CN110441287B - 一种原位定量检测细菌信号分子的增强拉曼光谱方法 - Google Patents

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Abstract

一种原位定量检测细菌信号分子的增强拉曼光谱方法。其采用壳隔离介电超表面材料作为增强剂，结合拉曼散射，通过细菌信号分子的特定拉曼散射峰的强度，对细菌生物膜形成过程中的信号分子进行原位定量检测检测，所述壳隔离介电超表面材料的壳结构为多孔薄膜，所述介电超表面为半导体亚纳米结构阵列。所述方法可实现细菌生物膜中信号分子的高准确、高灵敏和高重现原位定量检测，真实反映生物膜中细菌的群体感应特征。

Description

一种原位定量检测细菌信号分子的增强拉曼光谱方法
技术领域
本发明涉及生物分析化学技术领域，具体涉及一种原位定量检测细菌信号分子的增强拉曼光谱方法。
背景技术
细菌相互聚集粘结在一起形成的细菌生物膜几乎无处不在，因其形成难以抑制、清除非常困难，给人类健康和生活生产带来严重危害，成为当前全球关注的重大难题。细菌通过释放、感应有机小分子(即信号分子)来感知菌群密度和周围环境的变化，由此启动的细菌群体感应系统控制着细菌粘附、形态变化以及细菌生物膜的形成。所以，细菌信号分子是形成细菌生物膜的关键所在，对其在细菌生物膜形成过程中进行原位实时监测，将为介入、调控细菌群体感应系统提供科学依据，为细菌生物膜的有效抑制和破解提供新靶点和新思路，为细菌生物膜的防治提供新策略和新方法，在医疗卫生、食品安全和环境保护等广泛领域中具有十分重要的应用价值。细菌生物膜的形成是一个取决于细菌本身、表面环境的动态过程，而且生物膜中通常存在多种细菌，其生长的表面和环境也往往会发生变化，因此细菌生物膜形成过程中信号分子的原位检测充满多变性和复杂性。细菌群体感应信号分子的检测目前主要有基于报告基因的生物传感器(或传感菌)法和质谱法。生物传感器只能检测少数特定的信号分子，而且传感菌的引入可能会干扰生物膜细菌的群体感应。质谱法虽有灵敏度高和定位成像的优势，但要用大型精密的质谱仪，同时还需将样品置于超高真空环境或是与特定基质混合。因此，这些现有技术在原位监测细菌生物膜中的信号分子上存在许多难以克服的障碍和局限。
基于分子振动使散射光波长变化的拉曼光谱可获取分子结构的指纹信息，具有强大的分子识别能力，同时具有非标记、非接触的特点，是分子信息动态监测的理想手段。早期拉曼光谱由于大多分子的拉曼散射截面很小、其拉曼散射光信号十分微弱而难以实际应用，现在人们利用金属纳米粒子或纳米结构，建立起表面增强拉曼光谱(SERS)技术，可实现单分子水平的高灵敏检测。SERS技术的原理主要是，纳米金属(即增强剂)表面的自由电子在一定波长光的激发下产生共振(即纳米等离子体)，使其表面产生高度局域、高度放大的电磁场，该增强电磁场与表面邻近分子的拉曼散射光发生耦合和能量转移，从而极大地提高增强剂表面分子的拉曼散射光强度。近年来，高灵敏的SERS技术在生物分析化学中得到了广泛应用，实现了细胞、组织等复杂生物样品中各种分子以及微生物的检测。在应用SERS技术检测细菌生物膜方面，已有成果主要是针对细菌生物膜内的多糖、核酸和蛋白质等生物大分子；对细菌群体感应信号小分子目前仅见少数研究报道，如Claussen A等人在公开文献Detection of the quorum sensing signal molecule N-dodecanoyl-DL-homoserine lactone below 1 nanomolar concentrations using surface enhancedRaman spectroscopy(Curr Phys Chem 2013,3:199)、Wu XM等人在公开文献Culture-freediagnostics of Pseudomonas aeruginosa infection by silver nanorod array basedSERS from clinical sputum samples(Nanomedicine,2014,10:1863)中，报道了AHLs类信号分子的SERS检测方法。这些研究揭示了多种AHL分子的拉曼光谱特征，但都是在没有细菌的简单环境中进行的，没有考察复杂生物背景对信号分子SERS检测的影响。
