CN110464729B - 天然酸性糖脂分子在中和产气荚膜梭菌Epsilon毒素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然酸性糖脂分子在中和产气荚膜梭菌Epsilon毒素中的应用，特别是其在制备预防或治疗动物的产气荚膜梭菌感染相关药物或试剂中的应用属于生物医学领域。本发明保护天然酸性糖脂分子唾液酸、神经节苷脂和硫苷脂中的一种或几种，具有很好的Epsilon毒素中和效果，对动物致命的产气荚膜梭菌感染还是对其外毒素Epsilon毒素的侵染都具有很好的治疗效果。本发明涉及的三类天然酸性分子唾液酸、神经节苷脂和硫苷脂具有分子结构简单、价格经济、市面上容易获取等有益特点，天然酸性糖脂分子有望成为替代抗生素或抗体用于预防和治疗产气荚膜梭菌感染，在畜牧兽医上具有很好的应用前景。

Description

天然酸性糖脂分子在中和产气荚膜梭菌Epsilon毒素中的 应用

技术领域：

本发明涉及到天然酸性糖脂分子在中和产气荚膜梭菌Epsilon毒素中的应用，特别是其在制备预防或治疗动物的产气荚膜梭菌感染相关药物或试剂中的应用，属于生物医学领域。

背景技术：

细菌感染性疾病一直是严重威胁人或其它动物生命的头号敌人。产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是引起人畜致死性气性坏疽及肠毒血症等疾病的主要致病菌，因此对人类健康及畜牧业造成了极大危害。特别在畜牧业上，由产Epsilon毒素的产气荚膜梭菌引发的动物梭菌病以“发病急、病程快、死亡率高”为特征，给广大牧民及养殖户带来了极大困扰和恐惧。已经确凿产气荚膜梭菌产生的外毒素是其主要的致病因子。截至目前，已发现产气荚膜梭菌可产生至少20种外毒素，包括α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν毒素等，其中最主要的是α(alpha)、β(beta)、ε(epsilon)和ι(iota)毒素。Epsilon毒素(ETXs)主要由B型和D型产气荚膜梭菌产生，它是迄今为止发现的毒性排名第三的细菌外毒素，其毒性仅次于肉毒毒素和破伤风毒素。正因如此，Epsilon毒素已被美国疾病预防控制中心(CDC)列为具有潜在生物恐怖威胁的B类生物战剂。

产气荚膜梭菌感染动物后，会在动物肠道中大量繁殖并产生致命外毒素Epsilon毒素，它可使肠粘膜通透性增加，进而使得大量的毒素进入血液循环，从而对各器官造成损伤，最终造成动物快速死亡。特别是其所致动物疾病能够在很短时间内导致动物死亡，从动物出现症状至死亡这个过程的时间更短，留给感染后动物的救治时间很有限。因此，寻找一些能够中和Epsilon毒素的物质(分子)对于治疗人或动物的产气荚膜梭菌感染至关重要！

目前对于产气荚膜梭菌感染的治疗策略主要集中于抗生素治疗。绝大多数抗生素抑菌的机制在于：作用于细菌本身，包括作用于细菌细胞壁合成、DNA复制/转录等过程。然而这种治疗策略带来的最大问题就是细菌耐药，从而导致了大量耐药细菌的出现，大大增加了疾病的治疗难度和经济负担。因此，寻求抗细菌感染的新型治疗策略势在必行。

针对致病菌分泌的外毒素进行抗细菌感染治疗是一种非常新颖的策略。而这种治疗策略的关键在于：寻找一些能够高效快速中和致病菌致命外毒素的活性分子。

发明人基于长期的工作积累，根据体外抑制活性实验筛选出3类酸性糖脂分子，分别是唾液酸、神经节苷脂和硫苷脂，发现这3类物质对Epsilon毒素具有显著的中和活性，并能够保护产气荚膜梭菌感染的动物，降低死亡率。经文献检索，未发现有相似的记载。

