CN110437235A

CN110437235A - 3-酰胺氮杂吲哚类化合物作为肥大细胞调节剂及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN110437235A
Application number: CN201910797733.5A
Authority: CN
Inventors: 刘培岩; 高宏伟; 郝超; 陶秀梅; 陈鹏
Original assignee: Beijing Nukangda Medicine Polytron Technologies Inc
Current assignee: Beijing Nukangda Medicine Polytron Technologies Inc
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2019-11-12
Anticipated expiration: 2039-08-27
Also published as: CN110437235B

Abstract

本发明提供式(Ⅰ)所述的3‑酰胺氮杂吲哚类化合物作为肥大细胞调节剂及其制备方法和用途，其可用于治疗与肥大细胞相关的疾病和病症。本发明提供了式(Ⅰ)所述化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯及其制备方法，其在制备治疗或预防糖尿病及其并发症的应用还提供了包含式(Ⅰ)的新化合物的药物组合物及其制剂。

Description

3-酰胺氮杂吲哚类化合物作为肥大细胞调节剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及3-酰胺氮杂吲哚类化合物作为肥大细胞调节剂及其制备方法和用途，含有这些调节剂的药物组合，以及这些化合物在治疗与肥大细胞相关的疾病中的用途。

技术背景

肥大细胞广泛分布于皮肤及内脏粘膜下的微血管周围。肥大细胞可通过释放过敏介质导致过敏或者过敏性反应，它还参与有获得性和先天性免疫和自身免疫以及细菌感染免疫。肥大细胞失控过度激活与许多病理过程有关，包括自身免疫性疾病与癌症。此外研究表明肥大细胞除了与过敏炎症，例如支气管哮喘、过敏性鼻炎和结膜炎、湿疹、角化病等相关之外还与中枢神经系统疾病、代谢紊乱和非过敏导致的炎性疾病有关。

研究肥大细胞稳定剂治疗过敏和自身免疫性疾病是一个活跃的研究领域。近年来研究发现MC在组织稳态和修复中起到至关重要的作用。在糖尿病患者的皮肤中发现过度活化的MC并阻碍了糖尿病足溃疡表面的愈合进程。同时炎症是导致糖尿病患者血脂异常、神经病变等并发症的重要因素。

鉴于肥大细胞参与多种治疗途径和靶标，因此肥大细胞调节剂可用于治疗与肥大细胞有关的疾病或病症。

发明内容

现已发现本文所属的化合物及其药学上可接受的组合物是肥大细胞的有效调节剂，可用于治疗与之相关的疾病或病症。

本发明提供一种式(Ⅰ)的化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯，其中：

Y为N或CH，

A，M和Q分别独立的为N或CH，并且A，M和Q至少有一个是N；

R₁为苯环或3-6元含有N、或S的芳杂环，所述的R¹可任意位置被卤素、C_1-6烷基、-NO₂、-CN、-OH、卤代C_1-6烷基、-O-C_1-6烷基、-COOH或卤代-O-C_1-6烷基取代；

R₂为任意被卤素、C_1-6烷基、-NO₂、-CN、-SO₃H、C_1-6烷基硫基、-O-C_1-6烷基、噻吩、噻唑、恶唑、异恶唑、咪唑或三氮唑取代的苯环及联苯结构；

