导结构域:CD27,CD28,4-1BB(CD137),OX40,CD30,CD40,PD-1,ICOS,淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1),CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3,特异性结合CD83的配体,CDS,ICAM-1,GITR,BAFFR,HVEM(LIGHTR),SLAMF7,NKp80(KLRF1),CD160,CD19,CD4,CD8α,CD8β,IL2Rβ,IL2Rγ,IL7Rα,ITGA4,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,TNFR2,TRANCE/RANKL,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,LAT,GADS,SLP-76,PAG/Cbp,NKp44,NKp30,NKp46,和NKG2D，或其组合。

在具体实施例中，所述的嵌合抗原受体的胞外抗原结合域包含特异性结合抗原的抗体或其片段、跨膜域包含CD28或CD8的跨膜域、胞内结构域包含CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ、或CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ、或CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ。

在具体实施例中，所述外源性受体的胞外抗原结合域含有与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

在具体实施例中，所述外源性受体的跨膜域具有SEQ ID NO:14所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

在具体实施例中，所述外源性受体的跨膜域具有SEQ ID NO:30所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

在具体实施例中，所述外源性受体的跨膜域具有SEQ ID NO:31所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

在具体实施例中，所述外源性受体的胞内结构域具有SEQ ID NO:15和16所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

在具体实施例中，所述外源性受体的胞内结构域具有SEQ ID NO:32和16所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

在具体实施例中，所述外源性受体的胞内结构域具有SEQ ID NO:33和34所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

在具体实施例中，所述细胞表达与SEQ ID NO:18所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

在具体实施例中，所述细胞表达与SEQ ID NO:19所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

在具体实施例中，所述细胞表达与SEQ ID NO:20所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

在具体实施例中，所述细胞表达与SEQ ID NO:21所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

在具体实施例中，所述细胞表达与SEQ ID NO:38所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

在具体实施例中，所述外源性受体和/或外源性IL-18R结合蛋白利用病毒载体表达；较佳地，所述的病毒载体是慢病毒载体，逆转录病毒载体或腺病毒载体。

在本发明的第二方面，提供了一种表达构建物，所述表达构建物包括顺序连接的特异性结合靶抗原的外源性受体的表达盒1和外源性IL-18R结合蛋白的表达盒2；优选地，所述表达盒1和2之间由串联片段F2A、PA2、T2A、和/或E2A连接。

在具体的实施例中，所述串联片段F2A具有SEQ ID NO:35所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

在具体的实施例中，所述串联片段PA2具有SEQ ID NO:10所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

在具体的实施例中，所述串联片段T2A具有SEQ ID NO:36所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

在具体的实施例中，所述串联片段E2A具有SEQ ID NO:37所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

在一优选方式中，所述外源性受体的表达盒具有SEQ ID NO:17所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列，所述外源性IL-18R结合蛋白的表达盒具有SEQ ID NO:9所示的至少90％同一性的序列。

在一优选方式中，所述外源性受体的表达盒具有SEQ ID NO:39所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列，所述外源性IL-18R结合蛋白的表达盒具有SEQ ID NO:9所示的至少90％同一性的序列。

在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，其包含上述本发明的表达构建物。

在本发明的第四方面，提供了一种病毒，所述的病毒包含上述本发明的表达载体。

在本发明的第五方面，提供了一种提高免疫应答细胞活力的方法，所述方法包括在免疫应答细胞中表达(共表达)特异性结合靶抗原的外源性受体和外源性IL-18R结合蛋白。

在本发明的第六方面，提供了上述的细胞、或表达构建物、或病毒的用途，用于制备抑制肿瘤、抑制病原体或加强受试者免疫耐受能力的药物。

在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含上述的细胞和药学上可接受的载体或赋形剂。

在本发明的第八方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒中包含上述的细胞或药物组合物。

具体来说，本发明涉及：

1.一种细胞，其特征在于，所述细胞表达特异性结合靶抗原的外源性受体和外源性IL-18R结合蛋白，所述外源性IL-18R结合蛋白能特异性结合IL-18R且增强IL-18R活性，所述靶抗原包括肿瘤抗原或病原体抗原。

2.如项1所述的细胞，其特征在于，所述IL-18R结合蛋白选自IL-18或IL-18R的抗体。

3.如项2所述的细胞，其特征在于，所述IL-18R结合蛋白是IL-18，优选为hIL-18或mIL-18。

4.如项3所述的细胞，其特征在于，所述的IL-18具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:29所示的至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

5.如项1所述的细胞，其特征在于，在所述细胞中，所述的外源性IL-18R结合蛋白是组成性表达或诱导性表达。

6.如项1-5任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞为免疫效应细胞；优选地，所述免疫细胞选自：T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞或骨髓源性吞噬细胞或它们的组合。

7.如项6所述的细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞为T细胞。

8.如项1-7任一所述的细胞，其特征在于，所述外源性IL-18R结合蛋白的启动子活性受TCR信号活化调控。

9.如项8所述的细胞，其特征在于，

所述启动子包含与依赖TCR信号活化的转录因子的结合基序可操作相连的最小启动子；

优选地，所述结合基序具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：26所示的至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核苷酸序列，

进一步优选，所述最小启动子具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：27所示的至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核苷酸序列。

10.如项1-9任一所述的细胞，其特征在于，所述靶抗原为肿瘤抗原，

优选地，所述肿瘤抗原为实体瘤相关抗原，

进一步优选所述抗原选自GPC3、claudin 6、间皮素、EGFR、EGFRvIII或claudin18.2中的任意；

更优选地，所述实体瘤相关抗原为GPC3。

11.如项1-10任一所述的细胞，其特征在于，所述外源性受体为嵌合受体，所述嵌合受体选自：嵌合抗原受体(CAR)、修饰的T细胞(抗原)受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)或它们的组合。

12.如项11所述的细胞，其特征在于，

所述嵌合抗原受体的胞外抗原结合域包含特异性结合抗原的抗体或其片段；

所述嵌合抗原受体的跨膜域包含CD28或CD8的跨膜域；

所述嵌合抗原受体的胞内结构域包含：

CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ、或

CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ、或

CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ。

13.如项12所述的细胞，其特征在于，所述特异性结合抗原的抗体或其片段具有与SEQ ID NO:12所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

14.如项12所述的细胞，其特征在于，所述外源性受体的跨膜域具有SEQ ID NO:14或30或31所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

15.如项12所述的细胞，其特征在于，

所述外源性受体的胞内结构域具有SEQ ID NO:15和16所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列；或

所述外源性受体的胞内结构域具有SEQ ID NO:32和16所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列；或

所述外源性受体的胞内结构域具有SEQ ID NO:33和34所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

16.如项1-15任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞表达与SEQ ID NO:18、19、20、21或38所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

17.如项1-16任一所述的细胞，其特征在于，所述外源性受体和/或外源性IL-18R结合蛋白利用病毒载体表达；

较佳地，所述的病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、或腺病毒载体。

18.如项1-17任一所述的细胞，其特征在于，所述的肿瘤选自肝癌、肺癌、胰腺癌、鳞状细胞癌。

19.一种表达构建物，其特征在于，所述表达构建物包括顺序连接的特异性结合靶抗原的外源性受体的表达盒1和外源性IL-18R结合蛋白的表达盒2；优选地，所述表达盒1和2之间由串联片段F2A、PA2、T2A、和/或E2A连接。

20.如项19所述的表达构建物，其特征在于，所述外源性受体的表达盒含有与SEQID NO:17或39所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，所述外源性IL-18R结合蛋白的表达盒与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核苷酸序列。

21.一种表达载体，其包含项19和/或20所述的表达构建物。

22.一种病毒，其特征在于，所述的病毒包含项21所述的表达载体。

23.一种提高表达嵌核受体的免疫应答细胞活力的方法，其特征在于，所述方法包括在免疫效应细胞中表达特异性结合靶抗原的外源性受体和外源性IL-18R结合蛋白。

24.项1-18任一所述的细胞，或项19或20所述的表达构建物，或项22所述的病毒的用途，用于制备抑制肿瘤、抑制病原体或加强受试者免疫耐受能力的药物。

25.一种药物组合物，所述的药物组合物包括：

项1-18任一所述的细胞，和

药学上可接受的载体或赋形剂。

26.试剂盒，

该试剂盒包含：项1-18任一所述的细胞；或

该试剂盒包含：项25所述的药物组合物。

附图说明

图1(A)显示了pRRLSIN-hu9F2-28Z-NFAT6-huIL18质粒图谱。

图1(B)显示了pRRLSIN-hu9F2-BBZ-NFAT6-huIL18质粒图谱。

图1(C)显示了MSCV-hu9F2-m28Z-mNFAT6-mIL18质粒图谱。

图2是检测体外CAR-T细胞表型实验。图2(A)检测CAR-T细胞CD8表型，图2(B)检测CAR-T细胞CD44,CD62L表型。

图3(A)～(C)显示了9F2-28Z-NFAT-IL18 CAR T细胞靶向GPC3阳性细胞的体外杀伤毒性检测；图3(D)显示了9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CAR-T细胞靶向GPC3阳性细胞的体外杀伤毒性检测。