发明内容：

本发明共有两个目的，其中一个目的为筛选出能够中和致命外毒素Epsilon毒素的糖脂分子。由于糖脂的种类众多，因此本发明基于发明人前期工作积累，优先在中性和酸性糖脂中进行筛选，实验所用的糖脂分子均为含有多种不同单体分子的混合物，最终发现只有3类酸性糖脂分子(如唾液酸、神经节苷脂和硫苷脂的)能够完全抑制并中和Epsilon毒素的毒性，而像唾液酸这些酸性糖脂分子价格比较经济，容易获得；在此基础上，实验还使用了神经节苷脂、硫苷脂及唾液酸单体分子，结果表明：无论是单体分子，还是含有多种不同单体分子的混合物对Epsilon毒素的毒性具有同样的中和效果。因此，本发明保护然酸性糖脂分子在中和产气荚膜梭菌Epsilon毒素中的应用，所述的天然酸性糖脂分子为唾液酸、神经节苷脂和硫苷脂中的一种或几种。

本发明的另一个目的是提供这3类酸性糖脂分子在中和致命细菌毒素Epsilon毒素中的应用。实施唾液酸、神经节苷脂及硫苷脂均能抑制并中和Epsilon毒素的毒性，并能够延长被产气荚膜梭菌感染动物的生存率，因此具有保护动物抵御致命细菌感染的用途。因此，天然酸性糖脂分子唾液酸、神经节苷脂、硫苷脂可在制备预防或治疗动物的产气荚膜梭菌感染相关药物或试剂中的应用。

本发明涉及到的中性及酸性糖脂分子都是已经得到明确报道的分子，分子结构清晰，价格经济实惠，因此获取简单。本发明中涉及到的Epsilon毒素的制备方法已经较为成熟，主要通过天然纯化或重组表达的方式获取。Epsilon毒素对哺乳动物最通常的毒性体现为红细胞溶血和对犬肾上皮细胞(MDCK)的细胞毒性，因此上述两种方法用于本发明中酸性糖脂分子的筛选。该筛选方法符合毒素研究领域的经典方法范畴。根据对Epsilon毒素抑制活性的比较，我们成功筛选到如上所述三类酸性糖脂分子。实验所用的糖脂分子均为含有多种不同单体分子的混合物。面所述具有中和Epsilon毒素毒性的三类酸性糖脂分子的筛选方法，所述这三类酸性糖脂分子在中和致命细菌毒素Epsilon毒素中的用途。在此基础上，实验还使用了神经节苷脂、硫苷脂及唾液酸单体分子，三种单体分子具有STRUC ID NO：1、STRUC ID NO：2和STRUC ID NO：3所示分子结构的酸性糖脂分子唾液酸、神经节苷脂和硫苷脂：

唾液酸(STRUC ID NO：1)：

神经节苷脂(STRUC ID NO：2)：

硫苷脂(STRUC ID NO：3)：

三类酸性糖脂分子唾液酸、神经节苷脂和硫苷脂在Epsilon毒素引起的红细胞溶血实验、MDCK细胞毒性实验、小鼠肠道Epsilon毒素侵染实验及小鼠肠道产气荚膜梭菌感染实验中都显现出了对Epsilon毒素完全的抑制活性及中和活性，表现为红细胞的溶血丧失，MDCK细胞的死亡降低、细菌感染后小鼠的生存率显著延长等。揭示本发明中筛选到的这三类酸性分子(唾液酸、神经节苷脂和硫苷脂)单体分子或混合物，无论是对动物致命的产气荚膜梭菌感染还是对其外毒素Epsilon毒素的侵染都具有很好的治疗效果，在畜牧兽医上具有很好的应用前景。

本发明的有益效果在于：

1.本发明涉及的三类酸性糖脂分子唾液酸、神经节苷脂和硫苷脂对致命毒素Epsilon毒素中和效果非常好。无论是单体分子，还是实验中使用的含有多种单体分子的混合物具有同样的中和效果，提示神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸三类酸性糖脂分子其中一种或多种对Epsilon毒素具有较好的中和能力，而且对产气荚膜梭菌Epsilon毒素侵染后动物保护效果强效。因此，这三类酸性糖脂分子有望代替抗体或抗生素成为预防和治疗产气荚膜梭菌感染的重要试剂或药物。

