CN109503715A - Il-4r的融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供表达一种融合蛋白的免疫效应细胞，所述融合蛋白包含细胞因子结合胞外结构域和信号转导胞内结构域，其中所述胞外结构域为IL4受体胞外结构域，所述胞内结构域为IL‑21受体胞内结构域。所述免疫效应细胞在实体瘤的肿瘤微环境中具备显著的抗肿瘤能力，从而不仅在体外对实体瘤细胞有效，在体内对实体瘤细胞也具备优异的杀伤效果。本发明还提供包含所述免疫效应细胞的药物组合物以及它们的应用。

Description

IL-4R的融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于过继性细胞治疗领域；具体地说，本发明涉及一种改进的免疫细胞，改进的免疫细胞可以显著增强免疫细胞的抗肿瘤能力。

背景技术

实体瘤中的癌细胞能够在其周围形成肿瘤微环境以支持癌细胞的生长和转移。肿瘤微环境是肿瘤存在的细胞环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、其他细胞、可溶性因子、信号传导分子、细胞外基质和可促进肿瘤转化、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤免受宿主免疫、培养治疗抗性并为休眠转移茁壮成长提供微环境的机械因子(mechanicalcue)。肿瘤及其周围的微环境密切相关，不断交互，肿瘤可以通过释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成和诱导外周免疫耐受来影响它们的微环境。参见warts等人“TumorMicroenvironment Complexity:Emerging Roles in Cancer Therapy,”Cancer Res,72卷,第2473-2480页,2012。因此实体瘤的治疗通常难以奏效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种融合蛋白，这种融合蛋白能够使得表达它的免疫效应细胞在实体瘤的肿瘤微环境中具备显著的抗肿瘤能力；本发明还提供表达所述融合蛋白的免疫效应细胞、包含所述免疫效应细胞的药物组合物以及它们在诱导细胞死亡、或者治疗癌症、或者治疗过度增生性或者分化性紊乱中的应用。

在第一方面，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含IL-4受体(IL-4R)胞外域或其变体和IL-21受体(IL-21R)胞内域或其变体。

在具体的实施方式中，所述融合蛋白包含：

i)IL-4受体(IL-4R)胞外域；

ii)跨膜域，优选IL-4R的跨膜区或者IL-21R的跨膜区；和

iii)IL-21受体(IL-21R)胞内域。

在具体的实施方式中，所述IL-4R的胞外域的编码核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。

在具体的实施方式中，所述IL-4R的胞外域的编码核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的序列。

在具体的实施方式中，所述IL-21R的胞内域的编码核苷酸序列与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。

在具体的实施方式中，所述IL-21R的胞内域的编码核苷酸序列是SEQ ID NO:4所示的序列。

在具体的实施方式中，所述融合蛋白与SEQ ID NO.6所示的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。

在具体的实施方式中，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.6所示的序列。

在具体的实施方式中，所述IL-4R选自IL-4Rα、IL-4Rγc。

在具体的实施方式中，所述IL-4R可以结合IL-4或者突变型IL-4或者IL-13或者突变型IL-13；优选地，所述IL-4R可以结合IL-4或者突变型IL-4。

在具体的实施方式中，所述突变型IL-4包含KFR变体、KF变体、或RGA变体。

在具体的实施方式中，各结构域直接或通过接头分子连接在一起。

在第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的融合蛋白。

在第三方面，本发明提供一种载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。

在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第三方面所述的载体。

在第五方面，本发明提供一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞表达本发明第一方面所述的融合蛋白。

在优选的实施方式中，所述的免疫效应细胞为T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞或骨髓源性吞噬细胞或其组合；更优选地，所述的免疫效应细胞为T细胞、自然杀伤(NK)细胞、或自然杀伤T(NKT)细胞；更优选地，所述的免疫效应细胞为T细胞。

在具体的实施方式中，所述的免疫效应细胞为自体细胞，如自体T细胞、自体NK细胞。

在一优选例中，所述的免疫效应细胞为自体T细胞。

在具体的实施方式中，所述的免疫效应细胞为同种异体细胞，如同种异体的T细胞、同种异体的NK细胞、或者NK细胞系(如NK-92细胞)。

在具体的实施方式中，所述免疫效应细胞还表达外源性的受体，该外源性的受体具有特异结合肿瘤抗原的第二胞外结合域、第二跨膜域、及第二胞内域。

在一具体实施方案中，所述免疫效应细胞还表达外源性的受体，该外源性的受体具有特异结合肿瘤抗原的第二胞外结合域、第二跨膜域、及第二胞内域；优选地，所述的肿瘤抗原与IL-4受体的结合抗原不同。

在具体的实施方式中，所述外源性受体选自：嵌合抗原受体(CAR)、修饰的T细胞(抗原)受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)或其组合。

在具体的实施方式中，所述外源性受体为嵌合抗原受体。

在具体的实施方式中，所述的融合蛋白为组成性表达。

在具体的实施方式中，所述的融合蛋白为诱导性表达。

在具体的实施方式中，所述外源性受体为嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体的第二胞外结合域、第二跨膜域、及第二胞内域分别具有以下特点：

(i)所述第二胞外结合域包含：抗体，抗体片段，scFv，Fv，Fab，(Fab')2，单结构域抗体(SDAB)，VH或VL结构域，或骆驼科VHH结构域，或相应抗原的天然配体，或其组合；和/或

(ii)所述第二跨膜结构域包含选自下组的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和NKG2C；和/或

(iii)所述的第二胞内域包括：一级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域，其中：(1)所述一级信号传导结构域包含选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常见FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、和DAP12的蛋白质的功能信号传导结构域，或其组合；和/或(2)所述共刺激信号传导结构域包含选自如下的蛋白质的功能信号传导结构域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D，或其组合。

在具体的实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括：

(i)特异性结合抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜域、CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ；或

(ii)特异性结合抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ；或

(iii)特异性结合抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜域、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ。

在具体的实施方式中，所述的肿瘤抗原包括：

促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1；神经节苷脂GD3；Tn抗原；CD19；CD20；CD 22；CD 30；CD 70；CD 123；CD 138；CD33；CD44；CD44v7/8；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)，B7H6；KIT(CD117)；白介素13受体亚单位α(IL-13Rα)；白介素11受体α(IL-11Rα)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；癌胚抗原(CEA)；NY-ESO-1；HIV-1Gag；MART-1；gp100；酪氨酸酶；间皮素；EpCAM；蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)；血管内皮生长因子受体；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)，MUC6；表皮生长因子受体家族及其突变体(EGFR，EGFR2，ERBB3，ERBB4，EGFRvIII)；神经细胞粘附分子(NCAM)；碳酸酐酶IX(CAIX)；LMP2；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer；TGS5；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体；肿瘤血管内皮标记25 1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)；Claudin 6，Claudin18.2、Claudin18.1；ASGPR1；CDH16；5T4；8H9；αvβ6整合素；B细胞成熟抗原(BCMA)；CA9；κ轻链(kappa lightchain)；CSPG4；EGP2，EGP40；FAP；FAR；FBP；胚胎型AchR；HLA-A1，HLA-A2；MAGEA1，MAGE3；KDR；MCSP；NKG2D配体；PSC1；ROR1；Sp17；SURVIVIN；TAG72；TEM1；纤连蛋白；腱生蛋白；肿瘤坏死区的癌胚变体；G蛋白偶联受体C类5组-成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受5体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；p53突变10体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)；由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OYTES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

在具体的实施方式中，所述的肿瘤抗原为实体瘤抗原；

在具体的实施方式中，所述实体瘤抗原选自前列腺特异性膜抗原、癌胚抗原、IL13Ralpha，HER-2，间皮素，EGFR、EGFRvIII，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、EphA2，HER3，EpCAM，MUC16，MUC1，claudin 18.2，叶酸受体，claudin 6、CD138、MAGE3、ASGPR1或CDH16，更优选的，所述实体瘤抗原为GPC3。

在具体的实施方式中，所述实体瘤选自结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，肿瘤血管发生，脊椎肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌；优选地，所述实体瘤选自肝癌，肺癌，鳞状细胞癌。

在具体的实施方式中，所述第二胞外结合域具有与SEQ ID NO:7、20、21、22、或23所示序列至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列。

在具体的实施方式中，所述的免疫效应细胞的第二胞外结合域具有与SEQ ID NO:7所示序列至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列。

在具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体的第二跨膜域的编码核苷酸序列与SEQID NO:29或30所示核苷酸序列编码的序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性。

在具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体的第二胞内域的编码核苷酸序列含有SEQ ID NO:31和33所示核苷酸序列，或含有与SEQ ID NO:31和33所示核苷酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列。

在具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体的第二胞内域的编码核苷酸序列含有SEQ ID NO:32和33所示核苷酸序列，或者含有与SEQ ID NO:32和33所示核苷酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列。

在具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体的第二胞内域的编码核苷酸序列含有SEQ ID NO:31、32和33所示核苷酸序列，或者含有与SEQ ID NO:31、32和33所示核苷酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列。

在具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体的第二胞内域的编码核苷酸序列含有SEQ ID NO:33所示核苷酸序列，或者含有与SEQ ID NO:33所示核苷酸序列具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列。

在具体的实施方式中，所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:9、10、11、12所示序列或与SEQ ID NO:9、10、11、12所示序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

在具体的实施方式中，所述的嵌合抗原受体及所述的融合蛋白由SEQ ID NO：16、17、18、或19所示核苷酸序列编码或由与SEQ ID NO：16、17、18、或19具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列编码。

在具体的实施方式中，所述的抗原为肿瘤抗原或病原微生物抗原。

在具体的实施方式中，所述病原微生物包括病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫；更佳地，所述病原微生物为病毒；或者更佳地，所述病原体微生物选自巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人类免疫缺陷病毒及流感病毒。

在第六方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、或者本发明第五方面所述的免疫效应细胞。

在第七方面，本发明提供一种诱导细胞死亡的方法，所述方法包括向需要的受试者施用：本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第五方面所述的免疫效应细胞或者本发明第六方面所述的药物组合物。

在第八方面，本发明提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向需要的受试者施用：本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第五方面所述的免疫效应细胞或者本发明第六方面所述的药物组合物。

在第九方面，本发明提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括使在有此需要的受试者的肿瘤微环境中表达IL-4的恶性细胞与本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第五方面所述的免疫效应细胞或者本发明第六方面所述的药物组合物接触。

在具体的实施方式中，所述恶性细胞在所述受试者开始治疗之前接触。

在具体的实施方式中，所述恶性细胞是恶性肿瘤细胞。

在第十方面，本发明提供一种治疗过度增生性或者分化性紊乱的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用：本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、或者本发明第五方面所述的免疫效应细胞。

在具体的实施方式中，所述过度增生性或者分化性紊乱是纤维化症或增生症、炎性疾病或自身免疫疾病。

在第十一方面，本发明提供本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第五方面所述的免疫效应细胞或者本发明第六方面所述的药物组合物用于在有此需要的患者中诱导细胞死亡、或者治疗癌症、或者治疗过度增生性或者分化性紊乱的应用。

在具体的实施方式中，所述受试者是人类。

在第十二方面，本发明提供第一方面所述的融合蛋白、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的载体、第四方面所述的宿主细胞或者第五方面所述的免疫效应细胞在制备药物中的用途，所述药物用于在有此需要的患者中诱导细胞死亡、或者治疗癌症、或者治疗过度增生性或者分化性紊乱。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A为chIL4-21R-CAR的的质粒示意图；图1B为chIL4-21R-CAR构建的质粒图；图1C、1D显示了不同细胞对STAT3/5磷酸化水平的影响；