R₃为-H、卤素、C_1-6烷基、-NO₂、-CN、-OH、卤代C_1-6烷基、-O-C_1-6烷基、-COOH、-O-卤代C_1-6烷基或苯环；P为0或1。

进一步地，

其中R₁可为任意位置被卤素、-NO₂、-CN、-CF₃、甲基、-OCH₃、-COOH、-CHF₂或-O-CF₃取代。

进一步地，

R₁选自以下结构：

更进一步地，

R₂为任意位置被卤素、甲基、-NO₂、-CN、-SO₃H、甲硫基取代、-OCH₃或被噻吩、噻唑、恶唑、异恶唑、咪唑或三氮唑等芳杂环取代的苯环。

进一步地，

R₂选自以下结构：

进一步地，

R₃为-H或-OH、-OCH3、-CH3、卤素、-NO₂或被-OH、-OCH3、-CH3、卤素或-NO₂取代的苯环。

进一步地，

一种化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯，所述化合物选自：

本文中提及的卤素是指选自氟、氯、溴和碘的原子。

除非有特殊说明，在此使用脂肪烷基也即，烷基包括饱和单价的烃基，这些烃基有直链，支链或环状部分。C₁-C₆表示烷基的碳原子数为1-6的碳原子，同理的C₁-C₃比如表示烷基的碳原子数为1-3的碳原子，比如，C₁-C₆烷基包括甲基，乙基，丙基，异丙基，环丙基，n-丁基，异丁基，仲-丁基，叔-丁基，环丁基，n-戊基，3-(2-甲基)丁基，2-戊基，2-甲基丁基，新戊基，环戊基，n-己基，2-己基，2-甲基戊基和环己基。烷氧基由先前描述的直链，分支链或环状烷基组成的氧化醚。类似的，烯基和炔基包括直链，分支链或环状烯基和炔基。

在这里使用的术语“芳基”，除非有特别说明，指的是未被取代的或已被取代的芳香基，例如苯基，萘基，蒽基。术语“芳酰基”指-C(O)-芳基。

在这里使用的术语“杂环基”，除非有特殊说明，代表未被取代的或已被取代的稳定的3至8元单环饱和环体系，它们由碳原子以及从N，O，S中选的1至3个杂原子组成，其中N，S杂原子可以被随意氧化，N杂原子还可以被随意季铵化。杂环可以和任何杂原子或碳原子结合，从而组成一个稳定的结构。这类杂环的例子包括(但并不局限于)氮杂环丁烷基，吡咯烷基，四氢呋喃基，四氢噻唑基，四氢吡喃基，吗啉基，硫代吗啉基，哌啶基，哌嗪基，氧化哌嗪基，氧化哌啶基，氧化氮杂基，二氧戊环基，四氢咪唑基，四氢呃唑基，噻吗啉亚砜，噻吗啉砜以及呃二唑基。

在这里使用的术语“杂芳基”，除非有特别说明，代表未被取代或已被取代的稳定的5或6元单环芳香环体系，也可以代表未被取代或已被取代的9或10元苯稠苯杂芳环体系或二环杂芳环体系，它们由碳原子和由1至4个从N，O，S中选择的杂原子组成，其中N、S杂原子可以被氧化，N杂原子还可以被季铵化。杂芳基可以和任何杂原子或碳原子黏附起来，从而组成一个稳定的结构。杂芳基的例子包括(但并不局限于)噻吩基，呋喃基，咪唑基，吡咯基，噻唑基，噁唑基，异噁唑基，吡喃基，吡啶基，哌嗪基，嘧啶基，吡啶，吡嗪，哒嗪基，吡唑基，噻二唑基，三唑基，咪唑，吲哚基，氮杂吲哚基，吲唑基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，苯并异噁唑基，苯并噁唑基，苯并吡唑基，苯并噻唑基，苯并噻二唑基，苯并三唑基，腺嘌呤基，喹啉基或异喹啉基。

术语“羰基”指的是C(O)基。

无论何时术语“烷基”或“芳基”或任何它们的前缀词根出现在一个取代物的名称中(例如，芳烷基，二烷基氨)，它将被认为包含了以上为“烷基”和“芳基”而给出的那些限制。碳原子的指定数量(比如，C₁-C₆)将独立的表示在一个烷基部分或在一个更大的取代基中的烷基部分(其中烷基作为其前缀词根)中的碳原子的数量。

在本发明的一个优选方案中提供式(I)化合物或其异构体、互变异构体、溶剂化物，水合物及其药学上可接受的盐，

本发明还提供了制备相应化合物的方法，可以使用多种合成方法制备本文所述的化合物，包括下述的方法，本发明的化合物或者其药学上可接受的盐，异构体或水合物可以使用下述方法与有机化学合成领域已知的和合成方法，或通过本领域技术人员理解对这些方法的变化方法合成，优选方法包括但不限于下述方法。本发明提供一种制备权利要求1所述化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯的方法包括以下步骤，