图4(A)～(C)显示了9F2-28Z-NFAT-IL18 CAR T对荷PLC/PRF/5肝癌细胞的小鼠皮下移植瘤模型的体内治疗实验。

图5(A)～(C)显示了9F2-28Z-NFAT-IL18 CAR T对荷PLC/PRF/5肝癌细胞的大负荷小鼠皮下移植瘤模型的体内治疗实验。

图6(A)～(C)显示了9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CAR-T对荷Hepa1-6-GPC3肝癌细胞的皮下移植瘤模型的体内治疗实验。

图7(A)～(C)显示了9F2-28Z-NFAT-IL18 CAR-T细胞分泌细胞因子IL-2,TNF-α,IFN-γ的检测，分别检测Huh-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1细胞上清中IL-2,TNF-α,IFN-γ含量。

图8显示了9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CAR-T细胞分泌细胞因子IL-2,TNF-α,IFN-γ的检测。

具体实施方式

发明人发现表达有靶向GPC3的嵌合抗原受体和IL-18的免疫效应细胞提高了免疫效应细胞在肿瘤中的存活及功能，不仅在体外对实体瘤细胞有效，在体内对实体瘤细胞也具备更优异的杀伤效果。在此基础上完成了本发明。

除非专门定义，本文所用的所有技术和科学术语具有在基因治疗，生物化学、遗传学和分子生物学领域内的技术人员通常理解的相同含义。类似或等效于本文中描述的那些的所有方法和材料都可以在本发明的实践或测试中使用。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以其全部内容结合于本文中作为参考。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。此外，除非另有规定，材料、方法和实施例仅是说明性的，而并非旨在进行限制。

除非另有说明，本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术，这都属于本领域的技术范围。这些技术充分解释于文献中。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(FrederickM.AUSUBEL，2000，Wileyand sonInc，Library of Congress，USA)；MolecularCloning:A Laboratory Manual，Third Edition，(Sambrooketal，2001，Cold SpringHarbor，NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic AcidHybridization(B.D.Harries&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson和M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，尤其是Vols.154和155(Wuetal.eds.)和Vol.185，“Gene Expression Technology”(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer和Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Hand book OfExperimental Immunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)；和Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1986)。

为便于更好地理解本发明，对相关术语定义如下：

术语“基因工程化的细胞”，是指通过基因工程的手段改造的细胞。具体而言，本发明的细胞是一种基因工程化的细胞，该细胞指表达特异性结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体和IL-18的细胞。在一优选方案中，所述的细胞是免疫效应细胞。更优选的，所述的细胞是T细胞。

术语“免疫效应细胞”，是指参与免疫应答，产生免疫效应的细胞，如，T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。优选的，所述的免疫效应细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞。

在具体实施方式中，T细胞是自体T细胞、异种T细胞、同种异体T细胞。

在具体实施方式中，自然杀伤细胞是同种异体NK细胞。

术语“免疫效应细胞活性”是指免疫效应细胞接受抗原刺激而发生反应、增殖形成免疫效应物质并能进行特性免疫反应的能力。例如促进对靶细胞的杀伤或者抑制其生长或增殖。

术语“IL-18”是IL-18多肽、白细胞介素-18多肽、IFN-γ诱导因子或干扰素-γ诱导因子或IFN-γ诱导因子的同义词，是指能够与IL-18R(NM_003855.3,NM_001282399.1)(优选来自哺乳动物，例如鼠或人IL-18)相互作用(例如结合)的蛋白质(优选来自哺乳动物，例如鼠或人)，并且具有以下特征之一：(1)天然存在的哺乳动物IL-18的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO：11(人)所示的氨基酸序列或其片段；(2)基本上与SEQ ID NO：11(人)所示氨基酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(3)由天然存在的哺乳动物IL-18核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO：9(人)或其片段)所编码的氨基酸序列；(4)由与SEQ ID NO：9(人)所示核苷酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；(5)由与天然存在的IL-18核苷酸序列或其片段简并的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：9(人)或其片段)所编码的氨基酸序列；或(6)在严格性条件例如高度严格性条件下与前述核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列；(7)天然存在的哺乳动物IL-18的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO：29(鼠)所示的氨基酸序列或其片段；(8)基本上与SEQ ID NO：29(鼠)所示氨基酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(9)由天然存在的哺乳动物IL-18核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO：28(鼠)或其片段)所编码的氨基酸序列；(10)由与SEQ ID NO：28(鼠)所示核苷酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；(11)由与天然存在的IL-18核苷酸序列或其片段简并的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：28(鼠)或其片段)所编码的氨基酸序列；或(12)在严格性条件例如高度严格性条件下与前述核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列。

在本文中，hIL-18表示人白细胞介素18，mIL-18表示鼠白细胞介素18，IL-18泛指白细胞介素18。

贯穿本说明书，术语IL-18可互换地包括pro-IL-18(成熟IL-18在蛋白酶切割之前的前体)和成熟IL-18(蛋白酶切割后)，除非指定了意指pro-或成熟形式。

“增强IL-18R活性”应理解为意指本公开的IL-18R结合蛋白增强天然存在的IL-18R的任何一种或多种活性，包括但不限于刺激NK细胞的增殖、细胞毒性或成熟；刺激B细胞和T细胞的增殖或分化；刺激B细胞中的抗体产生和亲和力成熟；刺激CD8+T细胞的细胞毒性；刺激T细胞和NK细胞中干扰素γ产生；抑制树突状细胞(DC)活化和成熟；抑制炎性介质从肥大细胞释放；增强巨噬细胞的吞噬作用；抑制TReg细胞的产生或存活；和刺激骨髓祖细胞的增殖。

术语“治疗有效量”、和“有效量”在本文中可互换地使用，是指有效地实现特定生物学结果的化合物、制剂、物质或组合物的量，例如但不限于足以促进T细胞应答的量或剂量。当指示“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“抑制肿瘤有效量”或“治疗有效量”时，本发明的免疫效应细胞、或治疗剂的精确给药数量可以由医师在考虑个体在年龄、体重、肿瘤大小、转移的程度以及患者(受试者)的状况的情况下确定。有效量的免疫效应细胞是指但不限于能使免疫效应细胞抗肿瘤活性增加、增强或延长；抗肿瘤免疫效应细胞或活化免疫效应细胞数目的增加；促进IFN-γ分泌；肿瘤消退、肿瘤缩小、肿瘤坏死的免疫效应细胞的数量。

术语“T细胞(抗原)受体(T cell receptor,TCR)”为所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR负责识别与主要组织相容性复合体分子结合的抗原。TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等几部分；其特点是胞质区很短。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区(Vα、Vβ)又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR1，CDR2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁，而CDR3直接与抗原肽相结合。TCR分为两类：TCR1和TCR2；TCR1由γ和δ两条链组成，TCR2由α和β两条链组成。CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。TCR活化信号胞内转导的途径主要有PLC-γ活化途径和Ras-MAP激酶活化途径，经过一些列信号转导分子的级联反应，最终导致转录因子(NFAT、NF-kb、AP-1等)的活化，并进入核内调节相关靶基因的转录。

术语“AP-1(Activator protein 1)”是细胞内的一个转录激活因子，是由c-Fos和c-Jun组成的异二聚体。

术语“NF-kb(Nuclear factor kB)”是转录因子家族中的成员，是细胞内最重要的核转录因子，在许多细胞刺激介导的细胞信息的转录调控中起核心作用，参与多种基因的表达和调控，是细胞激活的标志。