图2A、2B显示了CAR-T细胞在IL-4刺激下增殖或存活的能力；

图3A、3B显示了不同CAR-T细胞的体外细胞毒性；

图4A显示了在IL-4刺激下chIL4-21R-CAR T细胞的Bcl-6的表达水平；图4B显示了在IL-4刺激下chIL4-21R-CAR T细胞的T-bet的表达水平；图4C显示了在IL-4刺激下chIL4-21R-CAR T细胞的Blimp-1的表达水平；图4D显示了在IL-4刺激下chIL4-21R-CAR T细胞的颗粒酶B的表达水平；图4E显示了在IL-4刺激下，chIL4-21R-CAR T细胞的CD26的表达水平；图4F显示了在IL-4刺激下，chIL4-21R-CAR T细胞的RORγt的表达水平；图4G显示了在IL-4刺激下，chIL4-21R-CAR T细胞的GATA3的表达水平。

图5A显示了GPC3-CAR-T细胞组在IL-4或IL-2刺激后CD25+的细胞群体比例；图5B显示了chIL4-21R-CAR T细胞组在IL-4或IL-2刺激后CD25+的细胞群体比例；

图6显示了细胞耗竭标志物的检测结果；

图7A显示了chIL4-21R-CAR T细胞对IL-4分泌型的肿瘤细胞持续性杀伤情况；图7B显示了持续性杀伤IL-4分泌型的肿瘤细胞后chIL4-21R-CAR T细胞耗竭标志物的检测；

图8显示了chIL4-21R-CAR T细胞对GPC-3-SMMC-7721移植瘤模型的肿瘤杀伤情况；

图9A显示了chIL4-21R-CAR T细胞在实验动物体内的存活情况；图9B显示了在实验动物体内存活的chIL4-21R-CAR T细胞的CD4/8群体比例；

图10显示了chIL4-21R-CAR T细胞对PLC/PRF/5肝癌移植瘤模型的肿瘤杀伤情况。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现将IL4R和IL21R构成的融合蛋白与嵌合抗原受体(CAR)共表达在T细胞上，得到的T细胞能够在实体瘤的肿瘤微环境中具备显著的抗肿瘤能力。在此基础上完成了本发明。

本发明的实施方案提供一项新方案以使肿瘤反应性T细胞抵抗肿瘤微环境存在的免疫阻抑性/抑制性细胞因子。本发明涉及使用细胞因子受体的融合蛋白改善肿瘤特异性免疫效应细胞的扩增和抗肿瘤活性。

这类方案包括具有细胞因子受体的融合蛋白的天然或基因修饰的肿瘤特异性T细胞，所述细胞因子受体的融合蛋白结合抑制性/阻抑性细胞因子IL4并且使得它们的胞内结果转换成IL21免疫刺激性/活化信号，因此改善肿瘤特异性T细胞的功效。

本发明包括载体，如示例性双顺反子逆转录病毒载体，所述载体编码与IL21细胞因子受体的信号转导胞内结构域融合的IL4细胞因子受体的胞外结构域。

在特定的实施方案中，其中IL4存在微环境中的癌包括基本上全部实体瘤。具体的示例性癌包括：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤，间皮瘤，尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、癌、支气管癌、髓样癌、肾细胞癌、肝癌，尼罗河管癌，绒癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤，颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤，听神经瘤，少突胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、食管癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤。本发明的实施方案可用来调节例如原代T细胞、天然存在的肿瘤抗原特异性细胞毒T淋巴细胞和NK细胞。利用本发明修饰的T/NK细胞可以在自体或同种异型环境下使用。

在本发明的一些实施方案中，存在可以使负向免疫调节信号转化成正向信号的嵌合分子。仅以举例方式，这种方案涉及使IL-4胞外结构域与IL-21受体的信号转导胞内结构域融合。这种方案可以用来使得免疫效应细胞抵抗肿瘤微环境中经常存在的负向细胞因子信号。

在一些实施方案中，本发明提供了使用细胞因子受体的融合蛋白，与IL-21、受体的胞内结构域融合的IL4细胞因子受体的胞外结构域，逆转肿瘤微环境的影响。

本发明提供了使用细胞因子受体的融合蛋白，与IL-21受体的胞内结构域融合的IL4细胞因子受体的胞外结构域，逆转肿瘤微环境的影响：

1.IL-4活化后的下游信号GATA3在chIL4-21R-CAR-T细胞中被显著抑制，说明IL-4的下游信号的诱导作用在chIL4-21R-CAR-T细胞中被显著抑制；

2.CD25作为T细胞激活的标志物。chIL4-21R-CAR T细胞组在IL-4刺激后，CD25+的细胞群体比例与IL-2刺激组基本没有差异，说明融合蛋白chIL4-21R-CAR阻断了IL-4对T细胞激活的抑制作用，也就是说IL-4的下游信号的诱导作用在chIL4-21R-CAR-T细胞中被显著抑制。

3.IL-4的刺激能诱导T细胞高表达作为T细胞耗竭的重要标志物的PD-1、和TIM3水平。而在IL-4存在的条件下，chIL4-21R-CAR融合蛋白的表达能显著抑制由IL-4刺激引起的T细胞耗竭重要标志物PD-1、TIM3的表达水平。说明IL-4信号由融合蛋白chIL4-21R转化为IL-21信号并发挥抑制细胞耗竭、维持细胞存活的功能，从而提高杀伤肿瘤细胞的效果。

4.Bcl-6、T-bet、Blimp-1是IL-21信号的靶基因。chIL4-21R-CAR-T细胞中，Bcl-6、T-bet、Blimp-1的表达水平大大高于GPC3-CAR T细胞，表明chIL4-21R-CAR融合蛋白能够将胞外IL-4的刺激转变成IL-21的信号传递，并且通过显著上调细胞中STAT3/5磷酸化水平，上调作用于T细胞活化释放细胞浆颗粒的颗粒酶B的水平，这都提示胞外IL-4的刺激已经转变成IL-21信号通路的激活，并且发挥免疫刺激性/活化作用。

5.IL-4的刺激能促使chIL4-21R-CAR-T细胞扩增，表明chIL4-21R-CAR T细胞在IL-4环境下的生长，能逆转肿瘤微环境的影响，将抑制性或阻抑性细胞因子信号转化成促进免疫刺激性/活化信号，具有更强的增殖或存活能力。

6.在IL-4的刺激后，chIL4-21R-CAR-T能显著地保留甚至增强了细胞毒性/杀伤能力；而对持续分泌IL-4的肿瘤细胞，chIL4-21R-CAR-T也具有显著的持久的杀伤肿瘤细胞的能力；并且chIL4-21R-CAR T能明显抑制小鼠体内肿瘤的生长，并且体内存活的细胞亚群主要为CD4+T、CD8+T细胞；这些结果都表明chIL4-21R-CAR T细胞能在IL-4刺激后或在IL-4持续分泌环境下逆转肿瘤微环境的影响，将抑制性或阻抑性细胞因子信号转化成促进免疫刺激性/活化信号，具有更强的细胞杀伤能力。

为了进一步理解本文提供的技术方案，下面对方法和/或术语在本文中的定义作进一步说明。

术语“肿瘤”是指所有赘生细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌性细胞和组织。

术语“肿瘤微环境”是指肿瘤环境的任何和所有元素，包括为恶性过程产生结构和/或功能环境以存活和/或扩张和/或扩散的元素。

术语“IL-4R”或“IL-4R”包括天然的IL-4R蛋白以及变体型IL-4R蛋白。本文使用的“天然的”或“野生型”IL-4R的序列是指人类IL-4R序列，不管是从天然来源纯化还是使用重组技术制得。

术语“IL-4R(IL-4R)的功能性部分”是指保留了IL-4R功能的IL-4R的全长或者IL-4R的部分片段；例如IL-4R的胞外部分(见SEQ ID NO：14)、IL-4R的胞外部分及跨膜部分。其可以来自天然的，也可以来自人工重组。

术语“IL-4”指白介素4，NCBI Gene ID:3565,诱导T细胞分化为Th2型的抗炎细胞因子，是由激活T细胞产生的多效性细胞因子，是IL4受体(IL4R)的配体。GATA3是IL-4活化后的下游信号。对IL-13Rα1(II型受体)具有高的选择性的变体型IL-4蛋白是相对于天然IL-4而言包含如下突变的人类IL-4蛋白(编号排除了在N末端的甲硫氨酸)：R121K/Y124F/S125R(“KFR”或者“KFR4”变体)或者R121K/Y124F(“KF”变体)。

对γc(I型受体)具有比对IL-13Rαl(II型受体)的选择性高的变体型IL-4蛋白是相对于天然人类IL-4的序列而言包含如下突变的IL-4蛋白(编号排除了在N末端的甲硫氨酸)：R121Q/Y124W/S125F(“RGA”或者“super-4”或者“S4”变体)，如在例如Junttila等(Nature Chemical Biology 8:990-998,2012)中所述。

术语“IL-21R”或“IL-21R”包括天然的IL-21R蛋白以及变体型IL-21R蛋白。本文使用的“天然的”或“野生型”IL-21R的序列是指人类IL-21R序列，不管是从天然来源纯化还是使用重组技术制得。

术语“IL-21R(IL-21R)的功能性部分”是指保留了IL-21R功能的IL-21R的全长或者IL-21R的部分片段；例如IL-21R的胞内信号部分(SEQ ID NO：15)、IL-21R的胞内信号部分及跨膜部分。其可以来自天然的，也可以来自人工重组。在本文中，“IL-21R的胞内信号部分”与“IL-21R的胞内域”具有相同的含义。Bcl-6、T-bet、Blimp-1是IL-21信号的靶基因，Bcl-6是维持记忆性T细胞存活的转录因子，T-bet和Blimp-1是促进CD8+ T细胞分化为效应细胞的转录因子。

术语“IL-2”是免疫系统中的一类细胞生长因子，NCBI Gene ID：3558，能调控免疫系统中白血球的细胞活性，促进Th0和CTL的增殖，在本申请中，可以用于T细胞的培养。

应当理解的是，根据本公开内容的IL-4R蛋白包括可以比天然的IL-4R蛋白短的片段，只要IL-4R蛋白片段保持结合IL-4的能力。还应当理解的是，本公开内容涵盖编码本文所述的或者本领域已知的IL-4R蛋白的核酸分子，包括但不限于与本文所述的DNA序列对应的RNA序列。

术语“融合蛋白”包括利用可选的额外的序列或者部分(例如接头)结合至IL-21R的IL-4R蛋白，如本文所述，以及编码这些融合蛋白的核酸分子。还涵盖的是其中编码融合蛋白的核酸序列被可操作地连接至启动子的重组核酸分子、包含所述分子的载体、和包含这种分子的转基因细胞。生成这些融合蛋白的方法是本领域中的常规方法，例如使用重组分子生物学方法。

术语“跨膜域”可包括多种天然受体蛋白的跨膜结构域，起到连接受体胞外、胞内区并锚定于细胞膜上的作用，包括但不限于IL-4R、IL-21R的跨膜区。

术语“抗原”或“Ag”指可以激起免疫反应的分子。免疫反应可以涉及抗体的产生、或特定的免疫活性细胞的激活、或两者。本领域技术人员明了，任何大分子，包括基本上所有的蛋白或肽，均可以充当抗原。此外，抗原可以源自重组DNA或基因组DNA。本领域技术人员明了，包含编码可以引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA，因此编码“抗原”(正如该术语在本文所用的)。此外，本领域技术人员明了，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。容易明了的，本发明包括，但不限于，使用一个以上基因的部分核苷酸序列，这些核苷酸序列可以以各种组合方式排列以编码可以引起期望免疫反应的多肽。此外，本领域技术人员明了，抗原无需由“基因”编码。容易明了的，抗原可以合成产生、或可以源自生物样品、或可以是除多肽之外的大分子。所述生物样品可以包括，但不限于，组织样品、肿瘤样品、细胞或液体以及其它生物学成分。

术语“抗体”在本文中包括完整的抗体和任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键链间连接的至少2个重(H)链和2个轻(L)链的糖蛋白。每一条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每一条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可被进一步细分为称为互补决定区(CDR)的具有高可变性的区域，其间隔以更保守的称为框架区(ER)的区域。每一个VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。

术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。

如本文中所用，术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸的序列。一般而言，在每一个重链可变区中存在3个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)并且在轻链可变区中存在3个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。

术语“表达”指启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

术语“慢病毒”指慢病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们能将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，由此它们是最为有效的基因递送载体方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。