在一个方案中，本发明提供一种化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯的制备方法如下：

本发明提供制备前述上述式(I)所述化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯的方法，包括以下步骤，

本发明提供一种药物组合物，包含上述化合物其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯。

一种上述化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯在制备治疗或预防糖尿病及其并发症的应用，包括给所述个体施用有效量的上述的化合物。

进一步地，所述的糖尿病并发症包括但不限于个体中外周神经病变，糖尿病的个体获得外周神经病变，糖尿病的个体的伤口的发作、或个体中基质金属蛋白酶-9增加。

本发明提供一种化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯的药物制剂，其为口服制剂、注射给药制剂或局部给药制剂。

很清楚，分子式I的化合物、异构体、晶型或前药及其可药用盐可以存在溶剂化形式和非溶剂化形式。例如溶剂化形式可以是水溶形式。本发明包括所有这些溶剂化的和未溶剂化的形式。

本发明的化合物可能有不对称的碳原子，根据它们的理化差异，通过已知技术上已成熟的方法，比如，通过色谱或分步结晶法，这种非对映异构的混合物可以被分离成单一的非对映异构体。对映异构体的分离可通过先用适当有旋光活性的化合物进行反应，把对映异构的混合物转化成非对映异构的混合物，分离非对映异构体，再把单一非对映异构体转化(水解)成相应的纯的对映异构体。所有这样的异构体，包括非对映异构体混合物和纯对映体被认为是该发明的一部分。

作为活性成分的本发明的化合物，以及制备该化合物的方法，都是本发明的内容。而且，一些化合物的晶型形式可以作为多晶体存在，这种形式也可以被包括在目前的发明里。另外，一些化合物可以和水(即水合物)或普通的有机溶剂一起形成溶剂化物，这种溶剂化物也被包括在此项发明的范畴内。

本发明的化合物可以以游离的形式用于治疗，或者在适当情况下以药学上可接受的盐或其它衍生物的形式用于治疗。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐及无机盐，此盐适用于人类和低等动物，无过度毒性、刺激性、过敏反应等，具有合理的利益/风险比。胺，羧酸，膦酸盐，和其它类型的化合物的药学上可接受的盐在所属领域中是众所周知的。该盐可以由本发明的化合物与合适的游离碱或酸反应而成。包括但不限于，与无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、高氯酸或与有机酸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、丙二酸形成的盐，或通过使用本领域熟知的方法，例如离子交换法，来得到这些盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、过3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐等。代表性的碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。其他药学上可接受的盐包括适当的无毒的铵、季铵，和使用诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根，低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐形成的胺基阳离子。

另外，本文所用术语“前药”是指一个化合物在体内可以转化为本发明式(I)所示的化合物。此转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体化合物的影响。

本发明的药物组合物包含本文所述结构式(I)化合物或其药学上可接受的盐、激酶抑制剂(小分子，多肽，抗体等)、免疫抑制剂、抗癌药、抗病毒剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗生素或抗血管过度增生化合物的另外的活性剂；以及任何药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。

本发明的化合物可以作为单独使用，也可以与一种或多种其它本发明的化合物或与一种或多种其它药剂联合使用。当联合给药时，治疗剂可以配制成同时给药或顺序地在不同的时间给药，或者所述治疗剂可以作为单一组合物给药。所谓“组合疗法”，指的是使用本发明的化合物与另一种药剂一起使用，给药方式为每种药剂同时共同给药或每种药剂顺序给药，无论哪种情况，目的都是要达到药物的最佳效果。共同给药包括同时递送剂型，以及每种化合物分别的单独剂型。因此，本发明的化合物的给药可以与已知的本领域的其他疗法同时使用，例如，在癌症治疗中使用放射治疗或细胞生长抑制剂、细胞毒性剂、其它抗癌剂等附加疗法来改善癌症状。本发明并不限于给药的顺序；本发明的化合物可以先前施用，同时施用，或在其他抗癌剂或细胞毒性剂之后施用。

