CN110452390A - 一种胰岛素智能给药制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种葡萄糖响应型高分子自组装纳米材料PAM‑PAspPBA‑PEG以及胰岛素智能给药制剂。所述PAM‑PAspPBA‑PEG的结构式如式I所示，其中，PAM代表聚酰胺‑胺型树枝状聚合物；n为300‑500的整数；m为1320‑3420的整数。所述胰岛素智能给药制剂，由PAM‑PAspPBA‑PEG和胰岛素组成；胰岛素包埋于PAM‑PAspPBA‑PEG中。该制剂利用苯硼酸可以和葡萄糖分子特异性结合的特性，通过改变高分子载体的物理性质与形态，从而将胰岛素从药物载体中释放，实现葡萄糖的响应性。该制剂通过纳米化处理，将大大加快制剂对葡萄糖的响应性。另外该材料主要由氨基酸组成，因而还具有较好的生物组织相容性。

Description

一种胰岛素智能给药制剂
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种胰岛素智能给药制剂。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为主的慢性代谢性疾病，并发多种微血管和大血管并发症，严重威胁人类身心健康。1在我国，成年人糖尿病的发病率大概在10％左右。糖尿病分为1型和2型糖尿病。1型糖尿病和2型糖尿病晚期，患者胰岛素绝对缺乏或分泌不足，需要补充外源性的胰岛素来维持正常的血糖。然而人体生理机能十分复杂，血糖一日内可反复波动，变化较快，而血糖监测又不能及时跟进，因此定时定量的胰岛素给药模式根本上满足不了患者的实际需要。2,3由于内源性胰岛素生理学释放系统的破坏，糖尿病患者血糖波动更加剧烈，这种剧烈波动甚至比高血糖的危害还要可怕，如何稳定患者的血糖是我们当前需要解决的关键问题。4,5外源性胰岛素制剂最理想的给药模式应该是模拟正常人体胰岛素释放的机理，可以随血糖变化而改变制剂中胰岛素的释放，当患者体内血糖升高时，制剂中胰岛素释放多，血糖降低时，制剂中胰岛素释放停止，形成一种人工智能型的胰岛素给药系统，促使血糖平稳降低，不再剧烈波动。6-9关于胰岛素给药方式的智能化研究，已经开始成为未来研究的一个重要方向。但是由于相关制剂材料等多种技术性滞后，一直没有成熟的相关创新产品上市。如果能研发一种胰岛素的智能给药系统或制剂，真正做到胰岛素的“智能化给药”，对广大的糖尿病患者来说，是一个莫大的福音，因而具有积极的研究开发意义。
参考文献：
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2 Blauw,H.,Keithhynes,P.,Koops,R.&Devries,J.H.AReview of Safety andDesign Requirements of the Artificial Pancreas.Annals of BiomedicalEngineering 44,3158-3172(2016).
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4 Chu,L.Y.,Li,Y.,Zhu,J.H.,Wang,H.D.&Liang,Y.J.Control of pore sizeand permeability of a glucose-responsive gating membrane for insulindelivery.Journal of Controlled Release Official Journal of the ControlledRelease Society 97,43(2004).
5 Han,J.et al.Design,synthesis,and biological activity of noveldicoumarol glucagon-like peptide 1conjugates.J Med Chem 56,9955-9968,doi:10.1021/jm4017448(2013).