2.本发明涉及的三类酸性分子唾液酸、神经节苷脂和硫苷脂具有分子结构简单、价格经济、市面上容易获取，在畜牧兽医上具有很好的应用前景。

附图说明：

图1为本发明中Epsilon毒素的G75凝胶过滤层析纯化峰图，

图2为本发明中Epsilon毒素的G75凝胶过滤层析纯化SDS-PAGE电泳图；

图3为本发明中Epsilon毒素的Resource Q阴离子交换层析纯化峰图及SDS-PAGE电泳图。

图4为本发明中Epsilon毒素的Resource Q阴离子交换层析纯化SDS-PAGE电泳图。

图5为本发明中Epsilon毒素经Resource Q阴离子交换层析分离后I峰的蛋白免疫印迹杂交结果图。

图6为本发明三类酸性糖脂分子唾液酸、神经节苷脂和硫苷脂对Epsilon毒素引起红细胞溶血的抑制活性图。

图7为本发明三类酸性糖脂分子唾液酸、神经节苷脂和硫苷脂对Epsilon毒素引起MDCK细胞毒性的抑制活性图。

图8为本发明三类酸性糖脂分子唾液酸、神经节苷脂和硫苷脂分别对Epsilon毒素侵染后小鼠的保护作用及小鼠的生存曲线图。

图9为本发明三类酸性糖脂分子神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸分别对D型产气荚膜梭菌感染后小鼠的保护作用及小鼠的生存曲线图。

具体实施方式

实施例1：产气荚膜梭菌(NCTC 8346)Epsilon毒素的分离纯化与鉴定

1、产气荚膜梭菌培养及上清的收集

产气荚膜梭菌(NCTC 8346)购自于英国微生物菌种保藏中心，首先用灭菌过的接种环取少许菌落，接种于5ml灭菌的巯基乙酸盐肉汤(1L配方中需加入胰蛋白胨15g、酵母提取物5g、L-胱氨酸0.5g、巯基乙酸钠0.5g、氯化钠2.5g、葡萄糖5.5g，pH7.1)，置于37℃摇床培养过夜；随后将这5ml的起始培养物接种到100ml的TGY培养基(含3％大豆胰蛋白酶肉汤、2％葡萄糖、1％酵母提取物、0.1％巯基乙酸钠)，在37℃厌氧培养16-18h后，将其接种到3.5L新鲜配制的TGY培养基中，37℃继续培养12h。8000rpm/min离心20min收集培养上清。

2、Epsilon原毒素的分离纯化

向上一步收集到的培养细菌上清中加入饱和硫酸铵后置于4℃静置1h，然后在4℃，12000rpm/min离心30min收集蛋白沉淀，收集的蛋白沉淀用冷的磷酸盐缓冲液(0.1MKH₂PO₄,0.1M Na₂HPO₄,pH 7.3)重悬并用此缓冲液在4℃条件下透析过夜，确保将缓冲体系置换成磷酸盐缓冲液，透析后的蛋白样品浓缩至100mg/ml，备用。

第一步：SephadexG75凝胶过滤层析，取1ml上述蛋白样品上预先用磷酸盐缓冲液平衡24小时的Sephadex G75(GE Healthcare，超细)柱子(长度122cm，内径宽度1.4cm)，用同样的缓冲液进行洗脱，流速为1.5ml/10min，每20min收集一管，测定其在280nm下的吸光度，所得的分离纯化峰图如图1所示，而后分别各取50μl上述收集到的3个峰，与10μl的6x蛋白上样缓冲液混匀煮沸5min后，每个峰点样25μl于4-12％的梯度聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，结果图如图2所示。其中Epsilon原毒素存在于第III峰，见图1上图箭头所示峰和图2电泳图。

第二步：Resource Q阴离子交换层析，收集第一步分离到的第III峰，经真空冷冻干燥后获得冻干粉，然后用A液(20mM Tris-HCl，pH7.8)溶解，通过

Explore分离纯化系统进行分离纯化。样品上样于预先用A液平衡好的Resource Q阳离子交换柱(GEHealthcare产品，1ml)在流速为1ml/min的条件下，用B液(20mM Tris-HCl，1M NaCl,pH7.8)在线性梯度(0-100％in 100min)下进行洗脱，监测波长为280nm。所得的分离峰图如图3所示。按照上一步所述的SDS-PAGE具体实验方法，对收集到的I峰进行SDS-PAGE，结果如图3所示。其中纯化的Epsilon原毒素存在于第I峰，见图3上图箭头所示峰和图4电泳图。