术语“活化T细胞核因子”(Nuclear factor of activated T cells，NFAT)在细胞因子基因的转录调节中起着重要的作用。迄今已发现的NFAT蛋白可分为5个：NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4和NFAT5。

本文使用的术语“启动子”为由启动多核苷酸序列的特异性转录所需的细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列。

典型的真核生物启动子由最小启动子和其他顺式元件组成。最小启动子实质上是一个TATA框区，RNA聚合酶II(polII)、TATA结合蛋白(TBP)和TBP相关因子(TAF)可在此结合而启动转录。已发现这类序列元件(例如增强子)提高临近的基因的总体表达水平，且往往是以不依赖位置和/或取向的方式。在一些实施方案中，NFAT在T细胞活化过程中细胞因子的转录表达起着重要的作用。基于这样考虑，本发明人经过充分地研究提出将细胞因子的编码序列置于与含NFAT结合基序的最小启动子的调控之下。经过这样本申请发明人精确地设计可以实现在CART细胞输注体内后，CART细胞聚集到表达靶抗原的肿瘤组织中，在结合靶抗原后CART细胞的TCR信号通路活化，从而诱导CART细胞携带的细胞因子IL-18在肿瘤组织中的表达，参与抗肿瘤作用，如促进细胞因子(如IL-2，TNF-α，IFN-γ)的释放。

在本发明的一个具体的实施例中，利用含6个NFAT结合基序的IL2最小启动子是利用6个NFAT的结合位子与IL2的最小启动子(minimal promoter)串联在一起组成的启动子。本文所用的“嵌合受体”,即用基因重组技术将不同来源的DNA片段或蛋白质相应的cDNA连接而成的融合分子，包括胞外域、跨膜域和胞内域。嵌合受体包括但不限于：嵌合抗原受体(CAR)、修饰的T细胞(抗原)受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)。

本文所用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指一组多肽，当其在免疫效应细胞中时，给所述的细胞提供针对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。CAR通常包括至少一个细胞外抗原结合结构域(也称为胞外区)、跨膜结构域(也称为跨膜区)和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”或“胞内区”)，其包括来源于如下定义的刺激性分子和/或共刺激性分子的功能信号传导结构域。在某些方面，多肽组彼此邻接。多肽组包括在存在二聚化分子时可以使多肽彼此偶联的二聚化开关，例如，可以使抗原结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。在一个方面，刺激性分子为与T细胞受体复合体结合的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域进一步包括一种或多种来源于至少一个如下定义的共刺激性分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激性分子选自本文所述共刺激性分子，例如4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一个方面，CAR包括嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于刺激性分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于共刺激性分子的功能性信号传导结构域和来源于刺激性分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个方面中，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于一个或更多个共刺激性分子的两个功能性信号传导。

本文所用的“跨膜结构域”(也称为跨膜区)，指蛋白质序列中跨越细胞膜的区域，可以包括一个或更多个邻接跨膜区域的另外氨基酸，例如一个或更多个与所述跨膜蛋白所源自的蛋白质的胞外区域相关联的氨基酸(例如，胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)和/或与所述跨膜蛋白所源自的蛋白质的胞外区域相关联的一个或更多个另外的氨基酸(例如，胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与嵌合受体的其它结构域中的一个有关的结构域，例如，在一种实施方式中，所述跨膜结构域可以来自信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域所源自的相同蛋白质。在某些情况下，跨膜结构域可以被选择或通过氨基酸取代修饰以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以使与受体复合体的其它成员的相互作用最小化。在一个方面，跨膜结构域能够与表达嵌合受体的细胞的表面上的另一个嵌合受体同型二聚化。跨膜结构域可以来源于天然或重组来源。当所述来源是天然的时，所述结构域可以来源于任何膜结合的蛋白质或跨膜蛋白质。在一个方面，跨膜结构域能够向胞内结构域传导信号，无论何时所述嵌合受体与靶结合。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以包括至少以下的跨膜结构域：例如，T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在某些实施方式中，跨膜结构域可以包括至少下述跨膜区域：例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C。

在某些情况下，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)连接至CAR的胞外区域，例如CAR的抗原结合结构域。任选地，长度在2至10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与细胞质区之间形成键。甘氨酸-丝氨酸二联体提供一种特别合适的接头。

本文所用的“胞内结构域“与“细胞质结构域”(也称为胞内区)具有同等含义,包括胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域负责其中已经引入嵌合受体的免疫细胞的免疫效应功能活化。T细胞的免疫效应功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导免疫效应功能信号且引导细胞执行特定功能的蛋白质的部分。虽然通常可以应用全部胞内信号传导结构域，但是在许多情况下不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分来说，可以使用这样的截短部分代替完整的链，只要其转导免疫效应功能信号。因此，术语胞内信号传导结构域意味着包括足以转导免疫效应功能信号的胞内信号传导结构域的截短部分。

众所周知通过单独的TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要二级和/或共刺激信号。因此，T细胞活化可以被称为是由两个不同种类的细胞质信号传导序列介导的:通过TCR引发抗原依赖性一级活化的那些(一级胞内信号传导结构域)以及以抗原独立方式起作用以提供二级或共刺激信号的那些(二级细胞质结构域，例如共刺激结构域)。

术语“刺激性分子”是指由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的提供细胞质信号传导序列的分子，该信号传导序列以刺激性方式调节用于免疫细胞信号传导途径的至少一些方面的免疫细胞的活化。在一个方面，信号是通过例如TCR/CD3复合体与MHC-抗原肽复合物的结合启动的初级信号，并且其导致介导T细胞应答，包括，但不限于增殖、活化、分化等。CD3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-basedactivation motif,ITAM)。以刺激方式起作用的一级细胞质信号传导序列(也称为“一级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(Immunoreceptortyrosine-based activation motif，ITAM)的信号传导基序。特别地用于本发明的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些：CD3ζ、常见的FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcEpsilon R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。在本发明的任一个CAR中的胞内信号传导结构域包括细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的特异性CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是来自人或非人类种类例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等同残基。

术语“共刺激性分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其特异性地结合共刺激配体，从而介导T细胞的共刺激反应，比如但不限于增殖。共刺激性分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其促进有效的免疫应答。共刺激性分子包括但不限于MHC I类分子，BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这样的共刺激性分子的进一步实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a以及特异性地结合CD83的配体。

共刺激性胞内信号传导结构域可以为共刺激性分子的细胞内部分。共刺激性分子可以以下述蛋白质家族代表：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞性活化分子(SLAM蛋白质)、和NK细胞受体。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、与淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3以及特异性地结合CD83的配体等。

胞内信号传导结构域可以包括分子的全部细胞内部分或全部天然胞内信号传导结构域、或其功能片段或衍生物。

术语“4-1BB”是指具有如GenBank Accession No.AAA62478.2提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank Accession No.AAA62478.2的氨基酸残基214～255，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”为来自人或者来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。

术语“T细胞融合蛋白(T cell fusion protein，TFP)”，包括构成TCR的各种多肽衍生的重组多肽，其能够结合到靶细胞上的表面抗原,和与完整的TCR复合物的其他多肽相互作用，通常定位在T细胞表面。TFP由一个TCR亚基与人或人源化抗体结构域组成的一个抗原结合结构域组成，其中，TCR亚基包括至少部分TCR胞外结构域、跨膜结构域、TCR胞内结构域的胞内信号结构域的刺激结构域；该TCR亚基和该抗体结构域有效连接，其中，TCR亚基的胞外、跨膜、胞内信号结构域来源于CD3ε或CD3γ，并且，该TFP整合进T细胞上表达的TCR。

术语“T细胞抗原耦合器(T cell antigen coupler，TAC)”，包括三个功能结构域：1肿瘤靶向结构域，包括单链抗体、设计的锚蛋白重复蛋白(designed ankyrin repeatprotein，DARPin)或其他靶向基团；2胞外区结构域，与CD3结合的单链抗体，从而使得TAC受体与TCR受体靠近；3跨膜区和CD4共受体的胞内区，其中，胞内区连接蛋白激酶LCK，催化TCR复合物的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAMs)磷酸化作为T细胞活化的初始步骤。

术语“抗体”是指源于特异性地结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以为多克隆的或单克隆的、多链或单链、完整的免疫球蛋白或抗体片段，并且可以来源于天然来源或重组来源。抗体可以为免疫球蛋白分子的四聚体。