术语“同源性”或“同一性”指两个聚合物分子之间，例如两个核酸分子之间、例如两个DNA分子或两个RNA分子之间、或两个多肽分子之间的亚单位序列同一性。当一个亚单位位置在两个分子中被相同单体亚单位占据时，例如当两个DNA分子在一个位置上都被腺苷占据时，则它们在该位置是同源的或同一的。两个序列之间的同源性是匹配的或同源的位置数的直接函数；例如，当两个序列中半数位置(例如在长10个亚单位的聚合物中5个位置)是同源的，则这两个序列50％同源；如果90％的位置(例如，10个中9个)是匹配的或同源的，则这两个序列90％同源。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指，将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经被转染了、转化了或转导了外源核酸的细胞。该细胞包括原代受试细胞和其后代。

本文所用的术语“嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)”指一种融合到细胞内信号转导域的肿瘤抗原结合结构域，能激活T细胞。常见地，CAR的胞外结合结构域来源于小鼠或人源化或人的单克隆抗体。

嵌合抗原受体通常包含(细)胞外抗原结合区。在一些实施方案中，胞外抗原结合区可以是完全人的。在其他情况下，胞外抗原结合区域可以被人源化。在其他情况下，胞外抗原结合区可以是鼠源的，或者所述胞外抗原结合区中的嵌合体由来自至少两种不同动物的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述胞外抗原结合区可以是非人的。

在一些情况下，细胞外抗原结合区域包括铰链或间隔区。术语铰链和间隔区可以互换使用。铰链可以被认为是用于向细胞外抗原结合区提供柔性的CAR的一部分。在一些情况下，铰链可用于检测细胞的细胞表面上的CAR，特别是当检测细胞外抗原结合区的抗体不起作用或可用时。例如，衍生自免疫球蛋白的铰链的长度可能需要优化，这取决于细胞外抗原结合区域靶向靶上的表位的位置。

CAR的跨膜域可以将CAR锚定在细胞的质膜上，如CD8的跨膜域、CD28的跨膜域等均可使用。技术人员可以根据已知的跨膜域进行替换。

CAR的胞内信号域可以负责活化CAR已经置于其中的免疫应答细胞的效应子功能中的至少一种。CAR可以诱导T细胞的效应子功能，例如，所述效应子功能是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号域”是指转导效应子功能信号并引导细胞进行特异功能的蛋白质部分。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导区域，但是在许多情况下，不必使用信号结构域的整个链。在一些情况下，使用细胞内信号传导区的截短部分。在一些情况下，术语细胞内信号域因此意在包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导区的任何截短部分。

CAR的细胞内信号传导结构域可以选自表1的任何一个结构域。CAR的细胞内信号传导区可以进一步包含一个或多个共刺激结构域。细胞内信号传导区可以包含单个共刺激结构域，例如ζ链(第一代CAR)或其与CD28或4-1BB(第二代CAR)。在其他实例中，细胞内信号传导区可以包含两个共刺激结构域，例如CD28/OX40或CD28/4-1BB(第三代)。在某些情况下，通过CAR产生的信号可能与辅助或共刺激信号相结合。对于共刺激信号结构域，嵌合抗原受体样复合物可被设计成包含若干可能的共刺激信号结构域。已经报道对T细胞活化提供共刺激的几种受体，包括但不限于CD28、OX40、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BBL、MyD88和4-1BB。这些共刺激分子使用的信号传导途径均能与主T细胞受体激活信号协同作用。这些共刺激信号传导区域提供的信号可以与源自一个或多个ITAM基序(例如CD3zeta信号转导域)的主效应激活信号协同作用，并且可以完成T细胞激活的要求。

表1.共刺激结构域

接头

在一些实施方式中，可以直接将IL-4R的功能性部分与IL-21R的功能性部分相连。

在一些实施方式中，可以通过接头将IL-4R的功能性部分与IL-21R的功能性部分相连。将IL-4R的功能性部分和IL-21R的功能性部分的接头可以被设计成用于：(1)允许所述两个分子折叠并且独立于彼此发挥作用；(2)不具有形成可能干扰这两个部分的功能的有序二级结构的倾向性；(3)具有最小的可能与功能性蛋白域相互作用的疏水性或者带电荷特性；和/或(4)提供两个区域的空间分离。

适合于在根据本公开内容的融合蛋白中使用的接头包括肽。可以使用重组DNA技术将所述接头结合至IL-4R的功能性部分和/或IL-21R的功能性部分。这些方法在本领域中是已知的，并且这种技术的细节可以在例如Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual.第二版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1989或者Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，1994)或者其升级版中找到。

所述融合蛋白可以根据需要和/或如本文所讨论的那样包括一个或者多个接头以及其他部分。它们可以包括结合区域，例如抗生物素或者表位、或者可以用于纯化和加工所述融合蛋白的多组氨酸标签等标签以及本文所述的其他接头。另外，可以将可检测的标记物结合至所述融合蛋白，使得可以方便地监视所述融合蛋白通过身体或者细胞的运输。这些标记物包括放射性核素、酶、荧光团、发色团以及类似的标记物。

本领域技术人员应当理解的是，可以以很多种方式改变所述DNA而不影响编码蛋白的生物学活性。例如，可以使用PCR来在编码所述融合蛋白的DNA序列中产生变化。编码融合蛋白的DNA中的这些变化可以被用来对用于表达所述蛋白的宿主中的密码子偏好进行优化，或者可以包含能够便于表达的其他序列变化。

分析

可以使用本领域已知的或者本文描述的标准方法对融合蛋白、或者表达融合蛋白的免疫效应细胞进行分析。

应用

包含如本文所述的IL-4R/IL-21R的所述融合蛋白可以被用于各种治疗用途。一般来说，本文所述的融合蛋白可以被用于涉及表达IL-4的细胞以及将受益于对细胞增殖的抑制或者细胞死亡的促进的任意疾病、紊乱或者病症的治疗或者预防。在一些实施方式中，可以被用来诱导凋亡或者细胞死亡、或者用来治疗与异常凋亡或者细胞增殖相关联的紊乱例如癌症。

本文使用的术语“癌症”、“癌”、“过度增生”或者“肿瘤”是指具有自动生长的能力的细胞(例如，以正在增殖的细胞生长激增为特征的异常状态或者情况)。过度增生性或者赘生性疾病状态可以被分类为病理性类型(例如，因为偏离正常状态但是与疾病状态不相关)。因此，“癌症”或者“肿瘤”是指细胞的没有生理学功能的任何不需要的生长。术语癌症包括从技术上来说是良性的但是可能存在变成恶性的风险的细胞生长。“恶性”是指任何细胞类型或者组织的异常生长。术语恶性包括从技术上来说是良性的但是存在变成恶性的风险的细胞生长。该术语还包括任何癌症、癌、赘生物、肿瘤形成或者肿瘤。因此，这些术语是指包括所有类型的癌生长或者肿瘤发生过程、转移性组织或者恶性转化细胞、组织或者器官，不管是组织病理学类型或者侵袭阶段。

大多数癌症分为三个大的组织学类别：癌，其是占多数的癌症以及表皮细胞或者覆盖在器官、腺体、或者其他身体结构(例如，皮肤、子宫、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃、肠)的外部或者内部表面上的细胞的癌症，并且往往会发生转移；肉瘤，其衍生于结缔组织或者支撑组织(例如，骨、软骨、肌腱、韧带、脂肪，肌肉)；和血液肿瘤，其衍生自骨髓和淋巴组织。癌症的示例包括但不限于：癌、肉瘤和血液肿瘤形成紊乱例如白血病。

癌可以是腺癌(其一般在能够分泌的器官或腺体中，如乳腺、肺、结肠、前列腺或膀胱)，或者可以是鳞状细胞癌(其衍生自鳞状上皮并且一般在身体的大部分区域形成)。

肉瘤可以是骨肉瘤或骨源性肉瘤(骨)、软骨肉瘤(软骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、横纹肌(骨骼肌)，间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜质内层)、纤维肉瘤(纤维组织)、血管肉瘤或血管内皮瘤血管)、脂肪肉瘤(脂肪)、神经胶质瘤或星形细胞瘤(见于大脑的神经源性结缔组织)、粘液肉瘤(原始胚胎结缔组织)或间叶细胞肿瘤或中胚叶混合瘤(混合结缔组织类型)。

造血肿瘤形成性紊乱包括涉及造血起源的增生性/赘生性细胞，例如源自于髓系、淋巴系或红细胞系或其前体细胞。优选的是，所述疾病源自于分化不良的急性白血病(例如，成红细胞性白血病和急性成巨核细胞性白血病)。另外的例示性髓性紊乱包括但不是限于急性前髓细胞性白血病(APML)、急性骨髓性白血病(AML)和慢性骨髓性白血病(CML)；淋巴恶性疾病包括但不是限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，其包括B系急性成淋巴细胞性白血病和T系急性成淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞白血病和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)。

其他形式的恶性淋巴瘤包括但不是限于非霍奇金淋巴瘤及其变体，外周T细胞淋巴瘤，成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、霍奇金病和里-斯疾病。

药物组合物

根据本公开内容的药物组合物可以包含本申请提供的融合蛋白或者本申请提供的免疫效应细胞和一种或多种非毒性的药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂。这些组合物可以适合在本文所述的治疗性适应症的治疗中使用。

如果需要，可以将其它活性成分包含在所述组合物中。因此，在一些实施方式中，所述的融合蛋白或免疫效应细胞可以以治疗有效量治疗一种或多种癌症或与其他疗法联合施用。可以在使用抗肿瘤或者其他疗法进行治疗之前、期间或之后施用所述融合蛋白或免疫效应细胞。还可以与辐射敏化剂如放射性治疗敏化剂结合使用所述融合蛋白或免疫效应细胞(参见例如Diehn等，J.Natl.CancerInst.98：1755-7，2006)。一般而言，敏化剂是能够增加所述融合蛋白的活性的任何试剂。例如，敏化剂将增加融合蛋白抑制癌细胞生长或杀死癌细胞的能力。例示性的敏化剂包括抗IL-10的抗体、骨形态发生蛋白和HDAC抑制剂(参见例如Sakariassen等，Neoplasia 9(11)：882-92，2007)。

所述融合蛋白或免疫效应细胞可能用作新辅助治疗(到初级治疗)的一部分、作为辅助治疗方案的一部分，其中目的是为了治愈受试者中的癌症。所述融合蛋白也可以在肿瘤发生和发展的不同阶段施用，包括在晚期和/或侵袭性赘生物(例如受试者中通过局部治疗形式(例如手术或者放射性治疗不能治愈的显性疾病)、转移性疾病。局部晚期疾病和/或难治性肿瘤(例如，对治疗不反应的癌症或肿瘤)的治疗中的各个阶段施用。“初级疗法”是指受试者中癌症的初次诊断后的一线治疗。例示性的初级疗法可能涉及手术、大范围的化学治疗和放射性治疗。“辅助治疗”是指这样的一种疗法，其跟随一种初级疗法之后以及在存在复发风险时施用于受试者。辅助系统性治疗在初级疗法之后很快开始，例如在最后一次的初级疗法治疗之后2、3、4、5、或6周开始以延迟复发，延长存活时间或治愈所述受试者。如此处讨论的那样，考虑到了所述融合蛋白或所述免疫效应细胞可以单独使用或作为辅助疗法的一部分与一种或多种其他化疗药物结合使用。所述融合蛋白或免疫效应细胞与标准化疗试剂的组合可以起到提高化疗疗效的作用，因此，可以用来改善标准癌症疗法。

“受试者”可以是需要治疗的哺乳动物，如人类或兽医学患者(例如，啮齿类动物，如小鼠或者大鼠、猫、狗、奶牛、马、绵羊、山羊，或其他牲畜)。在一些实施方式中，“受试者”可以是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等等。所述受试者可能被怀疑患有以细胞增殖为特征的疾病或者具有患上以细胞增殖为特征的疾病、被诊断为患有以细胞增殖为特征的疾病、或者是被证实不患有以细胞增殖为特征的疾病的对照受试者，如本文所述，用于以细胞增殖为特征的疾病的诊断方法和这种诊断的临床划分对于本领域技术人员是已知的。

