CN110464384B - 一种肾盂尿液微生态标本采集及污染验证方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肾盂尿液微生态标本采集及污染验证方法，整体方案简洁易操作，利用本发明公开的采集方法可采集到真正代表肾盂尿液微生态的标本，样本准确性高，通过进一步验证比较肾盂微生态结构和膀胱微生态结构的差异，可准确判断肾盂微生态是否受到污染，对后续肾盂微生态的分析及肾盂微生态与肾脏疾病之间关系的分析具有实质性的意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生态标本采集技术领域，具体是涉及一种肾盂尿液微生态标本的采集方法及证实肾盂尿液标本是否受到膀胱尿液污染的验证方法。
背景技术
随着高通量测序技术的发展和应用，原本被人们认为无菌的部位——膀胱已不再是无菌区域，而且膀胱微生态独立于其它器官。如同肠道、口腔和阴道等部位一样，膀胱不仅存在微生态，其微生态结构还反映机体的健康状态。
既然膀胱存在微生态，与其通过输尿管相连的肾盂也有可能存在微生态。由于微生物将与其所接触的组织相互作用，通过互作关系影响细胞、组织和器官的功能，可想而知，如果肾盂存在微生态的话，它将影响肾脏的功能。同时，基于尿液微生态生物诊断因子的应用，其结果还有可能协助肾癌和肾上腺瘤等肾脏疾病的诊断。然而，目前尚无获取真正代表肾盂尿液微生态标本的采集方法。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的不足，公开一种防止肾盂尿液被膀胱尿液微生物污染的肾盂尿液微生态标本的采集方法，即采集可真正代表肾盂尿液微生态的标本的方法；同时还公开了一种验证肾盂微生态结构不同于膀胱微生态结构的方法，即证实肾盂尿液标本是否受到膀胱尿液污染的验证方法。
本发明的技术方案为：一种肾盂尿液微生态标本采集方法，具体包括如下步骤：
1.待患者全麻失去意识后，采用碘伏消毒患者会阴部和尿道外口；
2.将输尿管镜插入膀胱，取出3mL尿液，标记为“膀胱”；
3.使用输尿管镜将膀胱内剩余尿液全部排空；因为患者是仰卧位，如果仅仅利用肉眼观察尿液是否排尽，并不能保证膀胱尿液已经排空，利用输尿管镜观察则可确认膀胱是否真正排空，尿液排空的目的是防止灌注的碘伏被尿液稀释，保证碘伏有足够的杀菌浓度，这将有助于下一步膀胱的彻底灭菌；
4.将碘伏灌入膀胱进行灭菌处理，并在输尿管镜下观察膀胱是否充满了碘伏，充满碘伏后将其吸出，连续灌注3次，取最后一次碘伏灌注液3mL，采用扩增培养方法对碘伏灌注液进行培养；
传统的细菌培养方法是将10μL尿液接种在羊血平板上于35℃条件下进行培养，这种培养方法的培养结果通常是阴性，而本发明采用的培养方法综合了不同营养条件、气温、培养基、湿度、时间和增量，以使膀胱中残存的细菌得到充分培养，以防因培养条件不足造成的假阴性。
扩增培养方法如下：
(1)采用4区划线法分别将0.1mL碘伏灌注液接种到羊血平板、巧克力平板、多粘菌素平板和萘啶酸平板上，在5％CO2培养箱中于37℃条件下培养48小时，将10CFU/mL视为检测限，即任何一块平板上长出1个菌落则视培养结果为“阳性”；
(2)取血平板，接种0.1mL碘伏灌注液，在恒温为35℃和30℃的培养箱内分别培养48小时，将10CFU/mL视为检测限，即任何一块平板上长出1个菌落则视培养结果为“阳性”；
(3)分别将0.1mL碘伏灌注液接种于两块巯基乙酸盐厌氧血琼脂平板上，置于混合气体(5％O2、10％CO2、85％N2)培养箱35℃培养48小时，将10CFU/mL视为检测限，即任何一块平板上长出1个菌落则视培养结果为“阳性”；
(4)将1mL碘伏灌注液尿液接种于巯基乙酸盐液体培养基，35℃厌氧培养5天，如果培养液变浑浊，则表明有细菌生长，其培养结果为“阳性”；
四个培养过程相互独立，只要其中一个培养结果显示为“阳性”，则表示消毒不彻底，此患者的标本将不用于后续验证，重复该步骤，直到培养结果为“阴性”时，则继续下述步骤；
5.使用生理盐水反复冲洗膀胱，直至排出的液体澄清为止；
6.取一根6-7F无菌导管插入输尿管镜，并将它们一起插入肾盂，采集3mL尿液，标记为“肾盂”，将输尿管镜和导管移至膀胱后，从膀胱取出。
一种肾盂尿液微生态是否受到膀胱尿液污染的验证方法
分别提取标记为“膀胱”和“肾盂”的两个样品的细菌DNA后，对肾盂与膀胱尿液样本进行16S rDNA测序，接下来，分别采用LefSe分析找出对样品划分产生显著性差异影响的群落或物种，利用PLS-DA判别分析建立样品类别之间的关系模型，来实现对样品类别的预测，并且非参数比较肾盂与膀胱尿液微生物属层次差异，进一步比较肾盂和膀胱尿液微生态的差异；本发明采用细菌DNA检测肾盂尿与膀胱尿的异同，是因为这种方法不仅可以比较两个部位尿液细菌种类的不同，同时还可以判断量的不同，因而更加全面地判断肾盂尿是否受到了膀胱尿的污染，如果肾盂尿液微生态受到膀胱尿液污染，则两个部位的标本的分析结果是无明显差异的；如果未受到污染，则有明显差异。
本发明的有益效果为：