术语“抗体片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括，但不限于Fab，Fab'、F(ab')₂、Fv片段、scFv、二硫键-连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体(如sdAb)、camelid VHH结构域、由抗体片段(例如包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体和抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。

术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。

术语“抗体重链”是指以其天然存在的构型存在于抗体分子中且通常决定抗体所属类型的两种多肽链中较大者。

术语“抗体轻链”是指以其天然存在构型存在于抗体分子中的两种多肽链的较小者。κ(k)和λ(l)轻链是指两种主要的抗体轻链的同种型。

术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，比如例如由噬菌体或酵母菌表达系统表达的抗体。该术语也应当解释为指已经通过合成编码抗体的DNA分子(且其中DNA分子表达抗体蛋白质)或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已经使用重组DNA或本领域可获得且熟知的氨基酸序列技术获得。

术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生或有特异性免疫能力的细胞的活化或两者都包括。本领域技术人员应当理解包括实际上所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。当在本文中使用该术语时，本领域技术人员应当理解包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA，能够编码“抗原”。此外，本领域技术人员应当理解抗原无需仅通过基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用超过一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以不同组合排列以编码引发期望免疫应答的多肽。本领域技术人员应当理解抗原根本无需由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生，或者可以来源于生物样品，或者可以是除了多肽之外的大分子。这样的生物样品可以包括，但不限于组织样品、肿瘤样品、具有其它生物组分的细胞或液体。

“肿瘤抗原”指的是过度增生性疾病发生、发展过程中新出现的或过度表达的抗原。在某些方面，本发明的过度增生性病症是指肿瘤。本发明的肿瘤抗原包括但不限于：促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1；神经节苷脂GD3；Tn抗原；CD19；CD20；CD 22；CD 30；CD 70；CD 123；CD 138；CD33；CD44；CD44v7/8；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)，B7H6；KIT(CD117)；白介素13受体亚单位α(IL-13Rα)；白介素11受体α(IL-11Rα)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；癌胚抗原(CEA)；NY-ESO-1；HIV-1Gag；MART-1；gp100；酪氨酸酶；间皮素；EpCAM；蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)；血管内皮生长因子受体，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)，MUC6；表皮生长因子受体家族及其突变体(EGFR，EGFR2，ERBB3，ERBB4，EGFRvIII)；神经细胞粘附分子(NCAM)；碳酸酐酶IX(CAIX)；LMP2；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；TGS5；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体；肿瘤血管内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)；Claudin 6，Claudin18.2、Claudin18.1；ASGPR1；CDH16；5T4；8H9；αvβ6整合素；B细胞成熟抗原(BCMA)；CA9；κ轻链(kappa light chain)；CSPG4；EGP2，EGP40；FAP；FAR；FBP；胚胎型AchR；HLA-A1，HLA-A2；MAGEA1，MAGE3；KDR；MCSP；NKG2D配体；PSC1；ROR1；Sp17；SURVIVIN；TAG72；TEM1；纤连蛋白；腱生蛋白；肿瘤坏死区的癌胚变体；G蛋白偶联受体C类5组-成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；p53突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)；由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OYTES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

病原体抗原选自：病毒、细菌、真菌、原生动物，或寄生虫的抗原；病毒抗原选自：巨细胞病毒抗原、爱泼斯坦-巴尔病毒抗原、人类免疫缺陷病毒抗原,或流感病毒抗原。

术语“肿瘤”指在体外(例如经转化的细胞)或体内的过度增殖性细胞生长的广泛病症类别。可以通过本发明的方法治疗或预防的病况包括例如各种赘生物，包括良性或恶性肿瘤，各种增生等等。包括包括但不限于：乳腺癌，前列腺癌，白血病，淋巴瘤，鼻咽癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺癌，小肠癌，食道癌，黑色素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，子宫癌，卵巢癌，胃癌，睾丸癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，膀胱癌，输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，血管瘤，脊椎肿瘤，神经胶质瘤，星性细胞瘤，垂体腺瘤，所述癌症的组合和所述癌症的转移性病灶。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指外源性核酸通过其转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原发性受试者细胞及其后代。

术语“特异性地结合”是指识别并且结合存在于样品中的结合配偶体(例如肿瘤抗原)蛋白质的抗体或配体，但是该抗体或配体基本上不会识别或结合样品中的其它分子。

术语“难治”指的是一种疾病，例如，肿瘤，其不应答治疗。在实施方案中，难治性肿瘤可以是对治疗开始前或开始时的治疗有抗性。在其他实施方案中，难治性肿瘤可以成为治疗期间抗性的。难治性肿瘤也称为抗性肿瘤。在本发明中，难治性肿瘤包括但不限于放疗不敏感、放疗后复发、化疗不敏感、化疗后复发、对CAR-T治疗不敏感或治疗后复发的肿瘤。难治性或复发性恶性肿瘤可以使用本文中描述的治疗方案。

如本文所用“复发的”是指在一段改进期，例如在先有效抗肿瘤治疗后，患者又再出项该有效治疗给予之前的体征和症状。

术语“个体”和“受试者”在本文中具有同等含义，可以是人和来自其他种属的动物。

术语“增强”指允许受试者或肿瘤细胞改善其响应本文公开的治疗的能力。例如，增强的应答可以包含应答性中5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多的增加。如本文使用的，“增强”还可以指增加响应治疗例如免疫效应细胞疗法的受试者数目。例如，增强的应答可以指响应治疗的受试者总百分比，其中百分比是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％更多。

在一个方面，治疗由临床结果；通过T细胞的抗肿瘤活性增加、增强或延长；与治疗前的数目相比较，抗肿瘤T细胞或活化T细胞数目的增加，促进IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌,或其组合决定。在另一个方面，临床结果是肿瘤消退；肿瘤缩小；肿瘤坏死；通过免疫系统的抗肿瘤应答；肿瘤扩大，复发或扩散或其组合。在一个另外方面，治疗效应通过T细胞的存在、指示T细胞炎症的基因标记的存在，促进IFN-γ分泌,或其组合预测。

如本文公开的免疫效应细胞可以通过各种途径施用于个体，包括例如经口或肠胃外，例如静脉内、肌内、皮下、眶内、囊内、腹膜内、直肠内、脑池内、瘤内、鼻内(intravasally)、皮内或者分别使用例如皮肤贴片或透皮离子电渗疗法通过皮肤的被动或促进吸收。

在实践本发明的方法中待施用的试剂总量可以作为单一剂量以推注或通过在相对短时间段的输注，施用于受试者，或可以使用分级治疗方案进行施用，其中在延长时间段施用多个剂量。本领域技术人员将知道治疗受试者中的病理状况的组合物的量取决于许多因素，包括受试者的年龄和一般健康、以及施用途径和待施用的治疗次数。考虑到这些因素，技术人员将根据需要调整具体剂量。一般而言，最初，使用I期和II期临床试验测定组合物的配制以及施用途径和频率。

范围：在整个公开中，本发明的各个方面都可以以范围形式存在。应当理解，范围形式的描述仅仅为方便和简洁起见，而不应当被看作是对本发明的范围不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为特别地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围的描述比如从1至6就应当被认为具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单独数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个实例，范围比如95-99％的同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的范围，并且包括子范围比如96～99％、96～98％、96～97％、97～99％、97～98％和98～99％的同一性。不考虑范围的宽度，这均适用。

根据本公开内容，本领域技术人员应了解在所公开的具体实施方案中可以作出许多变化或改变，并且仍获得相同或相似结果，而不背离本发明的精神和范围。本发明在范围上并不受限于本文描述的具体实施方案(其仅预期作为本发明的各方面的举例说明)，并且功能等同的方法和组分在本发明的范围内。

GPC3和GPC3阳性肿瘤

本文所用的“GPC3(SEQ ID NO：13)”或“磷脂酰肌醇蛋白聚糖3”是Glypican家族的一员，其在调控细胞生长和分化方面起重要作用。GPC3异常表达与多种肿瘤的发生、发展关系密切，如在肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌、胃癌、结直肠癌、等中呈现异常表达。

在本发明中，免疫效应细胞靶向GPC3阳性表达的肿瘤。在具体的实施方式中，所述肿瘤包括但不限于乳腺癌、神经胶质瘤、肝癌、胃癌、肺癌、食道癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤、食道癌。本领域技术人员知晓，有些肿瘤细胞，例如肝癌细胞对很多药物不敏感，因此，即便在体外有效的药物，有时候在体内的效果也不佳，甚至没有效果。因此，在优选的实施方式中，本文所述的GPC3阳性表达的肿瘤或GPC阳性肿瘤是肝癌、胃癌、肺癌、食道癌。