在应用纳米金属作为增强剂、进行细菌生物膜中信号分子的SERS原位检测时，由于纳米金属表面易被大量存在的生物大分子所占据，少量存在的信号分子的拉曼散射将难以得到有效增强。最近，Bodelón G等人在公开文献Detection and imaging of quorumsensing in Pseudomonas aeruginosa biofilm communities by surface-enhancedresonance Raman scattering(Nature Materials,2016,15:1203)中，将纳米金包被在只允许小分子透过的多孔材料内，避免了增强剂表面被大分子吸附干扰，实现了细菌生物膜中信号分子的原位检测。但是，由于金属纳米等离子体具有很强的局域加热效应(HoganNJ,et al.Nanoparticles heat through light localization,Nano Lett,2014,14:4640)，在对生物体系进行拉曼光谱原位检测时，激发光会使纳米金属表面温度升高，改变表面邻近的生物分子的活性，严重干扰生物过程中的生物化学反应；同时也给检测体系带来扰动，使其结果难以重现。这种金属纳米等离子体的热干扰是其自身固有的，即使采用多孔薄膜进行隔离也难以消除。因此，基于金属纳米结构的增强剂在SERS原位检测细菌生物膜的应用中，本身存在无法避免的等离子体热干扰问题，不能真实可靠地反映细菌生物膜形成过程中信号分子的变化。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种原位定量检测细菌信号分子的增强拉曼光谱方法。所述方法可实现细菌生物膜中信号分子的高准确、高灵敏和高重现原位定量检测，真实反映生物膜中细菌的群体感应特征。
一种原位定量检测细菌信号分子的增强拉曼光谱方法，其采用壳隔离介电超表面材料作为增强剂，结合拉曼散射，通过细菌信号分子的特定拉曼散射峰的强度，对细菌生物膜形成过程中的信号分子进行原位定量检测检测，所述壳隔离介电超表面材料的壳结构为多孔薄膜，所述介电超表面为半导体亚纳米结构阵列。
优选的，所述壳隔离介电超表面材料是以纳米尺寸的卤化钙钛矿晶体ABX3为核、以无机凝胶为壳的核壳钙钛矿ABX3@MmOn，所述卤化钙钛矿晶体ABX3中，亚纳米尺寸的半导体单元重复排列形成亚纳米半导体阵列。在光的激发下，多个半导体单元组合产生介电谐振，同时各介电共振单位之间再进行谐振耦合，将使该超表面对拉曼散射具有极高的增强因子。
优选的，所述多孔薄膜是厚度为1～100nm的二氧化硅(SiO2)凝胶、二氧化钛(TiO2)凝胶或三氧化二铝(Al2O3)凝胶。
优选的，所述卤化钙钛矿ABX3晶体由AX和BX2分子自组装自发形成，其中，A为Rb+、Cs+或有机铵离子，B为Ge2+、Sn2+或Pb2+，X为Cl－、Br－或I－。可灵活选择与组合A、B和X，利用常规的分子合成与调控手段即可实现介电超表面的简便制备与精密调控。
优选的，所述卤化钙钛矿ABX3晶体为纳米粒子、纳米片或纳米条。
优选的，所述原位定量检测细菌信号分子的增强拉曼光谱方法，包括以下步骤：
(1)信号分子/细菌-增强剂混合液的制备：将增强剂与目标待测液按1:100～1000比例混合得到目标待测液-增强剂混合液，然后配制相同背景和相同增强剂浓度的细菌信号分子-增强剂混合液；
(2)原位拉曼光谱检测：分别采用拉曼光谱仪测定目标待测液-增强剂混合液和细菌信号分子-增强剂混合液的拉曼光谱，获取细菌信号分子的特定拉曼峰的强度，然后根据拉曼峰强度与分子浓度正比的特性，计算目标待测液中细菌信号分子的浓度。
优选的，所述原位定量检测细菌信号分子的增强拉曼光谱方法，具体包括以下步骤：
(1)信号分子/细菌-增强剂混合液的制备：分别配制具有相同浓度增强剂、相同背景的信号分子-增强剂溶液SA和细菌-增强剂悬浮液SB；
(2)细菌生物膜的培养：分别将相同体积的SA和SB滴加在同一培养基平板表面的两个区域，在相同条件下进行培养；
(3)原位拉曼光谱检测：在步骤(2)的培养过程中，选取多个时间点，采用拉曼光谱仪分别测定培养基平板表面SA和SB区域的拉曼光谱。