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发明内容
本发明的一个目的是提供一种新型葡萄糖响应型高分子自组装缓释纳米材料。该材料包埋胰岛素后，可以使得胰岛素的释放随血糖的变化而变化。
本发明所提供的葡萄糖响应型高分子自组装纳米材料(PAM-PAspPBA-PEG)，其结构式如式I所示：
式I中，PAM代表聚酰胺-胺型树枝状聚合物；n为300-500的整数；m为1320-3420的整数。
所述PAM具体可为PAMAM G3-NH2。
本发明的另一个目的是提供一种胰岛素智能给药制剂。
本发明所提供的胰岛素智能给药制剂，由上述葡萄糖响应型高分子自组装纳米材料和胰岛素组成；所述胰岛素包埋于葡萄糖响应型高分子自组装纳米材料中。
所述葡萄糖响应型高分子自组装纳米材料和胰岛素的质量比为(2-4)：(0.5-1.5)。
本发明的再一个目的是提供上述葡萄糖响应型高分子自组装纳米材料的制备方法。
本发明所提供的葡萄糖响应型高分子自组装纳米材料的制备方法，包括下述步骤：
1)合成PAM-PBLA-NH2
将聚酰胺-胺型树枝状聚合物与式Ⅱ所示的BLA-NCA进行阴离子聚合反应，得到式Ⅲ所示的PAM-PBLA-NH2；
2)合成PAM-PBLA-PEG
将步骤1)中制备的PAM-PBLA-NH2与PEG–SCM进行缩合反应，得到式Ⅳ所示的PAM-PBLA-PEG；
3)合成PAM-PAsp-b-PEG
将步骤2)中制备的PAM-PBLA-PEG与CF3COOH进行水解反应，得到式V所示的PAM-PAsp-b-PEG；
4)合成PAM-PAspPBA-PEG
将步骤3)中制备的PAM-PAsp-b-PEG与APBA(间氨基苯硼酸)进行酰胺化反应，得到式I所示的PAM-PAspPBA-PEG；
上述方法步骤1)中，所述反应的反应条件为：在惰性气氛中，于25-40℃水浴中，真空反应2-4天。反应结束后需要保证溶液为完全溶解澄清状态。
所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
所述反应中，所述聚酰胺-胺型树枝状聚合物与式Ⅱ所示的BLA-NCA的摩尔比为(0.5-1.5)：(450-500)。
上述步骤1)还包括反应结束后将得到的含式Ⅲ所示的PAM-PBLA-NH2的反应体系加入乙醚进行沉淀的步骤。具体方法如下：
将反应体系缓慢滴加入事先预冷于-20℃的乙醚中，一边滴加混合体系一边快速搅拌，肉眼可见有絮状物析出，滴加完毕后置于4℃冰箱过夜，然后收集沉淀并干燥，得到式Ⅲ所示的PAM-PBLA-NH2的固体。
上述方法步骤2)中，所述反应的反应条件为：在室温搅拌反应1-3小时。
所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
所述反应中，所述PAM-PBLA-NH2与PEG–SCM的摩尔比为(0.5-1.5)：(20-40)。
上述步骤2)还包括反应结束后将得到的含式Ⅳ所示的PAM-PBLA-PEG的反应体系加入乙醚中进行沉淀的步骤。具体方法如下：
将含式Ⅳ所示的PAM-PBLA-PEG的反应体系用100μl的移液枪缓慢加入乙醚中，并伴随搅拌；将析出沉淀的乙醚放入4℃冰箱过夜，然后离心收集沉淀；再次用预冷乙醚冲洗沉淀，再次离心两次，收集沉淀并干燥，得到式Ⅳ所示的PAM-PBLA-PEG的固体。
上述方法步骤3)中，所述反应的反应条件为：在室温反应0.5-2小时。
所述反应在HBr/HAc存在的条件下进行，所述HBr/HAc的体积比为1:2；所述HBr/HAc的加入量为2-10ml/每克PAM-PBLA-PEG。
所述反应中，所述PAM-PBLA-PEG与CF3COOH的摩尔比为(0.5-1.5)：(3-10)。
上述步骤3)还包括反应结束后将得到的含式V所示的PAM-PAsp-b-PEG的反应体系进行纯化的步骤。具体方法如下：将含式V所示的PAM-PAsp-b-PEG的反应体系转移至广口烧杯中，水浴挥发除去溶液中的HBr/Hac；然后再将反应体系加入乙醚中进行沉淀，4℃过夜，离心收集沉淀；然后用去离子水将所述沉淀再次溶解，置于5000kDa的透析袋中，透析两天，彻底除去残留的HBr和HAc，收集透析袋中的溶液真空冷冻干燥，即得式V所示的PAM-PAsp-b-PEG固体。
上述方法步骤4)中，所述反应的反应条件为：在4-20℃反应3-12小时。
所述反应在EDC存在的条件下进行，所述EDC的加入量为PAM-PAsp-b-PEG摩尔量的400-1000倍。