为了制备这一发明的药学成分，作为其活性成分的分子式(I)的一种或多种化合物或盐类可紧密的与药学载体混合在一起，这是根据传统的制药配料技术而进行的，其中的载体可根据按不同的给药方式(例如，口服或肠外给药)设计好的制备形式而采用多种多样的形式。适当的药学上可接受的载体在技术上是众所周知的。对一些这类药学可接受的载体的描述可以在《药学赋形剂手册》里找到，该书由美国药学会和英国药学社联合出版。

本发明药物组合物可以有以下形式，比如说，适合口服给药，例如药片，胶囊，药丸，药粉，持续释放的形式，溶液或悬浮液；用于胃肠外注射如透明液，悬浮液，乳状液；或者用于局部用药如膏，霜；亦或作为栓剂用于直肠给药。药学成分也可以单位剂量的形式适合用于精确剂量的一次性给药。该药学成分将包括一种传统的药学载体或赋形剂以及根据目前的发明制成的作为活性成分的化合物，另外，也可以包括其他的医学或药学制剂，载体，辅助剂，等等。

治疗性化合物也可给于非人类哺乳动物。给一种哺乳动物所用的药物剂量将取决于该动物的种属以及它的疾病状况或其所处的失调状态。治疗性化合物可以以胶囊，片剂，含水悬浮液或溶液的形式喂给动物。也可以通过注射的方式让治疗性化合物进入动物体内。我们根据符合兽医实践标准的传统的方式制备好这些药物形式。作为一种可选择的方式，药学合成药可以同动物饲料混合在一起喂给动物，因此，浓缩的饲料添加剂或预拌饲料可以混合入普通的动物饲料。

本公开提供了治疗患有与肥大细胞相关的病症的个体(例如人)的方法，其包括给患者施用有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐或组合物的步骤。与肥大细胞相关的病症包括但不限于细菌感染、过敏反应、炎性疾病、纤维化、癌症、中枢神经系统紊乱和代谢紊乱。具体病症包括例如同种异体移植物排斥、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性引起的脉络膜新生血管形成、银屑病、关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、关节炎中的滑膜血管收缩、多发性硬化症、重症肌无力、糖尿病、糖尿病性血管病、糖尿病性神经病变、婴儿血管瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌和头颈癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌和胰腺癌、纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、再狭窄、过敏、呼吸系统疾病、哮喘、移植排斥反应、血栓形成、视网膜血管增生、炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、骨病、移植或骨髓移植排斥反应、红斑狼疮、慢性胰腺炎、恶病质、感染性休克、纤维增生和分化性皮肤病或紊乱、眼部疾病、病毒感染、心脏病、肺或肺部疾病或肾病或肾脏疾病、皮肤炎症和支气管炎。

本公开提供了延迟患有糖尿病的个体(例如人)的伤口的发作、降低其发展的风险或加速其愈合的方法，包括向个体施用有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐或组合物。

本公开提供了用于改变患有糖尿病的个体(例如人)的伤口中的M1/M2巨噬细胞比率的方法，包括向个体施用有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐或组合物。

如本文所用，延迟本文所述病症(例如，外周神经病变(PN)、小纤维神经病变(SFN)和外周糖尿病神经病变)的发作、逆转或降低获得上述病症的风险或降低上述病症的发展的风险，是指在由于病症/疾病(例如糖尿病)而具有升高的肥大细胞脱颗粒水平的个体中减少肥大细胞脱颗粒的量。已经发现患有糖尿病的个体中肥大细胞脱颗粒增加。参见例如美国临时申请号62/162,972。

如本文所用，加速伤口愈合意指式I的化合物或其药学上可接受的盐或组合物引发加速或促进伤口愈合的细胞环境。例如，式I的化合物或其药学上可接受的盐或组合物可以引发细胞因子，例如CXCL8、CCL2和CXCL7的释放，上述每一种都是伤口愈合第一阶段所必需的，从而促进伤口愈合。伤口愈合的第一阶段是持续约三天的炎症阶段，然后是持续两到三周的增殖阶段。在慢性伤口中，这种线性进展被消除，其特征在于存在低级慢性炎症。式I的化合物或其药学上可接受的盐或组合物的施用可将慢性低级炎症转化为强烈的急性炎症期，然后进展至增殖期并促进伤口愈合。