(4)细菌信号分子的定量分析：根据同一时间点所测的SA和SB拉曼光谱，获取细菌信号分子的特定拉曼峰的强度IA和IB，根据拉曼峰强度与分子浓度成正比，按CAIB/IA(CA为已知的SA中信号分子浓度)测算出SB区域(即细菌生物膜)中信号分子的浓度CB；然后根据各时间点的CB，绘制细菌生物膜形成过程中信号分子浓度随时间的变化曲线。
本发明的有益效果在于：
本发明增强拉曼光谱方法采用壳隔离介电超表面材料作为增强剂，一方面不存在金属纳米等离子体加热效应给生物体系带来的扰动；另一方面，壳隔离介电超表面材料以多孔薄膜为壳，原位检测时，仅允许小分子透过达到介电超表面，进而阻断生物膜内大分子在介电超表面的吸附污染，使介电超表面在生物膜体系中保持长期稳定，也可避免介电超表面影响细菌活动。由此，壳隔离介电增强拉曼光谱可实现细菌生物膜中信号分子的高准确、高灵敏和重现原味定量检测，实时反映生物膜中细菌的群体感应特征。
附图说明
图1为实施例1采用的CsPbBr3@SiO2核壳钙钛矿纳米粒子的透射电镜照片。
图2为实施例1中SA细菌信号分子AHL的壳隔离介电增强拉曼光谱。
图3为实施例1中大肠杆菌生物膜形成过程中信号分子AHL浓度变化曲线。
图4为实施例2采用的CH3NH3PbI3@SiO2核壳钙钛矿纳米片的扫描电镜照片。
图5为实施例2中SA细菌信号分子PYO的壳隔离介电增强拉曼光谱。
图6为实施例2中绿脓杆菌生物膜形成过程中信号分子PYO浓度变化曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1：
一种原位定量检测细菌生物膜信号分子的增强拉曼光谱方法，其中，所用细菌为大肠杆菌(革兰氏阴性G－)，所测细菌信号分子为介导G－菌群体感应的酰基高丝氨酸内酯(AHL)；所用增强剂为CsPbBr3@SiO2核壳钙钛矿纳米粒子(制备方法参考Liu Z等人在公开文献Toward highly luminescent and stabilized silica-coated perovskite quantumdots through simply mixing and stirring under room temperature in air,ACSAppl.Mater.Interfaces 2018,10:13053，平均粒径为22nm)，其透射电镜照片如图1所示。
在具体实施过程中，包括以下步骤：
(1)信号分子/细菌-增强剂混合液的制备：用LB培养液(含胰化蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和NaCl 10g/L，下同)分别配制信号分子AHL溶液和大肠杆菌悬浮液，将1.0mg增强剂分别加入10mL的上述两种溶液中，以1500rpm的速度进行搅拌、混合均匀，分别配制出50nM(CA)AHL-0.10mg/mL增强剂混合液(SA)和5.0×108cfu/mL大肠杆菌-0.10mg/mL增强剂混合液(SB)。
(2)细菌生物膜的培养：分别将10μL步骤(1)所得的两种混合液SA和SB滴加在同一LB培养基平板(含胰化蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L和琼脂15g/L，下同)表面的两个区域，在37℃、80％湿度下进行培养。
(3)原位拉曼光谱检测：在步骤(2)细菌生物膜形成过程的7个时间点0、2.0h、4.0h、8.0h、12h、18h和24h，采用拉曼光谱仪(BWS465-785H，B&W TEK,Inc,美国)，选取波长为515nm、功率为50mW的激发光，同时分别测定培养基平板表面SA和SB区域的拉曼光谱。SA区域的细菌信号分子AHL的壳隔离介电增强拉曼光谱如图2所示。
(4)细菌信号分子的定量分析：由同一时间点所测的SA和SB拉曼光谱，获取细菌信号分子AHL的特定拉曼散射峰(1560cm-1)的强度IA和IB，根据拉曼峰强度与分子浓度成正比，按CAIB/IA(CA＝50nM)测算出SB区域(即大肠杆菌生物膜)中信号分子AHL的浓度CB。最终，通过大肠杆菌生物膜形成过程中各时间点的原位拉曼光谱，可获得大肠杆菌生物膜形成过程中信号分子AHL浓度随时间的变化情况，结果如图3所示。