所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
所述反应中，所述PPAM-PAsp-b-PEG与APBA的摩尔比为(0.5-1.5)：(300-340)。
上述步骤4)还包括反应结束后将得到的含式I所示的PAM-PAspPBA-PEG的反应体系加入水中进行沉淀的步骤。具体方法如下：将含式I所示的PAM-PAspPBA-PEG的反应体系加入10倍体积的pH值为3的去离子水中析出沉淀，离心，收集沉淀；然后用pH值为7的去离子水混悬沉淀，冷冻干燥，即得式I所示的PAM-PAspPBA-PEG的固体。
本发明还提供了上述胰岛素智能给药制剂的制备方法。
本发明所提供的胰岛素智能给药制剂的制备方法，包括下述步骤：
用pH值为10-13的PBS溶解PAM-PAspPBA-PEG，得到PAM-PAspPBA-PEG的PBS溶液；用pH值为2-3的PBS溶解胰岛素，得到胰岛素的PBS溶液；然后用所述胰岛素的PBS溶液逐渐加入所述PAM-PAspPBA-PEG的PBS溶液，直至混合溶液产生丁达尔效应停止；然后透析洗除去游离的胰岛素分子，冷冻干燥，即得。
上述方法中，所述PAM-PAspPBA-PEG的PBS溶液中PAM-PAspPBA-PEG的浓度为1-2mg/ml。所述胰岛素的PBS溶液中胰岛素的度为0.3-0.6mg/ml。
本发明首先合成了一种新型的葡萄糖响应型高分子自组装缓释纳米材料(PAM-PAsp-b-PEG)，然后将其连上苯硼酸分子，并包埋胰岛素组成纳米制剂。该制剂利用苯硼酸可以和葡萄糖分子特异性结合的特性，通过改变高分子载体的物理性质与形态，从而将胰岛素从药物载体中释放，实现葡萄糖的响应性。该制剂利用了高分子材料稳定的结构性质，可以达到长效的目的。该制剂通过纳米化处理，将大大加快制剂对葡萄糖的响应性。另外该材料主要由氨基酸组成，因而还具有较好的生物组织相容性。
因此，本发明提供的智能型胰岛素给药系统或制剂，该系统或制剂的实施可有效抑制血糖的波动、甚至大大降低严重低血糖等不良反应的发生率，也减少给药次数，提高病人的顺应性和生活质量。
附图说明
图1为合成PAM-PBLA-NH2的反应流程图。
图2为合成PAM-PBLA-PEG的反应流程图。
图3为合成PAM-PAsp-b-PEG的反应流程图。
图4为合成PAM-PAspPBA-PEG的反应流程图。
图5为PAM-PBLA-NH2的HNMR图谱。
图6为PAM-PBLA-PEG的HNMR图谱。
图7为PAM-PAsp-b-PEG的HNMR图谱。
图8为PAM-PAspPBA-PEG的HNMR图谱。
图9为Insulin+PAM-PAspPBA-PEG的TEM图谱。
图10为PAM-PAspPBA-PEG的TEM图谱。
图11为PAM-PAspPBA-PEG在20mM葡萄糖溶液中的粒径(1min内测)。
图12为PAM-PAspPBA-PEG在20mM葡萄糖溶液中的粒径(30min测)。
图13为不同浓度葡萄糖PBS中胰岛素释放速率。
图14为不同浓度葡萄糖血清溶液中胰岛素释放速率。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、葡萄糖响应型自组装纳米材料的制备
1实验材料
1.1实验试剂：
1)聚酰胺-胺型树枝状聚合物(Dendrimer PAMAM G3-NH2,20％，溶于甲醇)，购于威海晨源分子新材料有限公司。
2)聚天冬氨酸苄酯、BLA-NCA(N-羧基-L-天冬氨酸-苄酯-环内酸酐),聚乙二醇(PEG-SCM，2k-5k)，购于芜湖芃硕生物科技有限公司。
3)氨基苯硼酸(Aspartamidophenylboronic acid)，三氟乙酸(CF3COOH),氢溴酸/醋酸(HBr/HAc),N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide，DMF)，碳二亚胺(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC),购于美国Sigma-Aldrich公司。
4)猪胰岛素(insulin)，购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
5)胎牛血清，购自Pan Biotech公司。
1.2实验耗材：透析袋，购于上海生工生物工程股份有限公司。