3、Epsilon原毒素的蛋白免疫印迹杂交鉴定

通过之前做的Epsilon毒素的兔多克隆抗体，对上述纯化到的Epsilon原毒素进行蛋白免疫印迹杂交实验，将上述SDS-PAGE电泳后的胶先在转膜缓冲液中浸泡15min，随后将胶上的所有蛋白在200mA电流下，持续1.5h转印到0.45μm的PVDF膜上，随后将此PVDF膜用3％牛血清白蛋白常温封闭2h，然后孵育1:1000稀释后的抗Epsilon毒素的兔源多克隆抗体，置于4℃过夜，接下来将膜取出并用含1‰Tween-20的TBS缓冲液洗膜30min，而后孵育1:5000稀释好的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的抗体，常温孵育2h，最后洗膜后进行暗室曝光，结果如图5所示。表明Resource Q分离的I峰即为纯化后的Epsilon原毒素。

从产气荚膜梭菌(NCTC 8346)分泌的外毒素中纯化得到的Epsilon原毒素蛋白具有下述序列表中的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

实施例2：对Epsilon毒素毒性具有中和能力的三类酸性糖脂分子的筛选及中和能力验证

1、Epsilon原毒素的酶切激活

由于Epsilon毒素发挥毒性作用的前提是Epsilon原毒素要经过胰蛋白酶的酶切变成有活性的Epsilon毒素。所以，在研究酸性糖脂分子对Epsilon毒素毒性中和活性之前，首先进行Epsilon原毒素的胰蛋白酶酶切，具体为1μg的Epsilon原毒素对应12.5μg的胰蛋白酶，混合后置于37℃处理1h，随后向其中加入胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶的活性。因此，后续的活性实验中均是以此Epsilon毒素/胰蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂混合物来代表Epsilon毒素，而以胰蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂的混合物作为对照。

2、三类能够中和Epsilon毒素毒性的酸性糖脂分子的筛选

如前所述，我们采用对Epsilon毒素引起人红细胞溶血的抑制活性作为筛选具有Epsilon毒素毒性中和能力糖脂分子的评价标准。健康成年人红细胞取自于昆明市血液中心，使用之前先用0.9％NaCl洗涤3次，最后用0.9％NaCl将红细胞沉淀重悬成8％的浓度，准备进行溶血实验。溶血实验的具体步骤如下：

第一步：不同糖脂类分子与Epsilon毒素的孵育。从美国Matreya公司购买鞘氨醇(货号1802)、神经酰胺(货号1056)、岩藻糖脂(货号1526)、乳糖神经酰胺(货号1517)、脑苷脂(货号1050)、鞘磷脂(货号1051)、神经节苷脂(货号1065)、硫苷脂(货号1049)，从美国Avanti公司购买的单半乳糖二酰甘油(货号840528)以及从Sigma-Aldrich公司购买的唾液酸(货号A2388)共10种中性以及酸性的糖脂分子，因为我们购买的神经节苷脂、硫苷脂及唾液酸均为含有多种不同单体分子的混合物，其中神经节苷脂包含至少20种单体分子，硫苷脂至少2种，唾液酸至少2种，所以我们在实验中也使用了神经节苷脂、硫苷脂及唾液酸的部分单体分子进行了同样实验，具体为：神经节苷脂GM1、GM2、GM3、GM4、GD1a、GD1b、GD3和GT1b；硫苷脂18:0(2R-OH)和18:0(2S-OH)；唾液酸Neu5Ac和Neu5Gc。上述各种糖脂分子均使用无水乙醇将其溶解成200μM的浓度，而后用0.9％NaCl将这10种分子分别稀释到150到1050nM的浓度梯度，并分别与终浓度为25nM的Epsilon毒素混合，后置于37℃水浴中静置30min。

第二步：溶血活性抑制检测。将上述孵育完的各样品加入到已经稀释好的8％的红细胞悬液中，轻轻混匀后置于37℃水浴中放置30min，后取出3000rpm/min离心5min收集离心后上清，使用多功能酶标仪(型号：InfiniteM200Pro,瑞士帝肯公司)在540nm波长处测定光吸收值。以不加Epsilon毒素的胰蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂溶液作为阴性对照，将其上清液在540nm波长处吸收值设定为0％溶血；只有Epsilon毒素不加各种脂孵育的样品为阳性对照，将其上清在540nm波长处的光吸收值作为100％溶血。分别以此计算加入不同脂与Epsilon毒素混合后溶血率的变化。各种不同的脂与Epsilon毒素作用后红细胞溶血率的变化如图6所示。