所述组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、缓释制剂或粉末，并且可以和药学上可接受的载体配制。所述组合物可以使用传统的粘合剂和载体例如甘油三酯配制成栓剂。“药学上可接受的载体”是指不会干扰活性成分的生物活性的有效性并且不对所述宿主或者受试者产生毒性的载体基质或者媒介物(vehicle)。

融合蛋白或免疫效应细胞可以和药学上可接受的媒介物一起输送。在一个实施例中，媒介物可以增强稳定性和/或输送性质。媒介物如人造膜囊泡(包括脂质体、非离子表面活性剂泡囊(noisome)、纳米微脂囊等)、微粒或者微胶囊、或者包含药学可接受的聚合物的胶体制剂。

包含一种或者多种融合蛋白或免疫效应细胞的药物组合物可以根据本领域已知的方法并且使用适当的一种或者多种分散试剂或润湿试剂和/或悬浮试剂配制成无菌可注射水性或者油质悬浮液。所述无菌可注射制剂可以是在非毒性的亲本可接受的稀释剂或者溶剂中的无菌可注射溶液或者悬浮液。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.表达嵌合抗原受体的T细胞的构建

采用本领域常规分子生物学方法，将人IL-4R信号肽(SEQ ID NO:1)、IL-4R胞外区DNA编码序列(SEQ ID NO:2)与人IL-21R的跨膜域(SEQ ID NO:3)、人IL-21R的胞内域(SEQID NO:4)依次连接，再与GPC3-28z-CAR(SEQ ID NO:8)以F2A自剪切肽(SEQ ID NO:13)连接，插入pRRLSIN慢病毒表达载体，得到表达GPC3-28z-CAR(SEQ ID NO:8)和融合蛋白(SEQID NO:5)的慢病毒质粒chIL4-21R-CAR，核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示(图1A和1B)。

将人IL-4R信号肽(SEQ ID NO:1)、IL-4R胞外区DNA编码序列(SEQ ID NO:2)与人IL-7R的跨膜域(SEQ ID NO:24)、人IL-7R的胞内域(SEQ ID NO:25)依次连接，再与GPC3-28z-CAR(SEQ ID NO:8)以F2A自剪切肽(SEQ ID NO:13)连接，插入pRRLSIN慢病毒表达载体，得到表达GPC3-28z-CAR(SEQ ID NO:8)和融合蛋白(SEQ ID NO:26)的慢病毒质粒chIL4-7R-CAR，核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。

T细胞活化：取人PBMC培养于AIM-V培养基，添加2％人AB型血清，500U/mL重组人IL-2，并加入CD3/CD28抗体结合磁珠活化48h。

采用慢病毒质粒chIL4-21R-CAR或chIL4-7R-CAR感染活化后的T细胞，去血清静息24h，得到表达融合蛋白chIL4-21R(氨基酸序列为SEQ ID NO:6)或chIL4-7R(氨基酸序列为SEQ ID NO:28)和CAR(氨基酸序列为SEQ ID NO:10)的chIL4-21R-CAR T细胞。

以重组人IL-4分别刺激UTD细胞组(未做处理的T细胞，没有转染空载)和chIL4-21R-CAR T细胞30min，收集细胞提取蛋白进行Western blot检测，分析STAT3/5磷酸化水平变化，结果如图1C所示。相比于未感染组(UTD)，chIL4-21R-CAR T细胞组(chIL4-21R)的STAT3/5磷酸化水平发生显著上调，说明该融合蛋白能够将IL-4的刺激转变为IL-21的信号。

而图1D显示chIL4-21R-CAR T细胞在rIL-4刺激下，磷酸化STAT3水平显著高于chIL4-7R-CAR T细胞，而chIL4-7R-CAR T细胞则倾向于STAT5磷酸化，说明chIL4-21R-CART细胞和chIL4-7R-CAR T细胞在rIL-4刺激下，产生不同的下游信号。

实施例2.chIL4-21R-CAR T细胞与IL-4刺激下增殖或存活的能力测定

参照实施例1的操作，将GPC3-28z-CAR(SEQ ID NO:8)插入RRLSIN慢病毒表达载体，构建了表达GPC3-28z-CAR的慢病毒载体，再转染293T包装慢病毒，得到慢病毒2。采用慢病毒2感染T细胞，得到GPC3-CAR T细胞。

采用如下述a或者b所述的操作，进行不同的细胞因子诱导培养：

a：分别将实施例1制备的chIL4-21R-CAR T细胞和GPC3-CAR T细胞，以重组人IL-2(浓度是500U/mL)诱导培养4天，收集细胞以抗人Fab段的抗体标记CAR，流式检测细胞阳性率。b：分别将实施例1制备的chIL4-21R-CAR T细胞和GPC3-CAR T细胞，以20ng/mL重组人IL-4(Peprotech公司)诱导培养4天，收集细胞以抗人Fab段的抗体标记CAR，流式检测细胞阳性率。

结果如图2A、2B所示，结果说明：对照组GPC3-CAR T细胞在IL-2或IL-4处理下的阳性率无显著差异，而chIL4-21R-CAR T细胞组在IL-4处理下阳性率显著上升，说明IL-4可选择性地使融合蛋白阳性的细胞扩增，提示表达融合蛋白的细胞受到IL-4刺激后比普通T细胞具有更强的增殖或存活能力，提示我们chIL4-21R-CAR T细胞在IL-4环境下的生长，能逆转肿瘤微环境的影响，将抑制性或阻抑性细胞因子信号转化成促进免疫刺激性/活化信号，比常规的CAR-T细胞更有优势。

实施例3.chIL4-21R-CAR T细胞在IL-4或IL-2刺激下对肿瘤细胞的杀伤能力

参照实施例2的操作，对T细胞分别以重组人IL-2或IL-4诱导培养6天，以Huh7肝癌细胞(GPC-3阳性)为靶细胞进行细胞毒性实验。于96孔板每孔接1×10⁴个Huh7肝癌细胞，以效靶比3:1、1:1、1:3分别加入相应数量的上述实施例所得的GPC3-CAR T细胞、chIL4-7R-CAR T细胞、chIL4-21R-CAR T细胞共培养于100μL RPMI-1640培养液+10％FBS，18h后收取50μL培养液上清，用Promega公司CytoTox 96试剂盒检测上清中LDH水平，杀伤效率的计算按照厂家说明书建议进行。结果如图3A、3B所示，对照组GPC3-CAR T细胞以及chIL4-7R-CART细胞在IL-4处理下细胞毒性明显降低，chIL4-21R-CAR T细胞则显著地保留甚至增强了细胞毒性。其中图3B所示的体外毒性实验进一步证明了，相比chIL4-7R-CAR T细胞，chIL4-21R-CAR T细胞在rIL-4诱导下维持更强的细胞杀伤毒性。

实施例4.T细胞活化和抑制信号基因的测定

取上述实施例1制备的GPC3-CAR T细胞、chIL4-7R-CAR T细胞和chIL4-21R-CAR T细胞，分别与rIL-4(20ng/mL)或IL-2(500U/mL)共孵育72h后，收取细胞，提取RNA，RT-qPCR检测Bcl-6、T-bet、Blimp-1、颗粒酶B、及GATA3。

Bcl-6、T-bet、Blimp-1是IL-21信号的靶基因。其中，Bcl-6是维持记忆性T细胞存活的转录因子，T-bet和Blimp-1是促进CD8⁺T细胞分化为效应细胞的转录因子。颗粒酶B为T细胞活化释放的细胞浆颗粒，GATA3是为IL-4活化后的下游信号。

结果如图4A-4E(One-way ANOVA统计*表示p〈0.05，**表示p<0.01)所示，图4A显示了在IL-4刺激下，chIL4-21R-CAR T细胞的Bcl-6的表达水平大大高于GPC3-CAR T细胞和chIL4-7R-CAR T细胞；

图4B显示了在IL-4刺激下，chIL4-21R-CAR T细胞的T-bet的表达水平高于GPC3-CAR T细胞；

图4C显示了在IL-4刺激下，chIL4-21R-CAR T细胞的Blimp-1的表达水平高于GPC3-CAR T细胞；

图4D显示了在IL-4刺激下，chIL4-21R-CAR T细胞的颗粒酶B的表达水平大大高于GPC3-CAR T细胞和chIL4-7R-CAR-T细胞。说明对于chIL4-21R-CAR T细胞，IL-4的存在不仅能够诱导chIL4-21R-CAR T细胞大量表达Bcl-6，且IL-4对T-bet、Blimp-1和颗粒酶B的表达的抑制作用也在chIL4-21R-CAR T细胞中减弱甚至消除，而颗粒酶B的高表达可能是chIL4-21R-CAR T细胞在实施例3中维持高细胞毒性的原因之一。

图4E显示了在IL-4刺激下，chIL4-21R-CAR T细胞的CD26的表达水平大大高于GPC3-CAR T细胞和chIL4-7R-CAR T细胞。由于表达CD26的CD4⁺CAR T细胞具有极强的抗肿瘤能力，甚至比一般认为的主要杀伤肿瘤细胞的CD8⁺CART细胞更强。说明chIL4-21R融合蛋白能改善肿瘤特异性T细胞的功效,产生具有更强抗肿瘤功能的CAR-T细胞。

图4F显示了在chIL4-21R-CAR T细胞中，IL-4诱导下RORγt表达水平显著增强，改善肿瘤特异性T细胞的功效,产生具有更强抗肿瘤功能的CAR-T细胞。

图4G显示了不表达chIL4-21R的GPC3-CAR T细胞的GATA3在IL-4诱导下显著上调，但chIL4-21R-CAR T细胞的GATA3上调程度显著减弱。图4G说明IL-4下游信号分子的作用在chIL4-21R-CAR T细胞中被显著抑制。

以上结果显示了chIL4-21R融合蛋白不仅能够改变IL-4诱导的免疫抑制性环境，反而能够通过IL-21信号通路增强了T细胞与存活、效应相关基因的表达，产生具有更强抗肿瘤功能的CAR-T细胞。

综合图4A/D可以看出，chIL4-21R-CAR T细胞在rIL-4诱导下，相比chIL4-7R-CART细胞，表达高水平的Bcl-6，提示了其具有更强存活能力和记忆性T细胞表型。此外，chIL4-21R-CAR T细胞维持更高水平的颗粒酶B表达，这与天然的IL-21信号可增强颗粒酶B的表达相符，提示了chIL4-21R-CAR T细胞在rIL-4诱导下可保持甚至增强细胞杀伤毒性，而chIL4-7R-CAR T细胞则没有类似能力。

取上述在IL-2或IL-4刺激下，得到的GPC3-CAR T细胞和chIL4-21R-CAR T细胞，流式检测T细胞激活的标志物CD25，结果如图5A和5B所示：GPC3-CAR T细胞组在IL-4刺激后，CD25+的细胞群体比例显著低于IL-2刺激组(图5A)，chIL4-21R-CAR T细胞组在在IL-4刺激后，CD25+的细胞群体比例与IL-2刺激组基本没有差异(图5B)，说明IL-4显著抑制GPC3-CART细胞的CD25表达，而chIL4-21R-CAR T细胞的CD25表达基本不受抑制，提示融合蛋白阻断了IL-4对T细胞激活的抑制作用。

实施例5.CAR-T细胞耗竭标志物的检测

取上述实施例1制备的GPC3-CAR-T细胞、chIL4-7R-CAR-T细胞和chIL4-21R-CAR T细胞，分别与rIL-4(20ng/mL)、IL-2(500U/mL)共孵育6天后收取细胞，流式检测PD-1和TIM3,PD-1、和TIM3是T细胞耗竭的重要标志物。结果如图6所示：在IL-4处理下，chIL4-21R-CAR T细胞组所表达的PD-1水平低于GPC3-CAR T细胞组，TIM3水平低于GPC3-CAR T细胞组和chIL4-7R-CAR T细胞组，说明IL-4信号由融合蛋白chIL4-21R转化为IL-21信号并发挥抑制细胞耗竭的功能，IL-21信号具有抑制细胞耗竭、维持细胞存活的功能，从而提高杀伤肿瘤细胞的效果。