1.3实验仪器：离心机(美国Beckman coulter公司，Allegra X-15R)，超高速离心机(美国Beckman coulter公司，MAX-XP)，冷冻干燥机(美国Labconco公司，LabconcoFreeZone 2L)，真空干燥箱(上海一恒，DZF-6050)，纳米粒度及Zeta电位分析仪(英国Malvern instruments公司，Zetasizer Nano ZS+MPT2)，透射电子显微镜(FEI香港有限公司，Tecnai G2Spirit120kV)，核磁共振波谱仪(瑞士Buker biospin公司，AVANCEⅢ400)。
2实验方法
2.1高分子材料合成和胰岛素装载纳米制剂的制备
主要分五步完成：
第一步：PAM-PBLA-NH2的合成：
反应流程图如图1所示。
1)准确称量3g BLA-NCA加入斜口烧瓶，溶于提前干燥24小时的十倍体积DMF，另加入2ml二氯甲烷。隔水加热至完全溶解。
2)另外准确称量含有0.9g PAM-G3-NH2溶液，加入转子，搅拌混匀。
3)通入氮气，保持35℃水浴，真空反应3天。需要保证溶液为完全溶解澄清状态。
4)将反应体系缓慢滴加入事先预冷于-20℃的乙醚300ml，一边滴加混合体系一边快速搅拌，肉眼可见有絮状物析出，滴加完毕后置于4℃冰箱过夜。
5)将乙醚倒入废液缸，剩下的沉淀于通风柜过夜。开通风功能挥发剩余乙醚。
6)将无乙醚刺激气味的沉淀置于真空干燥箱，37℃真空干燥过夜。
7)称量沉淀，即PAM-PBLA-NH2。
第二步：PAM-PBLA-PEG的合成：
1)准确称取1g PAM-PBLA-NH2溶于事先干燥好的10ml DMF。
2)加入1g PEG2000-SCM，室温搅拌，反应2小时。
3)提前准备预冷好十倍体积的乙醚100ml，将总反应体系用100μl的移液枪缓慢加入乙醚中，并伴随搅拌。
4)将析出沉淀的乙醚放入4℃冰箱过夜，使沉淀进一步析出。
5)将乙醚溶液3000rpm/min离心5分钟，除去上清，收集沉淀。
6)再次用预冷乙醚冲洗沉淀，再次离心两次以收集沉淀。
7)将沉淀置于通风橱过夜，挥发沉淀中剩余的乙醚。
8)将过夜后的沉淀置于真空干燥箱，干燥过夜，收集PAM-PBLA-PEG。
第三步：PAM-PAsp-b-PEG的合成：
1)取1g PAM-PBLA-PEG，溶于10ml CF3COOH，搅拌至完全溶解。
2)加入1ml HBr/HAc(1:2，v/v)，搅拌，室温反应一小时。
3)反应完成后，将反应体系转移至广口烧杯中，45℃水浴挥发除去溶液中的酸。
4)将反应体系缓慢滴加入提前预冷好的200ml乙醚中，搅拌，至出现沉淀。4℃过夜。
5)3000rpm/min，离心5分钟，除去乙醚。收集沉淀。
6)去离子水将沉淀再次溶解，置于5000kDa的透析袋中。透析两天，彻底除去残留的HBr和HAc。
7)真空冷冻干燥溶液，得到PAM-PAsp-b-PEG。
第四步：PAM-PAspPBA-PEG的合成：
1)分别精确称量0.5g PAM-PAsp-b-PEG与0.305g APBA，溶于10ml提前干燥好的DMF。
2)加入2g EDC，加入转子，4℃反应4h。
3)将反应产物缓慢滴加入10倍体积的去离子水(预先将pH调至3)中析出沉淀。
4)30000g/min，离心10分钟，除去上清。再次用少量的去离子水(pH7)混悬沉淀，再次离心。
5)用去离子水(pH7)混悬沉淀，冷冻干燥。得到PAM-PAspPBA-b-PEG。
第五步：胰岛素纳米制剂的制备
1)用去离子水将20mg猪胰岛素配置成20mg/ml的溶液。
2)DMSO溶解2mg FITC，配制成10mg/ml溶液。
3)将FITC溶液与胰岛素溶液混合，4℃反应12h，得到荧光标记的胰岛素，透析提纯两天，冷冻干燥保存。
4)用pH12的PBS溶解高分子聚合物20mg PAM-PAspPBA-PEG，用pH2的PBS溶解7mgFITC-胰岛素。
5)用胰岛素溶液滴定高聚物溶液，直至混合溶液产生丁达尔效应停止。
6)透析洗去游离的胰岛素分子，冷冻干燥保存。
2.2高分子材料性质鉴定
HNMR(核磁共振氢谱)
实验方法：
1.称取5mg干燥后的高分子化合物，置于干净的EP管中。
2.加入5ml的溶剂溶解高分子化合物粉末(不同阶段的化合物由于溶解性不同，使用的溶剂也各有不同)。
3.将溶解完全的样品送至清华大学深圳研究生院材料与器件检测中心进行检测并得到实验结果。
实验结果：
各个聚合的图谱见图5-8。
各个图谱上与合成高分子的对应分子特征峰已标明，峰面积之比代表了特征氢峰的比值。