本发明在公开一种肾盂尿液微生态标本的采集方法的同时还公开一种证实肾盂尿液标本是否受到膀胱尿液污染的验证方法，利用该标本采集方法可采集到真正代表肾盂尿液微生态的标本，样本准确性高，通过肾盂微生态结构与膀胱微生态结构的验证比较，可准确判断肾盂微生态是否受到污染。
附图说明
图1为本发明实施例二得出的LefSe分析结果图；
图2为本发明实施例二得出的PLS-DA分析结果图；
图3为本发明实施例二得出的wilcox检验结果图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
需要说明的是，由于接受肾盂尿液微生态标本采集工作和后续检查分析的主要为肾脏出现疾病的患者，所以实施例是以肾癌患者为例进行的描述。
实施例一
肾盂尿液微生态标本采集方法
1.待患者全麻失去意识后，采用碘伏消毒患者会阴部和尿道外口；
2.将输尿管镜插入膀胱，取出3mL尿液，标记为“膀胱”；
3.使用输尿管镜将膀胱内剩余尿液全部排空；
4.将碘伏灌入膀胱进行灭菌处理，并在输尿管镜下观察膀胱是否充满了碘伏，充满碘伏后将其吸出，连续灌注3次，取最后一次碘伏灌注液3mL，采用扩增培养方法对碘伏灌注液进行培养；
扩增培养方法如下：
(1)采用4区划线法分别将0.1mL碘伏灌注液接种到羊血平板、巧克力平板、多粘菌素平板和萘啶酸平板上，在5％CO2培养箱中于37℃条件下培养48小时，将10CFU/mL视为检测限，即任何一块平板上长出1个菌落则视培养结果为“阳性”；
(2)取血平板，接种0.1mL碘伏灌注液，在恒温为35℃和30℃的培养箱内分别培养48小时，将10CFU/mL视为检测限，即任何一块平板上长出1个菌落则视培养结果为“阳性”；
(3)分别将0.1mL碘伏灌注液接种于两块巯基乙酸盐厌氧血琼脂平板上，置于混合气体(5％O2、10％CO2、85％N2)培养箱35℃培养48小时，将10CFU/mL视为检测限，即任何一块平板上长出1个菌落则视培养结果为“阳性”；
(4)将1mL碘伏灌注液接种于巯基乙酸盐液体培养基，35℃厌氧培养5天，如果培养液变浑浊，则表明有细菌生长，其培养结果为“阳性”；
四个培养过程相互独立，只要其中一个培养结果显示为“阳性”，则表示消毒不彻底，此患者的标本将不用于后续验证，重复该步骤，直到培养结果为“阴性”时，则继续下述步骤；
5.使用生理盐水反复冲洗膀胱，直至排出的液体澄清为止；
6.取一根6-7F无菌导管插入输尿管镜，并将它们一起插入肾盂，采集3mL尿液，标记为“肾盂”，将输尿管镜和导管移至膀胱后，从膀胱取出。
实施例二、肾盂尿液微生态的验证
提取样品细菌DNA后，对肾盂与膀胱尿液样本进行16S rDNA测序。接下来，采用以下生物信息学分析方法比较肾盂和膀胱尿液微生态的差异，
1.LefSe分析
根据分类学组成对样品按照不同的分组条件进行线性判别分析，找出对样品划分产生显著性差异影响的群落或物种。从分析结果可知，肾盂尿液的微生态结构不同于膀胱。从图1可以看出，肾盂尿液中Methylocystaceae、Campylobacterales、Epsilonproteobacteria、Pseudomonadales、Pseudomonadaceae、Pseudomonas、Gammaproteobacteria、Gardnerella、Clostridisalibacter、Epsilonproteobacteria、Trueperaceae、Truepera的相对丰度明显高于膀胱尿液，可视为肾盂尿液独立于膀胱尿液的生物不标志物。
2.PLS-DA判别分析
该方法运用PLS-DA建立样品类别之间的关系模型，来实现对样品类别的预测。从图2可知，肾盂尿液仅少部分操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)与膀胱尿液聚集在一起。也就是说，肾盂尿液微生态的结构与膀胱微生态相似度较低。
3.非参数比较肾盂与膀胱尿液微生物属层次差异
采用wilcox检验比较肾盂与膀胱尿液细菌OTU丰度，并同时采用Benjamini FDR【FDR(false discovery rate)错误发现率】对检验结果进行验证，控制I类错误的发生。结果发现肾盂尿液在86个细菌属水平与膀胱尿液存在差异。
综上可知，未受污染的肾盂尿液微生态与膀胱尿液微生态是存在显著差异的，单独采集肾盂尿液微生态对分析肾盂微生态与肾脏疾病的关系具有实质性的意义。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。
Claims (1)
1.一种验证肾盂尿液微生态标本是否受到膀胱尿液污染的方法，其特征在于，具体步骤为：
分别提取标记为“膀胱”和“肾盂”的两个样品的细菌DNA后，对肾盂与膀胱尿液样本进行16S rDNA测序，接下来，分别采用LefSe分析找出对样品划分产生显著性差异影响的群落或物种，利用PLS-DA判别分析建立样品类别之间的关系模型，来实现对样品类别的预测，并且非参数比较肾盂与膀胱尿液微生物属层次差异，进一步全面比较肾盂和膀胱尿液微生态的差异；如果肾盂尿液微生态受到膀胱尿液污染，则两个部位的标本的分析结果无明显差异；如果未受到污染，则有明显差异。
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