实验结果表明：所选取的10类不同的糖脂分子中，只有神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸三类酸性糖脂分子或其单体分子对Epsilon毒素引起的红细胞溶血具有显著的抑制效果，推测神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸三类酸性糖脂分子对Epsilon毒素具有较好的中和能力。

3、神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸对Epsilon毒素引起的MDCK细胞毒性的抑制作用研究

溶血抑制实验已经发现：只有神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸这三类酸性糖脂分子对Epsilon毒素具有显著的抑制和中和效果。那么这三类酸性糖脂分子是否也会抑制Epsilon毒素引起的MDCK细胞毒性呢？我们的具体实验方法如下：将MDCK细胞接种于96孔培养板中，生长在含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，置于含5％CO2的37℃恒温箱中培养，生长至80％融合度，进行实验。实验中三类酸性糖脂分子(神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸)与Epsilon毒素孵育的浓度及时间同溶血抑制实验中的设置，随后将孵育后的各样品加入到MDCK细胞中，每个处理组做5个复孔，在37℃条件下孵育1h，结束后，吸除每个孔中的Epsilon毒素与各种脂的混合物，加入MTS试剂，根据MTS细胞活力检测试剂盒中的操作步骤进行细胞活力的检测。以不加Epsilon毒素的胰蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂溶液作为阴性对照，其细胞活力设为100％，其他三类脂与Epsilon毒素孵育组中细胞活力均以此来进行计算。神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸这三类酸性糖脂分子分别与Epsilon毒素作用后MDCK细胞活力的变化如图7所示。

实验结果表明：神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸这三类酸性糖脂分子对Epsilon毒素引起的MDCK细胞毒性具有显著的抑制效果，有效降低了Epsilon毒素引起的MDCK细胞的死亡率，同样的，神经节苷脂、硫苷脂及唾液酸单体分子与实验中使用的混合物具有同样的中和效果，提示神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸三类酸性糖脂分子对Epsilon毒素具有较好的中和能力。

实施例3：神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸对Epsilon毒素侵染后小鼠的保护作用

如前所述，在体外实验上神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸均能有效抑制并中和Epsilon毒素的毒性，推测这三类酸性糖脂分子有望成为良好的细菌致命毒素的解毒剂。为了验证这一推测，我们拟在动物体内水平上进行这三类酸性糖脂分子对Epsilon毒素侵染动物的保护作用研究，具体实验设计如下：

实验动物选取体重20±2g的C57BL/6J成年雄性小鼠48只，将其随机分成6组，每组8只，分别是：(1)正常饲喂组，给予本组8只小鼠正常喂水喂食；(2)Epsilon毒素处理组，本组小鼠按照50mg/kg的剂量每天给予Epsilon毒素灌肠刺激，以刺激形成肠道毒素侵染症状，主要表现为小鼠血便、腹泻等症状；(3)Epsilon毒素+神经节苷脂联合处理组，本组小鼠前3天给予50mg/kg的Epsilon毒素灌肠，从第4天开始给予Epsilon毒素和0.1mg/kg剂量的神经节苷脂混合物，并持续给予4天；(4)Epsilon毒素+硫苷脂联合处理组，同样是本组小鼠前3天给予50mg/kg的Epsilon毒素灌肠，从第4天开始给予Epsilon毒素和0.1mg/kg剂量的硫苷脂混合物，并持续给药4天；(5)Epsilon毒素+唾液酸联合处理组，同样是本组小鼠前3天给予50mg/kg的Epsilon毒素灌肠，从第4天开始给予Epsilon毒素和1mg/kg剂量的唾液酸混合物，并持续给药4天；(6)Epsilon毒素+Epsilon毒素抗体联合处理组，同样是本组小鼠前3天给予50mg/kg的Epsilon毒素灌肠，从第4天开始给予100mg/kg的Epsilon毒素抗体(抗Epsilon毒素的多克隆抗体由军事医学科学院王景林教授提供，该抗体的效价为1:100000，相当于0.1μg的抗体可中和5μg的Epsilon毒素)灌肠，并连续给予4天。上述6组小鼠都是连续观察一周，分别记录每天小鼠的死亡数，并计算小鼠7天的存活情况。神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸这三类酸性糖脂分子对Epsilon毒素侵染小鼠后小鼠的存活情况如图8所示。