在实施方案中，所提供的式I的化合物的量使得其在生物样品或个体中作为肥大细胞稳定剂(例如肥大细胞脱颗粒抑制剂)是有效的。

术语“药学上可接受的载体、佐剂或媒介物”是指不破坏与其配制的化合物的药理学活

性的无毒载体、佐剂或媒介物。可用于本公开的组合物中的药学上可接受的载体、佐剂或媒

介物包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，例如人血清白蛋白，缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。

本文所述的药学上可接受的组合物可以是以任何口服可接受的剂型给药，包括但不限于胶囊、片剂、含水悬浮液或溶液。在口服用片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服使用含水悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂混合。如果需要，还可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。

本文所述的药学上可接受的组合物还可以以可注射的形式制备。可以使用合适的分散

剂或湿润剂和悬浮剂根据已知技术配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。

可以与载体材料组合以产生单一剂型的组合物的本文所述化合物的量将根据所治疗

的宿主和特定的给药方式而变化。

本文所述的药学上可接受的组合物也可局部给药，特别是当治疗目标包括局部施用易

于接近的区域或器官时，包括眼、皮肤或下肠道的疾病。对于这些区域或器官中的每一个，容易制备合适的局部制剂。用于下肠道的局部施用可以以直肠栓剂制剂(参见上文)或以合适的灌肠剂制剂实现。也可以使用局部透皮贴剂。

肥大细胞的调节(或调节肥大细胞)是指从施用一种或多种本文所述化合物开始发生肥大细胞活性的变化或交替。调节可以是上调(增加)或下调(减少)肥大细胞的活性或功能的大小。示例性活性和功能包括例如结合特征、酶活性、细胞受体活化、转录活性和信号转导。在一个方面，本文描述的化合物可稳定肥大细胞。在其他方面，本文描述的化合物充当肥大细胞脱颗粒抑制剂。

如本文所用，“EC₅₀”意图是指使生物过程或过程组分(包括蛋白质、次单元、细胞器、核糖核蛋白等)50％起效或活化所需的物质(例如化合物或药物)的浓度。在一个方面，EC₅₀可以是指如本文中的其它地方所进一步定义，体内50％起效或活化所需的物质的浓度。在另一个方面，EC₅₀是指激起基线与最大反应之间的一半反应的促效剂或活化剂的浓度。

本文所用，“IC₅₀”意图是指使生物过程或过程组分(包括蛋白质、次单元、细胞器、核糖核蛋白等)50％被抑制所需的物质(例如化合物或药物)的浓度。

是指如本文中的其它地方所进一步定义，体内50％抑制所需的物质的血浆浓度。更通常地，IC₅₀是指体外抑制过程或活性所需的物质的半最大(50％)抑制浓度(IC)。

制备本发明的化合物

进一步地，本发明提供一种化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯，所述化合物为：

附图说明

图1说明了本文所述化合物18的治疗对糖尿病小鼠的伤口愈合效果。

图2说明了用本文所述化合物18的治疗对糖尿病小鼠完整皮肤中M1/M2比率的影响。

图3显示了化合物18剂量依赖性地抑制肥大细胞释放β-hex。测量细胞培养上清液中释放的β-Hex，并与细胞裂解物中的总β-Hex进行比较(报告为％)。

图4显示了化合物18剂量依赖性的抑制活化的肥大细胞中NFAT的核易位。

具体实施方式

本发明的化合物可以根据以下反应方案1和其实施例或修改中所示的程序，使用合成有机化学领域的技术人员众所周知的容易得到的起始物质、试剂和常规程序或其变体制备。方案中变量的特定定义仅仅是为了例示而给出，且不打算限制所描述的程序。