实施例6.chIL4-21R-CAR T细胞对IL-4分泌型的肿瘤细胞的杀伤

构建GFP-F2A-IL-4的pWPT慢病毒表达质粒，包装病毒并感染Huh-7细胞，3天后流式检测GFP呈阳性，得到能够分泌IL-4的靶细胞IL-4-Huh-7细胞。

采用IL-4-Huh-7细胞作为肿瘤细胞，比较chIL4-21R-CAR T细胞和GPC3-CAR T细胞对IL-4-Huh-7细胞的杀伤,一方面更模拟CAR T细胞在体内遭遇肿瘤细胞的状态，另一方面可显示CAR T细胞在杀伤肿瘤细胞后耗竭状态的改变。

取前述实施例制备的chIL4-7R-CAR T细胞、chIL4-21R-CAR T细胞和GPC3-CAR T细胞，以IL-4-Huh-7为靶细胞，效靶比＝1:1进行第一轮杀伤，48h后显微镜下观察：除UTD组外，各组已无贴壁细胞。收集悬浮T细胞进行流式检测，分析CAR阳性率和耗竭标志物表达，将剩余T细胞再次以效靶比1:5与靶细胞共培养，进行第二轮杀伤，48h后PBS洗去悬浮的T细胞，贴壁的靶细胞以结晶紫染色观察。结晶紫染色结果如图7A所示，相比于GPC3-CAR T细胞、chIL4-7R-CAR T细胞，chIL4-21R-CAR T细胞在第二轮刺激后维持更好的靶细胞杀伤能力。UTD指未感染的T细胞。

分别在chIL4-21R-CAR T细胞和GPC3-CAR T细胞与IL-4-Huh-7细胞共孵育的当天(记为第一轮杀伤前R0)、效靶比1:1进行第一轮杀伤48h(记为第一轮杀伤后R1)、效靶比1:5进行第二轮杀伤48h(记为第二轮杀伤后R2)。收集T细胞，流式检测T细胞耗竭物PD-1和TIM3，结果如图7B所示，随着杀伤次数增多，CAR T细胞耗竭的标志物表达显著增强，UTD作为对照由于没有杀伤作用，因此表达情况基本不变，chIL4-21R-CAR T细胞组的PD-1和TIM3表达水平较对照组GPC3-CAR T细胞、chIL4-7R-CAR T细胞均明显降低，进一步说明chIL4-21R-CAR T细胞可更持久地对IL-4⁺的靶细胞进行杀伤，具有更持久杀伤肿瘤细胞的效果。

而综合图7A/B可以看出，相比chIL4-7R-CAR T细胞，chIL4-21R-CAR T细胞在对分泌IL-4的靶细胞的持续杀伤后，T细胞耗竭标志物PD-1和TIM3表达水平更低，提示了chIL4-21R-CAR T细胞在IL-4+的肿瘤微环境中抵抗耗竭的能力更强，对靶细胞杀伤的结果进一步证明了chIL4-21R-CAR T细胞具有更持久的靶细胞杀伤能力。

实施例7小鼠体内实验

一.7721肝癌细胞小负荷皮下移植瘤模型

1)实验分组：B-NDG小鼠(百奥赛图公司)，6-8周龄随机分为4组，每组4只，分别为Untransduced(UTD)、GPC3-CAR T细胞组、chIL4-7R-CAR T细胞组、chIL4-21R-CAR T细胞组。

2)皮下移植瘤的接种：胰酶消化法收集处于对数生长期且生长状态良好的7721细胞，每只小鼠接种3×10⁶个肿瘤细胞，接种日记为第0天。

3)CAR-T细胞回输：当肿瘤平均体积约为85mm³时，即接种肿瘤后第11天，注射2×10⁶/只CAR-T细胞或UTD细胞对照。实验结果如图8所示。

图8(One-way ANOVA统计***表示p<0.001)显示，CAR T注射后26天，与UTD对照组相比，各组均见明显抑瘤效果，抑制率分别为：GPC3-CAR T组：66.5％±17.2％，chIL4-7R-CAR T组：96.7％±3.6％，chIL4-21R-CAR T组：100％±0。

图8中可见，输注UTD-T细胞组的肿瘤体积持续增长，GPC3-CAR T细胞组的肿瘤体积生长相对减缓并呈现抑制趋势，而chIL4-21R-CAR T细胞组肿瘤生长明显受抑制，肿瘤体积显著小于GPC3-CAR T细胞组，说明chIL4-21R-CAR T细胞相比GPC3-CAR T细胞具有更强的抗肿瘤功能。

在给予CAR T细胞第14天时，小鼠颌下取外周血进行流式检测和细胞计数，以CD3/4/8作为标志物，检测CAR-T细胞的体内存活情况。结果如图9A和图9B(One-way ANOVA统计*表示p<0.05，**表示p<0.01)所示，表达融合蛋白chIL4-21R的CAR T细胞在外周血中的数量相比GPC3-CAR T细胞更多，提示具有更持久的抗肿瘤功能。图9B显示了chIL4-21R-CAR T细胞在体内存活的细胞亚群为CD4⁺T细胞占多，而chIL4-7R-CAR T细胞则为CD8⁺T细胞占多。与chIL4-7R-CAR T细胞不同，chIL4-21R-CAR T细胞在IL-4+荷瘤小鼠体内有更多CD4+细胞亚群的存活，由于CD4+CAR T细胞在体内比CD8+CAR T细胞不易耗竭，持久性更好，提示chIL4-21R-CAR T细胞可能比chIL4-7R-CAR T细胞在体内具有更持久的免疫杀伤和记忆功能。

有文献(Yang et al.,TCR engagement negatively affects CD8 but not CD4CAR T cell expansion and leukemic clearance,Sci.Transl.Med.9,eaag 1209(2017)22 November 2017)报道，与CD8⁺T细胞相比，CD4⁺T细胞在体内不易耗竭，具有更强的存活能力，这提示chIL4-21R-CAR T细胞可能比chIL4-7R-CAR T细胞具有更持久的抗肿瘤作用。

二.PLC/PRF/5肝癌细胞大负荷皮下移植瘤模型

1)实验分组：B-NDG小鼠6-8周龄随机分为4组，每组6-7只，分别为Untransduced(UTD)、GPC3-CAR T细胞组、chIL4-7R-CAR T细胞组、chIL4-21R-CAR T细胞组。

2)皮下移植瘤的接种：胰酶消化法收集处于对数生长期且生长状态良好的PLC/PRF/5细胞，每只小鼠接种3×10⁶的肿瘤细胞，接种日记为第0天。

3)CAR-T细胞回输：当肿瘤平均体积约为150mm³时，即接种肿瘤后第13天，注射3.0×10⁶/只CAR-T细胞或未经转导的T细胞对照。实验结果如图10A、10B所示。

图10A可见，CAR T注射后14天，与UTD对照组相比，各组均见明显抑瘤效果，抑制率分别为：GPC3-CAR T组：53.3％±12.0％，chIL4-7R-CAR T组：62.3％±13.8％，chIL4-21R-CAR T组：89.1％±10.1％。

在动物模型中，小鼠的体重变化是研究CAR-T细胞疗法毒副作用的重要指标之一。在本实施例中，输注CAR T细胞后第7天，chIL4-7R-CAR T组小鼠体重下降率明显高于其他CAR T组，达7.5％±2.8％，而GPC3-CAR T组和chIL4-21R-CAR T组分别为-0.1％±1.8％和-0.1％±1.5％，第9天chIL4-7R-CAR组有两只小鼠死亡。以上数据提示GPC3-CAR T细胞在表达chIL4-7R后，可能会增强CAR T细胞的毒副作用，而表达chIL4-21R后则未发现类似的不良效应，具有更好的安全性。

在上述实施例中，示例性地采用了靶向GPC3的CAR T细胞，本领域技术人员可以依据本申请的教导，采用靶向其他靶点的CAR-T细胞，如靶向EGFR的CAR T细胞(示例性的，靶向EGFR的CAR-T细胞的scFv的序列如SEQ ID NO：20所示)，如靶向CLD18A2的CAR T细胞(示例性的，靶向CLD18A2的CAR-T细胞的scFv的序列如SEQ ID NO：21所示)，如靶向CD19的CART细胞(示例性的，靶向CD19的CAR T细胞的scFv的序列如SEQ ID NO：22所示)，如靶向BCMA的CAR T细胞(示例性的，靶向BCMA的CAR T细胞的scFv的序列如SEQ ID NO：23所示)。

本发明所用的序列总结于下表：

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 科济生物医药（上海）有限公司

上海市肿瘤研究所

<120> IL-4R的融合蛋白及其应用

<130> P2018-1731

<150> CN2017108335280

<151> 2017-09-15

<150> CN2018100542747

<151> 2018-01-19

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

atggggtggc tttgctctgg gctcctgttc cctgtgagct gcctggtcct gctgcaggtg 60

gcaagctctg ggaac 75

<210> 2

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

atgaaggtct tgcaggagcc cacctgcgtc tccgactaca tgagcatctc tacttgcgag 60

tggaagatga atggtcccac caattgcagc accgagctcc gcctgttgta ccagctggtt 120

tttctgctct ccgaagccca cacgtgtatc cctgagaaca acggaggcgc ggggtgcgtg 180

tgccacctgc tcatggatga cgtggtcagt gcggataact atacactgga cctgtgggct 240

gggcagcagc tgctgtggaa gggctccttc aagcccagcg agcatgtgaa acccagggcc 300

ccaggaaacc tgacagttca caccaatgtc tccgacactc tgctgctgac ctggagcaac 360

ccgtatcccc ctgacaatta cctgtataat catctcacct atgcagtcaa catttggagt 420

gaaaacgacc cggcagattt cagaatctat aacgtgacct acctagaacc ctccctccgc 480

atcgcagcca gcaccctgaa gtctgggatt tcctacaggg cacgggtgag ggcctgggct 540

cagtgctata acaccacctg gagtgagtgg agccccagca ccaagtggca caactcctac 600

agggagccct tcgagcagca c 621

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ggctggaacc ctcacctgct gcttctcctc ctgcttgtca tagtcttcat tcctgccttc 60