(5)重现性实验及结果：重复上述步骤(2～4)5次，信号分子AHL浓度测定结果的相对标准偏差的平均值为10.3％。
(6)信号分子AHL最低检出限的测定：按3倍信噪比(s/σ)计算，其中s为AHL特定拉曼散射峰强度IA与AHL浓度线性关系的斜率(通过测定标准曲线而得)，σ为空白试样的标准偏差；本法所得信号分子AHL的最低检出限为10nM。
(7)采用Wang J等人在公开文献Development of an extraction method andLC-MS analysis for N-acylated-l-homoserine lactones(AHLs)in wastewatertreatment biofilms,Journal of Chromatography B,2017,1041-1042:37中所用的液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测方法，对上述步骤(2)培养结束(24h)后的细菌生物膜(SB区域)中的信号分子AHL浓度进行测定，所得结果为33.5nM，与本法所得结果(35nM)符合率为95.7％，有较好的一致性。
(8)不采用增强剂与采用不具有壳结构的钙钛矿作为增强剂，重复上述步骤(1～4)，进行对比，均不能获得有效的信号分子AHL的拉曼散射峰，无法通过拉曼光谱对信号分子AHL进行定量分析。
实施例2：
一种原位定量检测细菌生物膜信号分子的增强拉曼光谱方法，其中，所用细菌为绿脓杆菌，所测细菌信号分子为介导绿脓杆菌细胞间群体感应的绿脓菌素(PYO)；所用增强剂为CH3NH3PbI3@TiO2纳米片(制备方法参考Liu Z等人在公开文献Toward highlyluminescent and stabilized silica-coated perovskite quantum dots throughsimply mixing and stirring under room temperature in air,ACSAppl.Mater.Interfaces 2018,10:13053，平均厚度为20nm,平均长度为250nm)，其扫描电镜照片如图4所示。
在具体实施过程中，包括以下步骤：
(1)信号分子/细菌-增强剂混合液的制备：用LB培养液(含胰化蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和NaCl 10g/L，下同)分别配制信号分子PYO溶液和绿脓杆菌悬浮液，将5.0mg增强剂分别加入10mL的上述两种溶液中，以1000rpm的速度进行搅拌、混合均匀，分别配制出10nM(CA)PYO-0.50mg/mL增强剂混合液(SA)和1.0×108cfu/mL绿脓杆菌-0.50mg/mL增强剂混合液(SB)。
(2)细菌生物膜的培养：分别将10μL步骤(1)所得的两种混合液SA和SB滴加在同一LB培养基平板(含胰化蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L和琼脂15g/L，下同)表面的两个区域，在37℃、80％湿度下进行培养。
(3)原位拉曼光谱检测：在步骤(2)细菌生物膜形成过程的7个时间点0、1.0h、4.0h、7.0h、10h、16h和24h，采用拉曼光谱仪(BWS465-785H，B&W TEK,Inc,美国)，选取波长为785nm、功率为25mW的激发光，同时分别测定培养基平板表面SA和SB区域的拉曼光谱。SA区域的细菌信号分子PYO的壳隔离介电增强拉曼光谱如图5所示。
(4)细菌信号分子的定量分析：由同一时间点所测的SA和SB拉曼光谱，获取细菌信号分子PYO的特定拉曼散射峰(1395cm-1)的强度IA和IB，根据拉曼峰强度与分子浓度成正比，按CAIB/IA(CA＝10nM)测算出SB区域(即绿脓杆菌生物膜)中信号分子的浓度CB。最终，通过绿脓杆菌生物膜形成过程中各时间点的原位拉曼光谱，可获得绿脓杆菌生物膜形成过程中信号分子PYO浓度随时间的变化情况，结果如图6所示。
(5)重现性实验及结果：重复上述步骤(2～4)5次，信号分子PYO浓度测定结果的相对标准偏差的平均值为8.5％。