本发明的嵌合抗原受体多肽可以选自按如下方式顺序连接：

胞外抗原结合区-CD8跨膜区-4-1BB-CD3ζ，

胞外抗原结合区-CD28a-CD28b-CD3ζ，

胞外抗原结合区-CD28a-CD28b-4-1BB-CD3ζ，

及其组合，其中相关嵌合抗原受体蛋白中CD28a代表CD28分子的跨膜区，CD28b代表CD28分子的胞内信号区。

本发明也包括编码所述嵌合抗原受体的核酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。

本发明还提供了包含上述嵌合抗原受体的核酸的载体。本发明还包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其它可用于将外源基因转导入免疫效应细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。

本发明还提供了嵌合抗原修饰的免疫效应细胞，其被转导有编码所述的嵌合抗原受体的核酸或被转导有上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括电穿孔法和转座子法。在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的免疫效应细胞的转导方法是基于病毒如逆转录病毒或慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养免疫效应细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因免疫效应细胞表面，转导的核酸通过转录、翻译表达在其表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒实验证明，本发明的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果(亦称细胞毒性)，且能够在肿瘤组织中有效存活。因此本发明的编码嵌合抗原受体的核酸，包含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上述核酸，质粒或病毒的转基因免疫效应细胞可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。

本发明所述的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞还可以表达除了上述嵌合受体以外的另一种嵌合受体，该受体不含有CD3ζ，但含有CD28的胞内信号结构域、CD137的胞内信号结构域或者这两者的组合。

本发明的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞可以应用于制备药物组合物或诊断试剂。所述的组合物除了包括有效量的所述免疫细胞，还可包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等。

本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式可以采用注射或其它治疗方式。

本发明的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞可有效地增加所述免疫效应细胞在肿瘤内的存活及功能。

本发明的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞不仅在体外对实体瘤细胞有效，与不表达IL-18的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞相比，在体内对实体瘤细胞具备更优异的杀伤效果以及体外扩增性能。

本发明的免疫效应细胞由于可以共同表达嵌合抗原受体和外源性IL-18R结合蛋白，能够实现持续增殖。此外，由于外源性IL-18R结合蛋白与嵌合抗原受体是共表达的，因此可以同时实现在肿瘤局部释放，从而能够有效地针对肿瘤细胞进行作用。

本发明外源性IL-18R结合蛋白是基于NFAT调控的，此时外源性IL-18R结合蛋白只有在抗原刺激下才能分泌，不会导致过度分泌，同时只在肿瘤局部释放，从而能够更为有效地促进免疫效应细胞在肿瘤中的作用。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明的示例性的抗原受体，包括CAR，以及用于工程改造和将受体导入细胞中的方法，参考例如中国专利申请公开号CN107058354A、CN107460201A、CN105194661A、CN105315375A、CN105713881A、CN106146666A、CN106519037A、CN106554414A、CN105331585A、CN106397593A、CN106467573A、CN104140974A、国际专利申请公开号WO2017186121A1、WO2018006882A1、WO2015172339A8、WO2018018958A1中公开的那些。

实施例1.表达嵌合抗原受体的T细胞的构建

1、pRRLSIN-hu9F2-28Z-NFAT6-huIL18、pRRLSIN-hu9F2-BBZ-NFAT6-huIL18、MSCV-hu9F2-m28Z-mNFAT6-mIL18质粒构建

采用本领域常规分子生物学方法，本实施例采用的scFv为靶向GPC3抗体，核酸序列如SEQ ID NO：1所示，所采用的嵌合抗原受体为二代的嵌合抗原受体，具有CD28的跨膜域、CD28的胞内域、及CD3ζ。参照图1A所示的质粒图，构建了质粒pRRLSIN-hu9F2-28Z-NFAT6-huIL18；参照图1B所示的质粒图，构建pRRLSIN-hu9F2-BBZ-NFAT6-huIL18；参照图1C所示的质粒图，构建了质粒MSCV-hu9F2-m28Z-mNFAT6-mIL18。

以pRRLSIN.cPPT.EF-1α(pRRLSIN购自addgene公司，后经上海市肿瘤研究所改造)为载体，构建了表达二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒pRRLSIN-hu9F2-28Z。hu9F2-28Z序列由CD8α信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)、靶向GPC3的scFv(核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示)、CD8 hinge(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)、CD28跨膜区(核苷酸序列如SEQID NO：4所示)和胞内信号传导结构域(核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)以及CD3的胞内段CD3ζ(核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)组成。

在pRRLSIN-hu9F2-28Z质粒的基础上插入了NFAT6-IL18序列，构建了表达靶向GPC3的抗体的二代嵌合抗原受体以及IL-18的慢病毒质粒。NFAT6-IL18序列是由6*NFATbinding motif(核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)、IL2minimal promoter(核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示)、IL-18(核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示)、PA2(核苷酸序列如SEQ IDNO：10所示)组成。

以pRRLSIN.cPPT.EF-1α(pRRLSIN购自addgene公司，后经上海市肿瘤研究所改造)为载体，构建了表达二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒pRRLSIN-hu9F2-BBZ。hu9F2-BBZ序列由CD8α信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)、靶向GPC3的scFv(核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示)、CD8 hinge(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)、CD8跨膜区(核苷酸序列如SEQ IDNO：40所示)和CD137胞内信号传导结构域(核苷酸序列如SEQ ID NO：41所示)以及CD3的胞内段CD3ζ(核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)组成。

在pRRLSIN-hu9F2-BBZ质粒的基础上插入了NFAT6-IL18序列，构建了表达靶向GPC3的抗体的二代嵌合抗原受体以及IL-18的慢病毒质粒。NFAT6-IL18序列是由6*NFATbinding motif(核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)、IL2minimal promoter(核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示)、IL18(核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示)、PA2(核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示)组成。

以MSCV-IRES-GFP(购自addgene公司)为载体，构建了表达二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒MSCV-hu9F2-m28Z。hu9F2-m28Z序列由鼠CD8α信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示)、靶向GPC3的scFv(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)、鼠CD8 hinge及跨膜区(核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示)、鼠CD28胞内信号传导结构域(核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示)以及鼠CD3的胞内段CD3ζ(核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示)组成。

在MSCV-hu9F2-m28Z质粒的基础上插入mNFAT6-mIL18序列，构建了表达靶向GPC3的抗体的二代嵌合抗原受体以及mIL-18的慢病毒质粒。鼠NFAT6-mIL18序列是由鼠6*NFATbinding motif(核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示)、鼠IL2minimal promoter(核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示)、mIL-18(核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示)、PA2(核苷酸序列如SEQID NO：10所示)组成。

2.将pRRLSIN-hu9F2-28Z、pRRLSIN-hu9F2-28Z-NFAT6-huIL18、pRRLSIN-hu9F2-BBZ、pRRLSIN-hu9F2-BBZ-NFAT6-huIL18、MSCV-hu9F2-m28Z和MSCV-hu9F2-m28Z-mNFAT6-mIL18的质粒分别转染293T包装慢病毒和逆转录病毒，得到慢病毒和逆转录病毒。

3.T细胞活化：取人PBMC培养于AIM-V培养基，添加2％人AB型血清，500U/mL重组人IL-2，并加入CD3/CD28抗体结合磁珠活化48h。将所得的pRRLSIN-hu9F2-28Z、pRRLSIN-hu9F2-28Z-NFAT6-huIL18、pRRLSIN-hu9F2-BBZ、pRRLSIN-hu9F2-BBZ-NFAT6-huIL18的慢病毒分别感染活化的T细胞，得到9F2-28Z CART细胞、9F2-28Z-NFAT-IL18 CART细胞(或称为9F2-28Z-IL18 CART)、9F2-BBZ CART细胞、9F2-BBZ-NFAT-IL18 CART细胞。