实验结果表明：神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸这三类酸性糖脂分子可以有效降低Epsilon毒素对小鼠肠道的毒害作用，从而显著延长Epsilon毒素侵染后小鼠的生存率，进一步表明神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸三类酸性糖脂分子在动物体内同样具有很好的Epsilon毒素中和能力。同时，还表明抗体的保护作用强，但使用的抗体剂量大大高于糖脂分子的剂量。因此，天然酸性糖脂分子有望成为替代抗体用于预防和治疗产气荚膜梭菌感染。

实施例4：神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸对产Epsilon毒素的D型产气荚膜梭菌感染后小鼠的保护作用

为了进一步在动物水平上验证神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸这三类酸性糖脂分子对Epsilon毒素的抑制及中和能力，我们模拟家养动物感染产气荚膜梭菌后导致的肠毒血症的疾病模型，以观察上述三类酸性糖脂分子是否具有保护产气荚膜梭菌感染后小鼠的作用。我们的实验设计方案如下：

实验动物选取体重20±2g的C57BL/6J成年雄性小鼠48只，同样是将这48只小鼠随机分成6组，每组8只。第一组：正常组，给予本组8只小鼠正常喂水喂食，不加任何处理；第二组：D型产气荚膜梭菌感染组，按照D型产气荚膜梭菌标准的厌氧培养方式对其扩增培养，随后离心收集D型产气荚膜梭菌的菌体沉淀，并用0.9％NaCl重悬菌体沉淀，调整细菌浓度为2x10⁸cfu/ml。然后给予每只小鼠灌胃1ml上述浓度的D型产气荚膜梭菌，每天灌胃一次，连续灌胃7天；第三组：D型产气荚膜梭菌+神经节苷脂混合处理组，本组中先是给每只小鼠灌胃1ml的浓度为2x10⁸cfu/ml的D型产气荚膜梭菌，连续灌胃3天，以预先造成小鼠的肠毒血症症状，从第四天起开始给予0.5mg/kg剂量的神经节苷脂进行灌胃，并且连续灌胃4天；第四组：D型产气荚膜梭菌+硫苷脂混合处理组，同上，本组也先是给每只小鼠灌胃1ml的浓度为2x10⁸cfu/ml的D型产气荚膜梭菌，连续灌胃3天，以预先造成小鼠的肠毒血症症状，从第四天起开始给予0.5mg/kg剂量的硫苷脂进行灌胃，并且连续灌胃4天；第五组：D型产气荚膜梭菌+唾液酸混合处理组，先是给每只小鼠灌胃1ml的浓度为2x10⁸cfu/ml的D型产气荚膜梭菌，连续灌胃3天，以预先造成小鼠的肠毒血症症状，从第四天起开始给予5mg/kg剂量的唾液酸进行灌胃，并且连续灌胃4天；第六组：D型产气荚膜梭菌+左氧氟沙星处理组(阳性对照组)，同样，本组也先是给每只小鼠灌胃1ml的浓度为2x10⁸cfu/ml的D型产气荚膜梭菌，连续灌胃3天，以预先造成小鼠的肠毒血症症状，从第四天起开始给予每只小鼠腹腔注射1ml浓度为1mg/ml的盐酸左氧氟沙星，并且连续4天给药。上述各处理组的观察时间都是7天，每天记录小鼠的死亡数，并计算小鼠7天的存活情况。神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸这三类酸性糖脂分子对D型产气荚膜梭菌感染后小鼠的保护作用及各组小鼠的存活情况如图9所示。

实验结果表明：神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸这三类酸性糖脂分子均可以有效降低D型产气荚膜梭菌感染后小鼠的死亡率，从而显著延长了D型产气荚膜梭菌感染后小鼠的生存时间，表明神经节苷脂、硫苷脂和唾液酸三类酸性糖脂分子在动物体内不仅具有很好的Epsilon毒素中和能力，同时也具有良好的抵御产Epsilon毒素的产气荚膜梭菌感染的功效。实验表明：抗生素由于其耐药性等影响，天然酸性糖脂分子有望成为替代抗生素用于预防和治疗产气荚膜梭菌感染。

Claims (1)

1.唾液酸在制备预防或治疗动物的产气荚膜梭菌感染的药物中的应用，其特征在于：所述的产气荚膜梭菌为D型，所述的唾液酸的化学结构式如下：

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