TEM(透射电子显微镜)
实验方法：
1.将冷冻干燥的终产物高分子聚合物PAM-PAspPBA-PEG或包含胰岛素的该高分子聚合物，用pH12的1％NaOH(g/ml)溶液稀释至0.5mg/ml。
2.用10μl的样品溶液滴加至电镜载网(带孔碳膜铜网)正面，计时10min，使之自然吸附至铜网上，吸去多余液体。重复2次。
3.将载网放回样品盒，真空干燥过夜。
4.将制备好的样品送至清华大学深圳研究生院材料与器件检测中心检测，并得到实验结果。
实验结果：
如图9-10所示。由图可知，合成的高分子材料PAM-PAspPBA-PEG粒径大小范围在50-150nm之间，是属于纳米材料的粒径范围内。
DSL(动态光散射测粒径)
实验方法：
1.用20mM葡萄糖浓度(葡萄糖浓度20mM)的PBS溶液(pH7.4)稀释冷冻干燥的样品PAM-PAspPBA-PEG，至终浓度1mg/ml，静止30min。
2.样品送至清华大学深圳研究生院材料与器件检测中心，入机检测，得到结果。
实验结果：
如图11-12所示。在高糖溶液中静置30min后，发现样品的粒径由平均104nm降至98.5nm。说明合成的高分子材料有葡萄糖响应性，另与TEM实验中的样品颗粒大小相互印证。
实施例2、葡萄糖响应型自组装纳米材料和胰岛素装载纳米制剂的释放试验
1.体外释放实验
磷酸缓冲液(PBS)释放
实验方法(PBS)：
1.将冷冻干燥的包裹了insulin-FITC的PAM-PAspPBA-PEG用pH7.4的PBS稀释至1mg/ml。
2.分别将200μl的样品溶液装进2个10kDa的透析袋中。
3.分别放入5ml不同葡萄糖浓度(5mM/20mM)的PBS溶液(pH7.4)中。
4.在0，5，10，20，30，60，120min吸取透析袋外PBS溶液(pH7.4)，测荧光强度来判断胰岛素的释放速率。
实验结果：
如图13所示。由图13可知，在不同葡萄糖浓度的PBS溶液中，胰岛素的释放速率在20min后拉开。
胎牛血清释放
实验方法(胎牛血清)：
5.将冷冻干燥的包裹了insulin-FITC的PAM-PAspPBA-PEG用pH7.4的PBS稀释至1mg/ml。
6.分别将200μl的样品溶液装进2个10kDa的透析袋中。
7.分别放入5ml不同葡萄糖浓度(5mM/20mM)的胎牛血清溶液(pH7.4)中。
8.在0，5，10，20，30，60min吸取透析袋外PBS溶液(pH7.4)，测荧光强度来判断胰岛素的释放速率。
实验结果：
如图14所示。由图14可知，在不同葡萄糖浓度的血清溶液中，胰岛素的释放速率在10min后拉开。

Claims (10)

1.一种葡萄糖响应型高分子自组装纳米材料PAM-PAspPBA-PEG，其结构式如式I所示：
式I中，PAM代表聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
2.根据权利要求1所述的PAM-PAspPBA-PEG，其特征在于：式I中n为300-500的整数；m为1320-3420的整数；
所述PAM为PAMAM G3-NH2。
3.一种胰岛素智能给药制剂，由权利要求1或2中所述葡萄糖响应型高分子自组装纳米材料PAM-PAspPBA-PEG和胰岛素组成；所述胰岛素包埋于所述葡萄糖响应型高分子自组装纳米材料PAM-PAspPBA-PEG中；
所述葡萄糖响应型高分子自组装纳米材料PAM-PAspPBA-PEG和胰岛素的质量比为(2-4)：(0.5-1.5)。
4.制备权利要求1或2所述葡萄糖响应型高分子自组装纳米材料的方法，包括下述步骤：
1)合成PAM-PBLA-NH2
将聚酰胺-胺型树枝状聚合物与式Ⅱ所示的BLA-NCA进行阴离子聚合反应，得到式Ⅲ所示的PAM-PBLA-NH2；
2)合成PAM-PBLA-PEG
将步骤1)中制备的PAM-PBLA-NH2与PEG–SCM进行酰胺化反应，得到式Ⅳ所示的PAM-PBLA-PEG；
3)合成PAM-PAsp-b-PEG
将步骤2)中制备的PAM-PBLA-PEG与CF3COOH进行水解反应，得到式V所示的PAM-PAsp-b-PEG；
4)合成PAM-PAspPBA-PEG
将步骤3)中制备的PAM-PAsp-b-PEG与间氨基苯硼酸进行酰胺化反应，得到式I所示的PAM-PAspPBA-PEG。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述反应的反应条件为：在惰性气氛中，于25-40℃水浴中，真空反应2-4天；