(6)信号分子PYO最低检出限的测定：按3倍信噪比(s/σ)计算，其中s为PYO特定拉曼散射峰强度IA与PYO浓度线性关系的斜率(通过测定标准曲线而得)，σ为空白试样的标准偏差；本法所得信号分子PYO的最低检出限为1.0nM。
(7)采用Wang J等人在公开文献Development of an extraction method andLC-MS analysis for N-acylated-l-homoserine lactones(AHLs)in wastewatertreatment biofilms,Journal of Chromatography B,2017,1041-1042:37中所用的液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测方法，对上述步骤(2)培养结束(24h)后的细菌生物膜(SB区域)中的信号分子PYO浓度进行测定，所得结果为43.5nM，与本法所得结果(45nM)符合率为96.7％，有较好的一致性。
(8)不采用增强剂与采用不具有壳结构的钙钛矿作为增强剂，重复上述步骤(1～4)，进行对比，均不能获得有效的信号分子PYO的拉曼散射峰，无法通过拉曼光谱对信号分子PYO进行定量分析。

Claims (6)

1.一种原位定量检测细菌信号分子的增强拉曼光谱方法，其特征在于，采用壳隔离介电超表面材料作为增强剂，结合拉曼散射，通过细菌信号分子的特定拉曼散射峰的强度，对细菌生物膜形成过程中的信号分子进行原位定量检测检测，所述壳隔离介电超表面材料的壳结构为多孔薄膜，所述介电超表面为半导体亚纳米结构阵列；
所述壳隔离介电超表面材料是以纳米尺寸的卤化钙钛矿晶体ABX3为核、以无机凝胶为壳的核壳钙钛矿ABX3@MmOn，所述卤化钙钛矿晶体ABX3中，亚纳米尺寸的半导体单元重复排列形成亚纳米半导体阵列。
2.根据权利要求1所述增强拉曼光谱方法，其特征在于，所述多孔薄膜是厚度为1～100nm的二氧化硅凝胶、二氧化钛凝胶或三氧化二铝凝胶。
3.根据权利要求1所述增强拉曼光谱方法，其特征在于，所述卤化钙钛矿ABX3晶体由AX和BX2分子自组装自发形成，其中，A为Rb+、Cs+或有机铵离子，B为Ge2+、Sn2+或Pb2+，X为Cl－、Br－或I－。
4.根据权利要求1所述增强拉曼光谱方法，其特征在于，所述卤化钙钛矿ABX3晶体为纳米粒子、纳米片或纳米条。
5.根据权利要求1-4任一项所述增强拉曼光谱方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)信号分子/细菌-增强剂混合液的制备：将增强剂与目标待测液按1:100～1000的比例混合得到目标待测液-增强剂混合液，然后配制相同背景和相同增强剂浓度的细菌信号分子-增强剂混合液；
(2)原位拉曼光谱检测：分别采用拉曼光谱仪测定目标待测液-增强剂混合液和细菌信号分子-增强剂混合液的拉曼光谱，获取细菌信号分子的特定拉曼峰的强度，然后根据拉曼峰强度与分子浓度正比的特性，计算目标待测液中细菌信号分子的浓度。
6.根据权利要求1-4任一项所述增强拉曼光谱方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)信号分子/细菌-增强剂混合液的制备：分别配制具有相同浓度增强剂、相同背景的信号分子-增强剂溶液SA和细菌-增强剂悬浮液SB；
(2)细菌生物膜的培养：分别将相同体积的SA和SB滴加在同一培养基平板表面的两个区域，在相同条件下进行培养；
(3)原位拉曼光谱检测：在步骤(2)的培养过程中，选取多个时间点，采用拉曼光谱仪分别测定培养基平板表面SA和SB 区域的拉曼光谱；
(4)细菌信号分子的定量分析：根据同一时间点所测的SA和SB拉曼光谱，获取细菌信号分子的特定拉曼峰的强度IA和IB，根据拉曼峰强度与分子浓度成正比，按CAIB /IA测算出SB区域中信号分子的浓度CB，CA为已知的SA中信号分子浓度；然后根据各时间点的CB，绘制细菌生物膜形成过程中信号分子浓度随时间的变化曲线。
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