取C57BL/6小鼠的脾脏T淋巴细胞，将纯化的小鼠CD3+T淋巴细胞按1：1的体积比加入Dynabeads Mouse T-activator CD3/CD28，PBS清洗一次，活化，放培养箱培养，培养基为RPMI 1640完全培养基，添加10％FBS血清、50μM的二巯基乙醇以及100U/mL重组IL2。将活化24h的小鼠脾脏T淋巴细胞接种于重组人纤维蛋白片段包被的12孔板中，分别加入MSCV-hu9F2-m28Z逆转录病毒、MSCV-hu9F2-m28Z-mNFAT6-mIL18逆转录病毒感染12小时，随后培养扩增至需要的数量，得到小鼠的9F2-m28Z CART细胞、9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CART(m28Z-mN6-mIL18 CART)细胞。

实施例2.体外CAR-T细胞表型检测

根据细胞表型表达的不同，可以将记忆性T细胞分为两种类型：中枢性记忆性T细胞(Tcm)和效应性记忆性T细胞(Tem)。中枢性记忆性T细胞与初始T细胞有类似的地方，高表达淋巴归巢分子L-选择素(CD62L)和透明质烷受体CD44。抗体情况CD8:percp标记；CD44:BV510标记；CD62L:APC标记；Tcm：CD44⁺CD62L⁺。

提前一天利用GPC3-protein包板24孔板(10ug/ml)，Untransduced(UTD)T细胞、9F2-m28Z CART细胞、9F2-m28Z-NFAT-mIL18 CAR-T(或称为m28Z-N6-mIL18)细胞分别计数，按照2.5*10^5/250ul铺板，24h取各孔细胞进行流式检测。

流式结果如图2所示，从图2A中可以看出，除了UTD组，其他CAR-T组在GPC3抗原刺激后，CD8⁺T细胞比例都升高，但各组之间没有明显差异。

从图2B中看出，在GPC3抗原刺激之后，相较于无抗原刺激，不同CAR-T细胞CD8阳性的细胞中表达CD62L和CD44的Tcm的比例都没有明显差别，这说明NFAT调控表达IL18之后CAR-T细胞的记忆性表型相对于普通二代CAR-T没有明显变化。

实施例3.体外杀伤毒性检测

3.1 9F2-28Z-NFAT-IL18 CART细胞对Huh7、PLC/PRF/5体外杀伤毒性实验

采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。具体方法参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。

效应细胞：按效靶比3:1、1:1或1:3分别接种Untransduced(UTD)T细胞、9F2-28ZCART细胞、9F2-28Z-NFAT-IL18 CART细胞于96孔板。

靶细胞：分别接种50μL 2×10⁵/mL的Huh7与PLC/PRF/5细胞(GPC3表达阳性)、SK-HEP-1细胞(GPC3表达阴性)到相应的96孔板。

每组均设置5个复孔。将培养板置于细胞培养箱中孵育18h。

其中各实验组及各对照组设置如下：实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的T淋巴细胞；对照组1：靶细胞最大释放LDH；对照组2：靶细胞自发释放LDH；对照组3：效应细胞自发释放LDH。计算公式为：％细胞毒性＝[(实验组-效应细胞自发组-靶细胞自发组)/(靶细胞最大-靶细胞自发)]*100。实验结果如图3A-3C所示。

上述CAR-T与对照组UTD相比，对GPC3表达阳性的Huh7与PLC/PRF/5细胞在效靶比为3:1和1:1都有显著的毒性杀伤作用，在效靶比为1:3时，基本都没有杀伤。对GPC3表达阴性的SK-HEP-1细胞也几乎未有杀伤作用。

3.2 9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CAR-T细胞对Hepa1-6-GPC3体外杀伤毒性实验

具体方法参照3.1

效应细胞：按效靶比3:1、1:1或1:3分别接种Untransduced(UTD)T细胞、9F2-m28ZCART细胞、9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CAR-T(或称为m28Z-mN6-mIL18)细胞于96孔板。

靶细胞：分别接种50μL 2×10⁵/mL的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6-GPC3(GPC3表达阳性)与Hepa1-6(GPC3表达阴性)细胞到相应的96孔板。

实验结果如图3D所示，与对照组UTD相比，9F2-m28Z CART细胞、9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CAR-T细胞对GPC3表达阳性的Hepa1-6-GPC3在效靶比为3:1和1:1都有显著的毒性杀伤作用。对GPC3表达阴性的Hepa1-6细胞也几乎未有杀伤作用。

实施例4.皮下移植瘤的抗肿瘤治疗实验

1.PLC/PRF/5皮下移植瘤模型

1)实验分组：B-NDG(百奥赛图)小鼠6-8周龄随机分为5组，每组5只，分别为Untransduced(UTD)、9F2-28Z CART细胞对照组、9F2-28Z-NFAT-IL18 CART细胞治疗组。

2)皮下移植瘤的接种：胰酶消化法收集处于对数生长期且生长状态良好的PLC/PRF/5细胞，用生理盐水洗涤1次后，调整细胞密度为1.5×10⁷/mL，用注射器在B-NDG小鼠右侧腹部皮下部位注射200μL细胞悬液，即每只小鼠接种3×106的肿瘤细胞，接种日记为第0天。

注射CAR T：皮下接种肿瘤细胞后D11天，肿瘤平均体积约158mm³。注射CAR T细胞，注射剂量：2.5×106/只。

3)CAR-T细胞回输：当肿瘤平均体积约为158mm³时，即接种肿瘤后第11天，注射2.5×10⁶/只CAR-T细胞或未经转导的T细胞对照。实验结果如图4(A)～(C)所示，CAR T注射后27天(D38)，将小鼠实施安乐死，剥取肿瘤称重，与UTD对照组相比，各组均见明显抑瘤效果，抑制率分别为：9F2-28Z组：74.63％(P<0.001)，9F2-28Z-NFAT-IL18组：100％(P<0.001)(5只小鼠肿瘤全部消退)，hu9F2-28Z-NFAT-IL18组与hu9F2-28Z组相比抑瘤效果具有显著统计学差异(P<0.001)。小鼠体重与UTD组相比无显著差异。说明IL18能提高CAR T细胞抗肿瘤作用，且显著优于CART细胞单独抗肿瘤作用。

参照上述的操作，再次制作PLC/PRF/5大负荷皮下移植瘤模型，分别接种3×10⁶的PLC/PRF/5细胞于NPG小鼠右侧腋部皮下，皮下接种肿瘤细胞后D14天，肿瘤平均体积约260mm³，开始注射CAR T细胞(UTD细胞，9F2-28Z T细胞、9F2-28Z-NFAT-IL18T细胞)，注射剂量：2.0×10⁶/只，观察在肿瘤体积较大，给药剂量较低情况下的抗肿瘤情况。结果如图5(A)～(C)所示，CAR T注射后18天(D32)，将小鼠实施安乐死，剥取肿瘤称重，与UTD对照组相比，抑瘤率分别为：hu9F2-28Z：40.50％(P<0.001)，hu9F2-28Z-NFAT-IL18：75.26％(P<0.001)。9F2-28Z-NFAT-IL18组与9F2-28Z组相比抑瘤效果具有显著统计学差异(P<0.001)，该实验表明，在荷肝癌细胞PLC/PRF/5皮下移植瘤肿瘤模型中，9F2-28Z-NFAT-IL18组与9F2-28Z组相比，具有更优的肿瘤抑制效果。小鼠体重与UTD组相比无显著差异。说明在肿瘤负荷较大时，IL18也能提高CAR T细胞抗肿瘤作用，且显著优于CART细胞单独抗肿瘤作用。

2.Hepa1-6-GPC3皮下移植瘤模型

1)实验分组：C57BL/6小鼠6-8周龄随机分组，每组5-6只、分别为Untransduced(UTD)T细胞、9F2-m28Z CART细胞、9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CAR-T(或称为m28Z-mN6-mIL18)细胞治疗组。

2)皮下移植瘤的接种：胰酶消化法收集处于对数生长期且生长状态良好的Hepa1-6-GPC3细胞，用PBS洗涤1次后，调整细胞密度为5×10⁷/mL，用注射器在C57BL/6小鼠右侧腋部皮下部位注射200μL细胞悬液，即每只小鼠接种1×10⁷的肿瘤细胞，接种日记为第0天。

3)CAR-T细胞回输：皮下接种肿瘤细胞后D7天，肿瘤平均体积约300mm³。注射CAR T细胞，注射剂量：2×10⁶/只。

结果图6(A)～(C)所示，CAR-T注射后17天(D24)，将小鼠实施安乐死，剥取肿瘤称重，与UTD对照组相比，各组均见明显抑瘤效果，抑制率分别为：9F2-m28Z CART组：87.7％(P<0.001)，9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CAR-T组：93.8％(P<0.001)，小鼠体重无明显变化。表明在免疫完善小鼠体内9F2-m28Z CART和9F2-m28Z-NFAT-mIL18 CAR-T组都有明显抑制肿瘤生长的作用。