所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；
所述反应中，所述聚酰胺-胺型树枝状聚合物与式Ⅱ所示的BLA-NCA的摩尔比为(0.5-1.5)：(450-500)；
上述步骤1)还包括反应结束后将得到的含式Ⅲ所示的PAM-PBLA-NH2的反应体系加入乙醚进行沉淀的步骤；具体方法如下：
将反应体系缓慢滴加入事先预冷于-20℃的乙醚中，一边滴加混合体系一边快速搅拌，肉眼可见有絮状物析出，滴加完毕后置于4℃冰箱过夜，然后收集沉淀并干燥，得到式Ⅲ所示的PAM-PBLA-NH2的固体。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述反应的反应条件为：在室温搅拌反应1-3小时；
所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
所述反应中，所述PAM-PBLA-NH2与PEG–SCM的摩尔比为(0.5-1.5)：(20-40)；
所述步骤2)还包括反应结束后将得到的含式Ⅳ所示的PAM-PBLA-PEG的反应体系加入乙醚中进行沉淀的步骤；具体方法如下：
将含式Ⅳ所示的PAM-PBLA-PEG的反应体系用100μl的移液枪缓慢加入乙醚中，并伴随搅拌；将析出沉淀的乙醚放入4℃冰箱过夜，然后离心收集沉淀；再次用预冷乙醚冲洗沉淀，再次离心两次，收集沉淀并干燥，得到式Ⅳ所示的PAM-PBLA-PEG的固体。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述反应的反应条件为：在室温反应0.5-2小时；
所述反应在HBr/HAc存在的条件下进行，所述HBr/HAc的体积比为1:2；所述HBr/HAc的加入量为2-10ml/每克PAM-PBLA-PEG；
所述反应中，所述PAM-PBLA-PEG与CF3COOH的摩尔比为(0.5-1.5)：(3-10)；
所述步骤3)还包括反应结束后将得到的含式V所示的PAM-PAsp-b-PEG的反应体系进行纯化的步骤；具体方法如下：将含式V所示的PAM-PAsp-b-PEG的反应体系转移至广口烧杯中，水浴挥发除去溶液中的HBr/Hac；然后再将反应体系加入乙醚中进行沉淀，4℃过夜，离心收集沉淀；然后用去离子水将所述沉淀再次溶解，置于5000kDa的透析袋中，透析两天，彻底除去残留的HBr和HAc，收集透析袋中的溶液真空冷冻干燥，即得式V所示的PAM-PAsp-b-PEG固体。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述反应的反应条件为：在4-20℃反应3-12小时；
所述反应在EDC存在的条件下进行，所述EDC的加入量为PAM-PAsp-b-PEG摩尔量的400-1000倍；
所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；
所述反应中，所述PPAM-PAsp-b-PEG与APBA的摩尔比为(0.5-1.5)：(300-340)；
所述步骤4)还包括反应结束后将得到的含式I所示的PAM-PAspPBA-PEG的反应体系加入水中进行沉淀的步骤；具体方法如下：将含式I所示的PAM-PAspPBA-PEG的反应体系加入10倍体积的pH值为3的去离子水中析出沉淀，离心，收集沉淀；然后用pH值为7的去离子水混悬沉淀，冷冻干燥，即得式I所示的PAM-PAspPBA-PEG的固体。
9.制备权利要求3所述胰岛素智能给药制剂的方法，包括下述步骤：
用pH值为10-13的PBS溶解PAM-PAspPBA-PEG，得到PAM-PAspPBA-PEG的PBS溶液；用pH值为2-3的PBS溶解胰岛素，得到胰岛素的PBS溶液；然后用所述胰岛素的PBS溶液逐渐加入所述PAM-PAspPBA-PEG的PBS溶液，直至混合溶液产生丁达尔效应停止；然后透析洗除去游离的胰岛素分子，冷冻干燥，即得。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：上述方法中，所PAM-PAspPBA-PEG的PBS溶液中PAM-PAspPBA-PEG的浓度为1-2mg/ml；所述胰岛素的PBS溶液中胰岛素的度为0.3-0.6mg/ml。
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