tgg 63

<210> 4

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

agcctgaaga cccatccatt gtggaggcta tggaagaaga tatgggccgt ccccagccct 60

gagcggttct tcatgcccct gtacaagggc tgcagcggag acttcaagaa atgggtgggt 120

gcacccttca ctggctccag cctggagctg ggaccctgga gcccagaggt gccctccacc 180

ctggaggtgt acagctgcca cccaccacgg agcccggcca agaggctgca gctcacggag 240

ctacaagaac cagcagagct ggtggagtct gacggtgtgc ccaagcccag cttctggccg 300

acagcccaga actcgggggg ctcagcttac agtgaggaga gggatcggcc atacggcctg 360

gtgtccattg acacagtgac tgtgctagat gcagaggggc catgcacctg gccctgcagc 420

tgtgaggatg acggctaccc agccctggac ctggatgctg gcctggagcc cagcccaggc 480

ctagaggacc cactcttgga tgcagggacc acagtcctgt cctgtggctg tgtctcagct 540

ggcagccctg ggctaggagg gcccctggga agcctcctgg acagactaaa gccacccctt 600

gcagatgggg aggactgggc tgggggactg ccctggggtg gccggtcacc tggaggggtc 660

tcagagagtg aggcgggctc acccctggcc ggcctggata tggacacgtt tgacagtggc 720

tttgtgggct ctgactgcag cagccctgtg gagtgtgact tcaccagccc cggggacgaa 780

ggaccccccc ggagctacct ccgccagtgg gtggtcattc ctccgccact ttcgagccct 840

ggaccccagg ccagc 855

<210> 5

<211> 1614

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

atggggtggc tttgctctgg gctcctgttc cctgtgagct gcctggtcct gctgcaggtg 60

gcaagctctg ggaacatgaa ggtcttgcag gagcccacct gcgtctccga ctacatgagc 120

atctctactt gcgagtggaa gatgaatggt cccaccaatt gcagcaccga gctccgcctg 180

ttgtaccagc tggtttttct gctctccgaa gcccacacgt gtatccctga gaacaacgga 240

ggcgcggggt gcgtgtgcca cctgctcatg gatgacgtgg tcagtgcgga taactataca 300

ctggacctgt gggctgggca gcagctgctg tggaagggct ccttcaagcc cagcgagcat 360

gtgaaaccca gggccccagg aaacctgaca gttcacacca atgtctccga cactctgctg 420

ctgacctgga gcaacccgta tccccctgac aattacctgt ataatcatct cacctatgca 480

gtcaacattt ggagtgaaaa cgacccggca gatttcagaa tctataacgt gacctaccta 540

gaaccctccc tccgcatcgc agccagcacc ctgaagtctg ggatttccta cagggcacgg 600

gtgagggcct gggctcagtg ctataacacc acctggagtg agtggagccc cagcaccaag 660

tggcacaact cctacaggga gcccttcgag cagcacggct ggaaccctca cctgctgctt 720

ctcctcctgc ttgtcatagt cttcattcct gccttctgga gcctgaagac ccatccattg 780

tggaggctat ggaagaagat atgggccgtc cccagccctg agcggttctt catgcccctg 840

tacaagggct gcagcggaga cttcaagaaa tgggtgggtg cacccttcac tggctccagc 900

ctggagctgg gaccctggag cccagaggtg ccctccaccc tggaggtgta cagctgccac 960

ccaccacgga gcccggccaa gaggctgcag ctcacggagc tacaagaacc agcagagctg 1020

gtggagtctg acggtgtgcc caagcccagc ttctggccga cagcccagaa ctcggggggc 1080

tcagcttaca gtgaggagag ggatcggcca tacggcctgg tgtccattga cacagtgact 1140

gtgctagatg cagaggggcc atgcacctgg ccctgcagct gtgaggatga cggctaccca 1200

gccctggacc tggatgctgg cctggagccc agcccaggcc tagaggaccc actcttggat 1260

gcagggacca cagtcctgtc ctgtggctgt gtctcagctg gcagccctgg gctaggaggg 1320

cccctgggaa gcctcctgga cagactaaag ccaccccttg cagatgggga ggactgggct 1380

gggggactgc cctggggtgg ccggtcacct ggaggggtct cagagagtga ggcgggctca 1440

cccctggccg gcctggatat ggacacgttt gacagtggct ttgtgggctc tgactgcagc 1500

agccctgtgg agtgtgactt caccagcccc ggggacgaag gacccccccg gagctacctc 1560

cgccagtggg tggtcattcc tccgccactt tcgagccctg gaccccaggc cagc 1614

<210> 6

<211> 538

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val

1 5 10 15

Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro

20 25 30

Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met

35 40 45

Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu

50 55 60

Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly

65 70 75 80

Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala

85 90 95

Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys

100 105 110

Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn

115 120 125

Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser

130 135 140

Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala

145 150 155 160

Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn

165 170 175

Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys

180 185 190

Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr

195 200 205

Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser

210 215 220

Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln His Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu

225 230 235 240

Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys

245 250 255

Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser

260 265 270

Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe

275 280 285

Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly

290 295 300

Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys His

305 310 315 320

Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu

325 330 335

Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp

340 345 350

Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp

355 360 365

Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala

370 375 380

Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro

385 390 395 400

Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp

405 410 415

Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser

420 425 430

Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg

435 440 445

Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro

450 455 460

Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser

465 470 475 480

Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly

485 490 495

Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp

500 505 510

Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro

515 520 525

Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser

530 535

<210> 7

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

130 135 140

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Arg

<210> 8

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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tacagctacg cctactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcgccgg tggaggcggt 420

tcaggcggag gtggttctgg cggtggcgga tcggacatcg tgatgaccca gacccccctg 480

agcctgcccg tgacccccgg cgagcccgcc agcatcagct gccggagcag ccagagcctg 540

gtgcacagca acggcaacac ctacctgcag tggtacctgc agaagcccgg ccagagcccc 600

cagctgctga tctacaaggt gagcaaccgg ttcagcggcg tgcccgaccg gttcagcggc 660

agcggcagcg gcaccgactt caccctgaag atcagccggg tggaggccga ggacgtgggc 720

gtgtactact gcagccagag catctacgtg ccctacacct tcggccaggg caccaagctg 780

gagatcaaac gtaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840

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agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gccaacccgc 1080

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ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

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Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

130 135 140

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

245 250 255

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

260 265 270

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

275 280 285

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

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Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

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Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

325 330 335

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

340 345 350

Leu Pro Pro Arg

355

<210> 10

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

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Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

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65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

130 135 140

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

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Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

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275 280 285

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Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

305 310 315 320

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

325 330 335

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

340 345 350

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Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

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Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

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<210> 11

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

130 135 140

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

245 250 255

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

260 265 270

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

275 280 285

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

290 295 300

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

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Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

325 330 335

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

340 345 350

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys

355 360 365

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

370 375 380

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

385 390 395 400

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

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Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

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Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

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Pro Arg

465

<210> 12

<211> 511

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

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Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

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Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

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100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

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Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

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His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

245 250 255

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

260 265 270

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

275 280 285

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

290 295 300

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

305 310 315 320

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

325 330 335

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

340 345 350

Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

355 360 365

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

370 375 380

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

385 390 395 400

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

405 410 415

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

420 425 430

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln

435 440 445

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

450 455 460

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

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Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

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Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr

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Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val

85 90 95

Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe

1 5 10 15

Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp

20 25 30

Lys Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu

35 40 45

Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe

50 55 60

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65 70 75 80

Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys His Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg

85 90 95

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100 105 110

Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly

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Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile

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Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys

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Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu

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Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr

180 185 190

Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly

195 200 205

Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly

210 215 220

Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly

225 230 235 240

Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp

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Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu

260 265 270

Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu

275 280 285

Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln

290 295 300

Ala Ser

305

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<211> 3150

<212> DNA

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<400> 16

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gtgtactact gcagccagag catctacgtg ccctacacct tcggccaggg caccaagctg 780

gagatcaaac gtaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 960

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gccaacccgc 1080

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag 1140

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260

gagatggggg gaaagccgca gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440

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ctcatggatg acgtggtcag tgcggataac tatacactgg acctgtgggc tgggcagcag 1860

ctgctgtgga agggctcctt caagcccagc gagcatgtga aacccagggc cccaggaaac 1920

ctgacagttc acaccaatgt ctccgacact ctgctgctga cctggagcaa cccgtatccc 1980

cctgacaatt acctgtataa tcatctcacc tatgcagtca acatttggag tgaaaacgac 2040

ccggcagatt tcagaatcta taacgtgacc tacctagaac cctccctccg catcgcagcc 2100

agcaccctga agtctgggat ttcctacagg gcacgggtga gggcctgggc tcagtgctat 2160

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tcacctggag gggtctcaga gagtgaggcg ggctcacccc tggccggcct ggatatggac 3000

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<210> 17

<211> 3276

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggaggtgc agctggtgca gagcggcgcc gaggtgaaga agcccggcgc cagcgtgaag 120

gtgagctgca aggccagcgg ctacaccttc agcgactacg agatgcactg ggtgcggcag 180

gcccccggcc agggcctgga gtggatgggc gccatccacc ccggcagcgg cgacaccgcc 240

tacaaccagc ggttcaaggg ccgggtgacc atcaccgccg acaagagcac cagcaccgcc 300

tacatggagc tgagcagcct gcggagcgag gacaccgccg tgtactactg cgcccggttc 360

tacagctacg cctactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcgccgg tggaggcggt 420

tcaggcggag gtggttctgg cggtggcgga tcggacatcg tgatgaccca gacccccctg 480

agcctgcccg tgacccccgg cgagcccgcc agcatcagct gccggagcag ccagagcctg 540

gtgcacagca acggcaacac ctacctgcag tggtacctgc agaagcccgg ccagagcccc 600

cagctgctga tctacaaggt gagcaaccgg ttcagcggcg tgcccgaccg gttcagcggc 660

agcggcagcg gcaccgactt caccctgaag atcagccggg tggaggccga ggacgtgggc 720

gtgtactact gcagccagag catctacgtg ccctacacct tcggccaggg caccaagctg 780

gagatcaaac gtaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 960

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gccaacccgc 1080

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc caaacggggc 1140

agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1200

gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1260

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1320

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1380

gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1440

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1500

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1560

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgcgtga aacagacttt gaattttgac 1620

cttctgaagt tggcaggaga cgttgagtcc aaccctgggc ccatggggtg gctttgctct 1680

gggctcctgt tccctgtgag ctgcctggtc ctgctgcagg tggcaagctc tgggaacatg 1740

aaggtcttgc aggagcccac ctgcgtctcc gactacatga gcatctctac ttgcgagtgg 1800

aagatgaatg gtcccaccaa ttgcagcacc gagctccgcc tgttgtacca gctggttttt 1860

ctgctctccg aagcccacac gtgtatccct gagaacaacg gaggcgcggg gtgcgtgtgc 1920

cacctgctca tggatgacgt ggtcagtgcg gataactata cactggacct gtgggctggg 1980

cagcagctgc tgtggaaggg ctccttcaag cccagcgagc atgtgaaacc cagggcccca 2040

ggaaacctga cagttcacac caatgtctcc gacactctgc tgctgacctg gagcaacccg 2100

tatccccctg acaattacct gtataatcat ctcacctatg cagtcaacat ttggagtgaa 2160

aacgacccgg cagatttcag aatctataac gtgacctacc tagaaccctc cctccgcatc 2220

gcagccagca ccctgaagtc tgggatttcc tacagggcac gggtgagggc ctgggctcag 2280

tgctataaca ccacctggag tgagtggagc cccagcacca agtggcacaa ctcctacagg 2340

gagcccttcg agcagcacgg ctggaaccct cacctgctgc ttctcctcct gcttgtcata 2400

gtcttcattc ctgccttctg gagcctgaag acccatccat tgtggaggct atggaagaag 2460

atatgggccg tccccagccc tgagcggttc ttcatgcccc tgtacaaggg ctgcagcgga 2520

gacttcaaga aatgggtggg tgcacccttc actggctcca gcctggagct gggaccctgg 2580

agcccagagg tgccctccac cctggaggtg tacagctgcc acccaccacg gagcccggcc 2640

aagaggctgc agctcacgga gctacaagaa ccagcagagc tggtggagtc tgacggtgtg 2700

cccaagccca gcttctggcc gacagcccag aactcggggg gctcagctta cagtgaggag 2760

agggatcggc catacggcct ggtgtccatt gacacagtga ctgtgctaga tgcagagggg 2820

ccatgcacct ggccctgcag ctgtgaggat gacggctacc cagccctgga cctggatgct 2880

ggcctggagc ccagcccagg cctagaggac ccactcttgg atgcagggac cacagtcctg 2940

tcctgtggct gtgtctcagc tggcagccct gggctaggag ggcccctggg aagcctcctg 3000

gacagactaa agccacccct tgcagatggg gaggactggg ctgggggact gccctggggt 3060

ggccggtcac ctggaggggt ctcagagagt gaggcgggct cacccctggc cggcctggat 3120

atggacacgt ttgacagtgg ctttgtgggc tctgactgca gcagccctgt ggagtgtgac 3180

ttcaccagcc ccggggacga aggacccccc cggagctacc tccgccagtg ggtggtcatt 3240

cctccgccac tttcgagccc tggaccccag gccagc 3276

<210> 18

<211> 3144

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggaggtgc agctggtgca gagcggcgcc gaggtgaaga agcccggcgc cagcgtgaag 120