实施例5、细胞因子分泌情况

5.1 9F2-28Z-NFAT-IL18 CAR-T细胞

将UTD细胞、9F2-28Z T细胞、9F2-28Z-NFAT-IL18T细胞与肝癌细胞系Huh-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1细胞1:1共孵24h后收集上清，采用CBA方法流式检测上清中IL2、TNF-α、IFN-gamma(也称为IFN-γ)的分泌水平。结果如图7(A)～(C)所示，在分别与GPC3阳性细胞Huh-7、PLC/PRF/5共孵中，9F2-28Z-NFAT-IL18 CAR T细胞组、9F2-28Z CAR T细胞组中均能检测到IL-2，TNF-α，IFN-γ，且高于UTD组；其中，9F2-28Z-NFAT-IL18 CAR T细胞组上清液中的IL-2，TNF-α，IFN-γ检出量高于9F2-28Z CAR T细胞组。分别与GPC3阴性细胞SK-HEP-1细胞共孵，9F2-28Z-NFAT-IL18 CAR T细胞组、9F2-28Z CAR T细胞组上清液几乎检测不到IL-2，TNF-α，IFN-γ。该实验表明在GPC3抗原刺激后9F2-28Z-NFAT-IL18的CAR T细胞分泌细胞因子的能力优于9F2-28Z CAR T细胞。

5.2 9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CAR-T细胞

将UTD细胞、9F2-m28Z CART细胞、9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CAR-T(或称为m28Z-mN6-mIL18)细胞与肝癌细胞系Hepa1-6、Hepa1-6-GPC3细胞按照效靶比1:1共孵24h后收上清后采用CBA方法流式检测上清中细胞因子IL-2，TNF-α，IFN-γ的分泌水平。结果如图8所示，在分别与GPC3阳性细胞Hepa1-6-GPC3共孵中，9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CAR T细胞组、9F2-m28Z CAR T细胞组中均能检测到较高水平IL-2，TNF-α，IFN-γ；其中，9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CAR T细胞组上清液中的IL-2，TNF-α检出量高于9F2-m28Z CAR T细胞组。分别与GPC3阴性细胞Hepa1-6细胞共孵，9F2-m28Z-mNFAT-mIL18 CAR T细胞组、9F2-m28Z CART细胞组上清液几乎检测不到IL-2，TNF-α，IFN-γ。

本专利所用的序列如下：

本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 科济生物医药（上海）有限公司

上海市肿瘤研究所

<120> 表达IL-18R结合蛋白的免疫效应细胞

<130> PC00543

<141> 2019-05-08

<150> CN201810436773.2

<151> 2018-05-09

<150> CN201811062215.0

<151> 2018-09-12

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcagc gactacgaga tgcactgggt gcggcaggcc 120

cccggccagg gcctggagtg gatgggcgcc atccaccccg gcagcggcga caccgcctac 180

aaccagcggt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240

atggagctga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggttctac 300

agctacgcct actggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcgccggtgg aggcggttca 360

ggcggaggtg gttctggcgg tggcggatcg gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc 420

ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc atcagctgcc ggagcagcca gagcctggtg 480

cacagcaacg gcaacaccta cctgcagtgg tacctgcaga agcccggcca gagcccccag 540

ctgctgatct acaaggtgag caaccggttc agcggcgtgc ccgaccggtt cagcggcagc 600

ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc agccgggtgg aggccgagga cgtgggcgtg 660

tactactgca gccagagcat ctacgtgccc tacaccttcg gccagggcac caagctggag 720

atcaaacgt 729

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 3

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 4

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 5

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggccaaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 6

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339

<210> 7

<211> 194

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt caattgtcct cgacggagga aaaactgttt 120

catacagaag gcgtggagga aaaactgttt catacagaag gcgtggagga aaaactgttt 180

catacagaag gcgt 194

<210> 8

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acattttgac acccccataa tatttttcca gaattaacag tataaattgc atctcttgtt 60

caagagttcc ctatcactct ctttaatcac tactcacagt aacctcaact cctg 114

<210> 9

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggctgctg aaccagtaga agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac 60

aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacctgg aatcagatta ctttggcaag 120

cttgaatcta aattatcagt cataagaaat ttgaatgacc aagttctctt cattgaccaa 180

ggaaatcggc ctctatttga agatatgact gattctgact gtagagataa tgcaccccgg 240

accatattta ttataagtat gtataaagat agccagccta gaggtatggc tgtaactatc 300

tctgtgaagt gtgagaaaat ttcaactctc tcctgtgaga acaaaattat ttcctttaag 360

gaaatgaatc ctcctgataa catcaaggat acaaaaagtg acatcatatt ctttcagaga 420

agtgtcccag gacatgataa taagatgcaa tttgaatctt catcatacga aggatacttt 480

ctagcttgtg aaaaagagag agaccttttt aaactcattt tgaaaaaaga ggatgaattg 540

ggggatagat ctataatgtt cactgttcaa aacgaagac 579

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga g 51

<210> 11

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met

1 5 10 15

Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn

20 25 30

Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile

35 40 45

Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro

50 55 60

Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg

65 70 75 80

Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met

85 90 95

Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys

100 105 110

Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile

115 120 125

Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly

130 135 140

His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe

145 150 155 160

Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys

165 170 175

Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu

180 185 190

Asp

<210> 12

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

130 135 140

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Arg

<210> 13

<211> 580

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp

20 25 30

Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly

35 40 45

Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val

50 55 60

Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys

65 70 75 80

Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala

85 90 95

Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln

100 105 110

Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala

115 120 125

Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe

130 135 140

Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro

165 170 175

Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu

180 185 190

Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe

195 200 205

Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln

210 215 220

Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile

225 230 235 240

Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu

245 250 255

Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys

260 265 270

Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly

275 280 285

Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu

290 295 300

Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu

305 310 315 320

Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys

325 330 335

Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser

340 345 350

Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile

355 360 365

Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu

370 375 380

Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser

385 390 395 400

Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala

405 410 415

Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr

420 425 430

Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His

435 440 445

Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp

450 455 460

Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys

465 470 475 480

Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly

485 490 495

Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly

500 505 510

Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr

515 520 525

Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro

530 535 540

Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser

545 550 555 560

Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe

565 570 575

Phe Leu Val His

580

<210> 14

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 15

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 16

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 17

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcagc gactacgaga tgcactgggt gcggcaggcc 120

cccggccagg gcctggagtg gatgggcgcc atccaccccg gcagcggcga caccgcctac 180

aaccagcggt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240

atggagctga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggttctac 300

agctacgcct actggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcgccggtgg aggcggttca 360

ggcggaggtg gttctggcgg tggcggatcg gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc 420

ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc atcagctgcc ggagcagcca gagcctggtg 480

cacagcaacg gcaacaccta cctgcagtgg tacctgcaga agcccggcca gagcccccag 540

ctgctgatct acaaggtgag caaccggttc agcggcgtgc ccgaccggtt cagcggcagc 600

ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc agccgggtgg aggccgagga cgtgggcgtg 660

tactactgca gccagagcat ctacgtgccc tacaccttcg gccagggcac caagctggag 720

atcaaacgta ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840

agggggctgg acttcgcctg tgatttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 900

tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 960

aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc aacccgcaag 1020

cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc 1080

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1140

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1200

atggggggaa agccgcagag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1260

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1320

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1380

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1407

<210> 18

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

130 135 140

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

245 250 255

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

260 265 270

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

275 280 285

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

290 295 300

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

305 310 315 320

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

325 330 335

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

340 345 350

Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

355 360 365

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

370 375 380

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

385 390 395 400

Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

405 410 415

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

420 425 430

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

435 440 445

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

450 455 460

Ala Leu Pro Pro Arg

465

<210> 19

<211> 467

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

130 135 140

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

245 250 255

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

260 265 270

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

275 280 285

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

290 295 300

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

305 310 315 320

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

325 330 335

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

340 345 350

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

355 360 365

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

370 375 380

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

385 390 395 400

Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

405 410 415

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

420 425 430

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

435 440 445

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

450 455 460

Pro Pro Arg

465

<210> 20

<211> 511

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

130 135 140

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

245 250 255

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

260 265 270

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

275 280 285

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

290 295 300

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

305 310 315 320

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

325 330 335

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

340 345 350

Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

355 360 365

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

370 375 380

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

385 390 395 400

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

405 410 415

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

420 425 430

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln

435 440 445

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

450 455 460

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

465 470 475 480

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

485 490 495

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

500 505 510

<210> 21

<211> 356

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

130 135 140

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

245 250 255

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

260 265 270

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

275 280 285

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

290 295 300

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

305 310 315 320

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

325 330 335

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

340 345 350

Leu Pro Pro Arg

355

<210> 22

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

atggcctcac cgttgacccg ctttctgtcg ctgaacctgc tgctgctggg tgagtcgatt 60

atcctgggga gtggagaagc t 81

<210> 23

<211> 216

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

actactacca agccagtgct gcgaactccc tcacctgtgc accctaccgg gacatctcag 60

ccccagagac cagaagattg tcggccccgt ggctcagtga aggggaccgg attggacttc 120

gcctgtgata tttacatctg ggcacccttg gccggaatct gcgtggccct tctgctgtcc 180

ttgatcatca ctctcatctg ctaccacagg agccga 216

<210> 24

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aatagtagaa ggaacagact ccttcaaagt gactacatga acatgactcc ccggaggcct 60

gggctcactc gaaagcctta ccagccctac gcccctgcca gagactttgc agcgtaccgc 120

ccc 123

<210> 25

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

agcaggagtg cagagactgc tgccaacctg caggacccca accagctcta caatgagctc 60

aatctagggc gaagagagga atatgacgtc ttggagaaga agcgggctcg ggatccagag 120

atgggaggca aacagcagag gaggaggaac ccccaggaag gcgtatacaa tgcactgcag 180

aaagacaaga tggcagaagc ctacagtgag atcggcacaa aaggcgagag gcggagaggc 240

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agcactgcca ccaaggacac ctatgatgcc 300

ctgcatatgc agaccctggc c 321

<210> 26

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aagaggaaaa tttgtttcat acagaaggcg ttaagaggaa aatttgtttc atacagaagg 60

cgttaagagg aaaatttgtt tcatacagaa ggcgttaaga ggaaaatttg tttcatacag 120

aaggcgttaa gaggaaaatt tgtttcatac agaaggcgtt aagaggaaaa tttgtttcat 180

acagaaggcg tt 192

<210> 27

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

aacatcgtga cacccccata ttatttttcc agcattaaca gtataaattg cctcccatgc 60

tgaagagctg cctatcaccc ttgctaatca ctcctcacag tgacctcaag tcct 114

<210> 28

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

atggctgcca tgtcagaaga ctcttgcgtc aacttcaagg aaatgatgtt tattgacaac 60

acgctttact ttatacctga agaaaatgga gacctggaat cagacaactt tggccgactt 120

cactgtacaa ccgcagtaat acggaatata aatgaccaag ttctcttcgt tgacaaaaga 180

cagcctgtgt tcgaggatat gactgatatt gatcaaagtg ccagtgaacc ccagaccaga 240

ctgataatat acatgtacaa agacagtgaa gtaagaggac tggctgtgac cctctctgtg 300

aaggatagta aaatgtctac cctctcctgt aagaacaaga tcatttcctt tgaggaaatg 360

gatccacctg aaaatattga tgatatacaa agtgatctca tattctttca gaaacgtgtt 420

ccaggacaca acaagatgga gtttgaatct tcactgtatg aaggacactt tcttgcttgc 480

caaaaggaag atgatgcttt caaactcatt ctgaaaaaaa aggatgaaaa tggggataaa 540

tctgtaatgt tcactctcac taacttacat caaagttag 579

<210> 29

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 29

Met Ala Ala Met Ser Glu Asp Ser Cys Val Asn Phe Lys Glu Met Met

1 5 10 15

Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Pro Glu Glu Asn Gly Asp Leu

20 25 30

Glu Ser Asp Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg

35 40 45

Asn Ile Asn Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe

50 55 60

Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg

65 70 75 80

Leu Ile Ile Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val

85 90 95

Thr Leu Ser Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn

100 105 110

Lys Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp

115 120 125

Ile Gln Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn

130 135 140

Lys Met Glu Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys

145 150 155 160

Gln Lys Glu Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu

165 170 175

Asn Gly Asp Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser

180 185 190

<210> 30

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 30

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr

20

<210> 31

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 31

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Ile Ile Thr Leu Ile

20

<210> 32

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 32

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 33

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 33

Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

35 40

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 34

Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu

1 5 10 15

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu

20 25 30

Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg

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Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met

50 55 60

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

65 70 75 80

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

85 90 95

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<210> 35

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctg aagttggcag gagacgttga gtccaaccct 60

gggccc 66

<210> 36

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ggaagcggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60

cct 63

<210> 37

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60

cctggacct 69

<210> 38

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

130 135 140

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Arg Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val

245 250 255

His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro

260 265 270

Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

275 280 285

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu

290 295 300

Ile Ile Thr Leu Ile Cys Tyr His Arg Ser Arg Asn Ser Arg Arg Asn

305 310 315 320

Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

325 330 335

Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala

340 345 350

Ala Tyr Arg Pro Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp

355 360 365

Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

370 375 380

Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

385 390 395 400

Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln

405 410 415

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu

420 425 430

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

435 440 445

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala

450 455 460

<210> 39

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcagc gactacgaga tgcactgggt gcggcaggcc 120

cccggccagg gcctggagtg gatgggcgcc atccaccccg gcagcggcga caccgcctac 180

aaccagcggt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240

atggagctga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggttctac 300

agctacgcct actggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcgccggtgg aggcggttca 360

ggcggaggtg gttctggcgg tggcggatcg gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc 420

ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc atcagctgcc ggagcagcca gagcctggtg 480

cacagcaacg gcaacaccta cctgcagtgg tacctgcaga agcccggcca gagcccccag 540

ctgctgatct acaaggtgag caaccggttc agcggcgtgc ccgaccggtt cagcggcagc 600

ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc agccgggtgg aggccgagga cgtgggcgtg 660

tactactgca gccagagcat ctacgtgccc tacaccttcg gccagggcac caagctggag 720

atcaaacgta ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 900

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 960

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1020

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1080

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1140

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1200

ggaaagccgc agagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1260

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1320

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1380

atgcaggccc tgccccctcg c 1401

<210> 40

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

acc 63

<210> 41

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 42

<211> 72

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 42

Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro Thr

1 5 10 15

Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser

20 25 30

Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala

35 40 45

Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr

50 55 60

Leu Ile Cys Tyr His Arg Ser Arg

65 70

Claims (10)

1.一种细胞，其特征在于，所述细胞表达特异性结合靶抗原的外源性受体和外源性IL-18R结合蛋白，所述外源性IL-18R结合蛋白能特异性结合IL-18R且增强IL-18R活性，所述靶抗原包括肿瘤抗原或病原体抗原。

2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述IL-18R结合蛋白选自IL-18或IL-18R的抗体。

3.如权利要求2所述的细胞，其特征在于，所述IL-18R结合蛋白是IL-18，优选为hIL-18或mIL-18。

4.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述的IL-18具有SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:29所示的至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，在所述细胞中，所述的外源性IL-18R结合蛋白是组成性表达或诱导性表达。

6.如权利要求1-5任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞为免疫效应细胞；优选地，所述免疫细胞选自：T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞或骨髓源性吞噬细胞或它们的组合。

7.如权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞为T细胞。

8.如权利要求1-7任一所述的细胞，其特征在于，所述外源性IL-18R结合蛋白的启动子活性受TCR信号活化调控。

9.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，

所述启动子包含与依赖TCR信号活化的转录因子的结合基序可操作相连的最小启动子；

优选地，所述结合基序具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：26所示的至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核苷酸序列，

进一步优选，所述最小启动子具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：27所示的至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核苷酸序列。

10.如权利要求1-9任一所述的细胞，其特征在于，所述靶抗原为肿瘤抗原，

优选地，所述肿瘤抗原为实体瘤相关抗原，

进一步优选所述抗原选自GPC3、claudin6、间皮素、EGFR、EGFRvIII或claudin18.2中的任意；

更优选地，所述实体瘤相关抗原为GPC3。