gtgagctgca aggccagcgg ctacaccttc agcgactacg agatgcactg ggtgcggcag 180

gcccccggcc agggcctgga gtggatgggc gccatccacc ccggcagcgg cgacaccgcc 240

tacaaccagc ggttcaaggg ccgggtgacc atcaccgccg acaagagcac cagcaccgcc 300

tacatggagc tgagcagcct gcggagcgag gacaccgccg tgtactactg cgcccggttc 360

tacagctacg cctactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcgccgg tggaggcggt 420

tcaggcggag gtggttctgg cggtggcgga tcggacatcg tgatgaccca gacccccctg 480

agcctgcccg tgacccccgg cgagcccgcc agcatcagct gccggagcag ccagagcctg 540

gtgcacagca acggcaacac ctacctgcag tggtacctgc agaagcccgg ccagagcccc 600

cagctgctga tctacaaggt gagcaaccgg ttcagcggcg tgcccgaccg gttcagcggc 660

agcggcagcg gcaccgactt caccctgaag atcagccggg tggaggccga ggacgtgggc 720

gtgtactact gcagccagag catctacgtg ccctacacct tcggccaggg caccaagctg 780

gagatcaaac gtaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 960

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 1020

ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1080

tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1140

aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1200

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1260

gggggaaagc cgcagagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1320

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1380

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1440

cacatgcagg ccctgccccc tcgcgtgaaa cagactttga attttgacct tctgaagttg 1500

gcaggagacg ttgagtccaa ccctgggccc atggggtggc tttgctctgg gctcctgttc 1560

cctgtgagct gcctggtcct gctgcaggtg gcaagctctg ggaacatgaa ggtcttgcag 1620

gagcccacct gcgtctccga ctacatgagc atctctactt gcgagtggaa gatgaatggt 1680

cccaccaatt gcagcaccga gctccgcctg ttgtaccagc tggtttttct gctctccgaa 1740

gcccacacgt gtatccctga gaacaacgga ggcgcggggt gcgtgtgcca cctgctcatg 1800

gatgacgtgg tcagtgcgga taactataca ctggacctgt gggctgggca gcagctgctg 1860

tggaagggct ccttcaagcc cagcgagcat gtgaaaccca gggccccagg aaacctgaca 1920

gttcacacca atgtctccga cactctgctg ctgacctgga gcaacccgta tccccctgac 1980

aattacctgt ataatcatct cacctatgca gtcaacattt ggagtgaaaa cgacccggca 2040

gatttcagaa tctataacgt gacctaccta gaaccctccc tccgcatcgc agccagcacc 2100

ctgaagtctg ggatttccta cagggcacgg gtgagggcct gggctcagtg ctataacacc 2160

acctggagtg agtggagccc cagcaccaag tggcacaact cctacaggga gcccttcgag 2220

cagcacggct ggaaccctca cctgctgctt ctcctcctgc ttgtcatagt cttcattcct 2280

gccttctgga gcctgaagac ccatccattg tggaggctat ggaagaagat atgggccgtc 2340

cccagccctg agcggttctt catgcccctg tacaagggct gcagcggaga cttcaagaaa 2400

tgggtgggtg cacccttcac tggctccagc ctggagctgg gaccctggag cccagaggtg 2460

ccctccaccc tggaggtgta cagctgccac ccaccacgga gcccggccaa gaggctgcag 2520

ctcacggagc tacaagaacc agcagagctg gtggagtctg acggtgtgcc caagcccagc 2580

ttctggccga cagcccagaa ctcggggggc tcagcttaca gtgaggagag ggatcggcca 2640

tacggcctgg tgtccattga cacagtgact gtgctagatg cagaggggcc atgcacctgg 2700

ccctgcagct gtgaggatga cggctaccca gccctggacc tggatgctgg cctggagccc 2760

agcccaggcc tagaggaccc actcttggat gcagggacca cagtcctgtc ctgtggctgt 2820

gtctcagctg gcagccctgg gctaggaggg cccctgggaa gcctcctgga cagactaaag 2880

ccaccccttg cagatgggga ggactgggct gggggactgc cctggggtgg ccggtcacct 2940

ggaggggtct cagagagtga ggcgggctca cccctggccg gcctggatat ggacacgttt 3000

gacagtggct ttgtgggctc tgactgcagc agccctgtgg agtgtgactt caccagcccc 3060

ggggacgaag gacccccccg gagctacctc cgccagtggg tggtcattcc tccgccactt 3120

tcgagccctg gaccccaggc cagc 3144

<210> 19

<211> 3009

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggaggtgc agctggtgca gagcggcgcc gaggtgaaga agcccggcgc cagcgtgaag 120

gtgagctgca aggccagcgg ctacaccttc agcgactacg agatgcactg ggtgcggcag 180

gcccccggcc agggcctgga gtggatgggc gccatccacc ccggcagcgg cgacaccgcc 240

tacaaccagc ggttcaaggg ccgggtgacc atcaccgccg acaagagcac cagcaccgcc 300

tacatggagc tgagcagcct gcggagcgag gacaccgccg tgtactactg cgcccggttc 360

tacagctacg cctactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcgccgg tggaggcggt 420

tcaggcggag gtggttctgg cggtggcgga tcggacatcg tgatgaccca gacccccctg 480

agcctgcccg tgacccccgg cgagcccgcc agcatcagct gccggagcag ccagagcctg 540

gtgcacagca acggcaacac ctacctgcag tggtacctgc agaagcccgg ccagagcccc 600

cagctgctga tctacaaggt gagcaaccgg ttcagcggcg tgcccgaccg gttcagcggc 660

agcggcagcg gcaccgactt caccctgaag atcagccggg tggaggccga ggacgtgggc 720

gtgtactact gcagccagag catctacgtg ccctacacct tcggccaggg caccaagctg 780

gagatcaaac gtaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 960

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1020

cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1080

gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag 1140

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1200

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1260

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1320

ccccctcgcg tgaaacagac tttgaatttt gaccttctga agttggcagg agacgttgag 1380

tccaaccctg ggcccatggg gtggctttgc tctgggctcc tgttccctgt gagctgcctg 1440

gtcctgctgc aggtggcaag ctctgggaac atgaaggtct tgcaggagcc cacctgcgtc 1500

tccgactaca tgagcatctc tacttgcgag tggaagatga atggtcccac caattgcagc 1560

accgagctcc gcctgttgta ccagctggtt tttctgctct ccgaagccca cacgtgtatc 1620

cctgagaaca acggaggcgc ggggtgcgtg tgccacctgc tcatggatga cgtggtcagt 1680

gcggataact atacactgga cctgtgggct gggcagcagc tgctgtggaa gggctccttc 1740

aagcccagcg agcatgtgaa acccagggcc ccaggaaacc tgacagttca caccaatgtc 1800

tccgacactc tgctgctgac ctggagcaac ccgtatcccc ctgacaatta cctgtataat 1860

catctcacct atgcagtcaa catttggagt gaaaacgacc cggcagattt cagaatctat 1920

aacgtgacct acctagaacc ctccctccgc atcgcagcca gcaccctgaa gtctgggatt 1980

tcctacaggg cacgggtgag ggcctgggct cagtgctata acaccacctg gagtgagtgg 2040

agccccagca ccaagtggca caactcctac agggagccct tcgagcagca cggctggaac 2100

cctcacctgc tgcttctcct cctgcttgtc atagtcttca ttcctgcctt ctggagcctg 2160

aagacccatc cattgtggag gctatggaag aagatatggg ccgtccccag ccctgagcgg 2220

ttcttcatgc ccctgtacaa gggctgcagc ggagacttca agaaatgggt gggtgcaccc 2280

ttcactggct ccagcctgga gctgggaccc tggagcccag aggtgccctc caccctggag 2340

gtgtacagct gccacccacc acggagcccg gccaagaggc tgcagctcac ggagctacaa 2400

gaaccagcag agctggtgga gtctgacggt gtgcccaagc ccagcttctg gccgacagcc 2460

cagaactcgg ggggctcagc ttacagtgag gagagggatc ggccatacgg cctggtgtcc 2520

attgacacag tgactgtgct agatgcagag gggccatgca cctggccctg cagctgtgag 2580

gatgacggct acccagccct ggacctggat gctggcctgg agcccagccc aggcctagag 2640

gacccactct tggatgcagg gaccacagtc ctgtcctgtg gctgtgtctc agctggcagc 2700

cctgggctag gagggcccct gggaagcctc ctggacagac taaagccacc ccttgcagat 2760

ggggaggact gggctggggg actgccctgg ggtggccggt cacctggagg ggtctcagag 2820

agtgaggcgg gctcacccct ggccggcctg gatatggaca cgtttgacag tggctttgtg 2880

ggctctgact gcagcagccc tgtggagtgt gacttcacca gccccgggga cgaaggaccc 2940

ccccggagct acctccgcca gtgggtggtc attcctccgc cactttcgag ccctggaccc 3000

caggccagc 3009

<210> 20

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile Asn Val Asn

20 25 30

Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Ile

35 40 45

Tyr His Gly Lys Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Asn Gln Tyr Glu Asn Ile Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val

115 120 125

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

130 135 140

Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp

145 150 155 160

Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Tyr Ile Ser

165 170 175

Tyr Arg Gly Arg Thr Gln Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser

180 185 190

Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser

195 200 205

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Gly Lys

210 215 220

Asn Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

225 230 235

<210> 21

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ile Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Tyr Asn Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile His Tyr Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu

50 55 60

Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Tyr Asn Gly Asn Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu

130 135 140

Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln

145 150 155 160

Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr

180 185 190

Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

245

<210> 22

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr

130 135 140

Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile

145 150 155 160

Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu

165 170 175

Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

180 185 190

Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val

210 215 220

Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr

225 230 235 240

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

245 250

<210> 23

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Arg Pro Phe Trp Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr

130 135 140

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

145 150 155 160

Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly

180 185 190

Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220

Gln Tyr Phe Asn Pro Pro Glu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

225 230 235 240

Glu Ile Lys Arg

<210> 24

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

cctatcttac taaccatcag cattttgagt tttttctctg tcgctctgtt ggtcatcttg 60

gcctgtgtgt tatgg 75

<210> 25

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

aaaaaaagga ttaagcctat cgtatggccc agtctccccg atcataagaa gactctggaa 60

catctttgta agaaaccaag aaaaaattta aatgtgagtt tcaatcctga aagtttcctg 120

gactgccaga ttcatagggt ggatgacatt caagctagag atgaagtgga aggttttctg 180

caagatacgt ttcctcagca actagaagaa tctgagaagc agaggcttgg aggggatgtg 240

cagagcccca actgcccatc tgaggatgta gtcatcactc cagaaagctt tggaagagat 300

tcatccctca catgcctggc tgggaatgtc agtgcatgtg acgcccctat tctctcctct 360

tccaggtccc tagactgcag ggagagtggc aagaatgggc ctcatgtgta ccaggacctc 420

ctgcttagcc ttgggactac aaacagcacg ctgccccctc cattttctct ccaatctgga 480

atcctgacat tgaacccagt tgctcagggt cagcccattc ttacttccct gggatcaaat 540

caagaagaag catatgtcac catgtccagc ttctaccaaa accag 585

<210> 26

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

atggggtggc tttgctctgg gctcctgttc cctgtgagct gcctggtcct gctgcaggtg 60

gcaagctctg ggaacatgaa ggtcttgcag gagcccacct gcgtctccga ctacatgagc 120

atctctactt gcgagtggaa gatgaatggt cccaccaatt gcagcaccga gctccgcctg 180

ttgtaccagc tggtttttct gctctccgaa gcccacacgt gtatccctga gaacaacgga 240

ggcgcggggt gcgtgtgcca cctgctcatg gatgacgtgg tcagtgcgga taactataca 300

ctggacctgt gggctgggca gcagctgctg tggaagggct ccttcaagcc cagcgagcat 360

gtgaaaccca gggccccagg aaacctgaca gttcacacca atgtctccga cactctgctg 420

ctgacctgga gcaacccgta tccccctgac aattacctgt ataatcatct cacctatgca 480

gtcaacattt ggagtgaaaa cgacccggca gatttcagaa tctataacgt gacctaccta 540

gaaccctccc tccgcatcgc agccagcacc ctgaagtctg ggatttccta cagggcacgg 600

gtgagggcct gggctcagtg ctataacacc acctggagtg agtggagccc cagcaccaag 660

tggcacaact cctacaggga gcccttcgag cagcacccta tcttactaac catcagcatt 720

ttgagttttt tctctgtcgc tctgttggtc atcttggcct gtgtgttatg gaaaaaaagg 780

attaagccta tcgtatggcc cagtctcccc gatcataaga agactctgga acatctttgt 840

aagaaaccaa gaaaaaattt aaatgtgagt ttcaatcctg aaagtttcct ggactgccag 900

attcataggg tggatgacat tcaagctaga gatgaagtgg aaggttttct gcaagatacg 960

tttcctcagc aactagaaga atctgagaag cagaggcttg gaggggatgt gcagagcccc 1020

aactgcccat ctgaggatgt agtcatcact ccagaaagct ttggaagaga ttcatccctc 1080

acatgcctgg ctgggaatgt cagtgcatgt gacgccccta ttctctcctc ttccaggtcc 1140

ctagactgca gggagagtgg caagaatggg cctcatgtgt accaggacct cctgcttagc 1200

cttgggacta caaacagcac gctgccccct ccattttctc tccaatctgg aatcctgaca 1260

ttgaacccag ttgctcaggg tcagcccatt cttacttccc tgggatcaaa tcaagaagaa 1320

gcatatgtca ccatgtccag cttctaccaa aaccag 1356

<210> 27

<211> 2892

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggaggtgc agctggtgca gagcggcgcc gaggtgaaga agcccggcgc cagcgtgaag 120

gtgagctgca aggccagcgg ctacaccttc agcgactacg agatgcactg ggtgcggcag 180

gcccccggcc agggcctgga gtggatgggc gccatccacc ccggcagcgg cgacaccgcc 240

tacaaccagc ggttcaaggg ccgggtgacc atcaccgccg acaagagcac cagcaccgcc 300

tacatggagc tgagcagcct gcggagcgag gacaccgccg tgtactactg cgcccggttc 360

tacagctacg cctactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcgccgg tggaggcggt 420

tcaggcggag gtggttctgg cggtggcgga tcggacatcg tgatgaccca gacccccctg 480

agcctgcccg tgacccccgg cgagcccgcc agcatcagct gccggagcag ccagagcctg 540

gtgcacagca acggcaacac ctacctgcag tggtacctgc agaagcccgg ccagagcccc 600

cagctgctga tctacaaggt gagcaaccgg ttcagcggcg tgcccgaccg gttcagcggc 660

agcggcagcg gcaccgactt caccctgaag atcagccggg tggaggccga ggacgtgggc 720

gtgtactact gcagccagag catctacgtg ccctacacct tcggccaggg caccaagctg 780

gagatcaaac gtaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 960

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gccaacccgc 1080

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag 1140

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260

gagatggggg gaaagccgca gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctg 1500

aagttggcag gagacgttga gtccaaccct gggcccatgg ggtggctttg ctctgggctc 1560

ctgttccctg tgagctgcct ggtcctgctg caggtggcaa gctctgggaa catgaaggtc 1620

ttgcaggagc ccacctgcgt ctccgactac atgagcatct ctacttgcga gtggaagatg 1680

aatggtccca ccaattgcag caccgagctc cgcctgttgt accagctggt ttttctgctc 1740

tccgaagccc acacgtgtat ccctgagaac aacggaggcg cggggtgcgt gtgccacctg 1800

ctcatggatg acgtggtcag tgcggataac tatacactgg acctgtgggc tgggcagcag 1860

ctgctgtgga agggctcctt caagcccagc gagcatgtga aacccagggc cccaggaaac 1920

ctgacagttc acaccaatgt ctccgacact ctgctgctga cctggagcaa cccgtatccc 1980

cctgacaatt acctgtataa tcatctcacc tatgcagtca acatttggag tgaaaacgac 2040

ccggcagatt tcagaatcta taacgtgacc tacctagaac cctccctccg catcgcagcc 2100

agcaccctga agtctgggat ttcctacagg gcacgggtga gggcctgggc tcagtgctat 2160

aacaccacct ggagtgagtg gagccccagc accaagtggc acaactccta cagggagccc 2220

ttcgagcagc accctatctt actaaccatc agcattttga gttttttctc tgtcgctctg 2280

ttggtcatct tggcctgtgt gttatggaaa aaaaggatta agcctatcgt atggcccagt 2340

ctccccgatc ataagaagac tctggaacat ctttgtaaga aaccaagaaa aaatttaaat 2400

gtgagtttca atcctgaaag tttcctggac tgccagattc atagggtgga tgacattcaa 2460

gctagagatg aagtggaagg ttttctgcaa gatacgtttc ctcagcaact agaagaatct 2520

gagaagcaga ggcttggagg ggatgtgcag agccccaact gcccatctga ggatgtagtc 2580

atcactccag aaagctttgg aagagattca tccctcacat gcctggctgg gaatgtcagt 2640

gcatgtgacg cccctattct ctcctcttcc aggtccctag actgcaggga gagtggcaag 2700

aatgggcctc atgtgtacca ggacctcctg cttagccttg ggactacaaa cagcacgctg 2760

ccccctccat tttctctcca atctggaatc ctgacattga acccagttgc tcagggtcag 2820

cccattctta cttccctggg atcaaatcaa gaagaagcat atgtcaccat gtccagcttc 2880

taccaaaacc ag 2892

<210> 28

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val

1 5 10 15

Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro

20 25 30

Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met

35 40 45

Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu

50 55 60

Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly

65 70 75 80

Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala

85 90 95

Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys

100 105 110

Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn

115 120 125

Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser

130 135 140

Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala

145 150 155 160

Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn

165 170 175

Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys

180 185 190

Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr

195 200 205

Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser

210 215 220

Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln His Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile

225 230 235 240

Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu

245 250 255

Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His

260 265 270

Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn

275 280 285

Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val

290 295 300

Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr

305 310 315 320

Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp

325 330 335

Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu

340 345 350

Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser

355 360 365

Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg

370 375 380

Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser

385 390 395 400

Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser

405 410 415

Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr

420 425 430

Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe

435 440 445

Tyr Gln Asn Gln

450

<210> 29

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 30

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

acc 63

<210> 31

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggccaaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 32

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 33

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339

Claims (33)

1.一种融合蛋白，包含IL-4受体(IL-4R)胞外域或其变体和IL-21受体(IL-21R)胞内域或其变体。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含：

i)IL-4受体(IL-4R)胞外域；

ii)跨膜域，优选IL-4R的跨膜区或者IL-21R的跨膜区；和

iii)IL-21受体(IL-21R)胞内域。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL-4R的胞外域的编码核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL-4R的胞外域的编码核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的序列。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL-21R的胞内域的编码核苷酸序列与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL-21R的胞内域的编码核苷酸序列是SEQ ID NO:4所示的序列。

7.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白与SEQ ID NO.6所示的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。

8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:6所示的序列。

9.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL-4R选自IL-4Rα、IL-4Rγc。

10.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL-4R可以结合IL-4或者突变型IL-4或者IL-13或者突变型IL-13；优选地，所述IL-4R结合IL-4或者突变型IL-4。

11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其特征在于，所述突变型IL-4包含KFR变体、KF变体、或RGA变体。

12.根据权利要求1-11任一所述的融合蛋白，其特征在于，各结构域直接或通过接头分子连接在一起。

13.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-12中任一项所述的融合蛋白。

14.一种载体，所述载体包含权利要求13所述的核酸分子。

15.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求14所述的载体。

16.一种免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞表达权利要求1-12任一所述的融合蛋白，或包含权利要求13所述的核酸分子或权利要求14所述的载体。

17.如权利要求16所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述的免疫效应细胞为自体细胞或者同种异体细胞。

18.根据权利要求16所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞还表达外源性的受体，该外源性的受体具有特异结合肿瘤抗原的第二胞外结合域、第二跨膜域、及第二胞内域。

19.根据权利要求18所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述的融合蛋白为组成性表达或诱导性表达。

20.如权利要求18或19所述的免疫效应细胞，其特征在于：所述外源性受体选自：嵌合抗原受体(CAR)、修饰的T细胞(抗原)受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)或其组合。

21.如权利要求18-20任一所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括：

(i)特异性结合抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜域、CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ；或

(ii)特异性结合抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ；或

(iii)特异性结合抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜域、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ。

22.根据权利要求18-21任一所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述的肿瘤抗原包括：

促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1；神经节苷脂GD3；Tn抗原；CD19；CD20；CD 22；CD 30；CD 70；CD 123；CD 138；CD33；CD44；CD44v7/8；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)，B7H6；KIT(CD117)；白介素13受体亚单位α(IL-13Rα)；白介素11受体α(IL-11Rα)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；癌胚抗原(CEA)；NY-ESO-1；HIV-1Gag；MART-1；gp100；酪氨酸酶；间皮素；EpCAM；蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)；血管内皮生长因子受体；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)，MUC6；表皮生长因子受体家族及其突变体(EGFR，EGFR2，ERBB3，ERBB4，EGFRvIII)；神经细胞粘附分子(NCAM)；碳酸酐酶IX(CAIX)；LMP2；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer；TGS5；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体；肿瘤血管内皮标记25 1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)；Claudin 6，Claudin18.2、Claudin18.1；ASGPR1；CDH16；5T4；8H9；αvβ6整合素；B细胞成熟抗原(BCMA)；CA9；κ轻链(kappa lightchain)；CSPG4；EGP2，EGP40；FAP；FAR；FBP；胚胎型AchR；HLA-A1，HLA-A2；MAGEA1，MAGE3；KDR；MCSP；NKG2D配体；PSC1；ROR1；Sp17；SURVIVIN；TAG72；TEM1；纤连蛋白；腱生蛋白；肿瘤坏死区的癌胚变体；G蛋白偶联受体C类5组-成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受5体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；p53突变10体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)；由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OYTES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

23.根据权利要求18-21任一所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述的肿瘤抗原为实体瘤抗原。

24.根据权利要求23所述的免疫效应细胞，所述实体瘤选自结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，肿瘤血管发生，脊椎肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌；优选地，所述实体瘤选自肝癌，肺癌，鳞状细胞癌。

25.如权利要求18-24任一所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述第二胞外结合域具有与SEQ ID NO:7、20、21、22、或23所示序列至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列。

26.根据权利要求20-25任一所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:9、10、11、12所示序列或与SEQ ID NO:9、10、11、12所示序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

27.根据权利要求20-26任一所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述的嵌合抗原受体及所述的融合蛋白由SEQ ID NO：16、17、18、或19所示核苷酸序列编码或由与SEQ ID NO：16、17、18、或19具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列编码。

28.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-12中任一项所述的融合蛋白、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14所述的载体、权利要求15所述的宿主细胞、或者权利要求16-27任一所述的免疫效应细胞。

29.一种诱导细胞死亡的方法，所述方法包括向需要的受试者施用权利要求1-12中任一项所述的融合蛋白、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14所述的载体、权利要求15所述的宿主细胞、或者权利要求16-27任一所述的免疫效应细胞。

30.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向需要的受试者施用：权利要求1-12中任一项所述的融合蛋白、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14所述的载体、权利要求15所述的宿主细胞、权利要求16-27任一所述的免疫效应细胞、或者权利要求28所述的药物组合物。

31.权利要求1-12中任一项所述的融合蛋白、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14所述的载体、权利要求15所述的宿主细胞、或者权利要求16-27任一所述的免疫效应细胞、或权利要求28所述的药物组合物用于在有此需要的患者中诱导细胞死亡、或者治疗癌症、或者治疗过度增生性或者分化性紊乱的应用。

32.根据权利要求29或30所述的方法或者权利要求31所述的应用，其中，所述受试者是人类。

33.权利要求1-12中任一项所述的融合蛋白、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14所述的载体、权利要求15所述的宿主细胞或者权利要求16-27任一所述的免疫效应细胞在制备药物中的用途，所述药物用于在有此需要的患者中诱导细胞死亡、或者治疗癌症、或者治疗过度增生性或者分化性紊乱。