试剂和溶剂购自市售来源并且无需进一步纯化即可使用。所有反应均按照指定的程序和条件进行。所有反应通过LC/MS分析或在烘干玻璃器皿中进行并通过薄层色谱法(TLC)使用硅胶监测完成情况(通过紫外光目测，或通过用KMnO4染色或Hanessian染色处理来显影)。LC/MS分析在Agilent 1200HPLC/UV(220nm和/或254nm波长)系统上进行，该系统与质谱(Applied Biosystems，MDS SCIEX，Q TRAP LC/MS/MS)检测器连接。400MHz BrukerNMR用于在CDCl₃、CD₃OD或d₆-DMSO中获得¹H和¹³C-NMR谱。所有NMR化学位移(δ)都以相对于残余同位素溶剂校准后的百万分率报导，且耦合常数(J)以Hz报导。在生物测试前，抑制剂纯度通过Water的反相HPLC(rpHPLC)评估。rpHPLC分析使用Microsorb-MV 30nm C18250mm×4.6mm柱，使用定在1mL/min的洗脱剂流速并使用(A)含0.1％TFA的水与(B)含10％H₂O和0.1％TFA的乙腈溶液的梯度混合物进行。在100％A的初始2分钟时期后，使用50％A和50％B到100％B的线性梯度和100％A到100％B的第二线性梯度证实配体纯度。线性梯度由(I)每分钟5.2％和254nm下UV检测或(II)每分钟1.8％和254nm下检测的改变溶剂组成来组成，每个以100％B后5分钟结束。通过HPLC测量，生物学上评估的化合物＞95％化学纯度。

实施例1

N-(2,4-双(三氟甲基)苯基)-5-(2,6-二氯苄基)-5H-吡咯[2,3-b]吡嗪-7-甲酰胺

在0℃下，向a(500mg,1.0eq)中缓慢加入NaH(184mg,1.5eq),室温继续搅拌半小时后，0℃滴加b(600mg,1.0eq)，缓慢升至室温继续搅拌半小时，TLC监测，0℃缓慢加水淬灭后，用2M稀盐酸酸化,加入乙酸乙酯和水萃取并合并有机相，接着用盐水洗涤有机物，经Na₂SO₄干燥并真空浓缩。所得残余物使用Biotage Isolera自动柱色谱仪，在EA和PE梯度中纯化，并接着在减压下干燥。得到黄色固体c(940mg，95％)。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H5.43(s,2H),7.02(s,1H),7.45(m,1H),7.61(m,2H),8.37(d,J＝6.4Hz,2H),12.48(s,1H)；LRMS(ES+)[C₁₄H₉Cl₂N₃O₂+H]的计算值323.1实验值323.3。

将c(600mg,1.0eq)加入到二氯甲烷(15mL)中，然后加入草酰氯(0.237mL,1.5eq),然后加入1滴催化量的DMF,室温搅拌半小时后，减压除去溶剂后，缓慢加入到d(427mg,1.0eq)和三乙胺(283mg,1.5eq)二氯甲烷溶液中后继续搅拌2小时，加入二氯甲烷和水萃取并合并有机相，接着用盐水洗涤有机物，经Na₂SO₄干燥并真空浓缩。所得残余物用制备型HPLC纯化并立刻从洗脱液冷冻干燥得到755mg化合物1，为白色固体(76％)。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.49(s,2H),7.01-7.03(m,2H),7.47(m,1H),7.61-7.62(m,3H),7.91(s,1H),8.39(d,J＝6.4Hz,2H),9.68(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 50.1,111.2,116.5,120.9,121.7,123.7,124.5,125.8,126.4,127.4,127.9,128.4,134.3,135.6,139.1,144.7,145.6,151.4,164.3；LRMS(ES+)[C₂₂H₁₂Cl₂F₆N₄O+H]的计算值534.2实验值534.4。

实施例2

N-(5-氰基吡啶-2-基)-1-(2,4-二氯苄基)-5-甲氧基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物2。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 3.78(s,3H),5.48(s,2H),7.03(m,1H),7.15-7.18(m,2H),7.42(s,1H),7.62(s,1H),7.91(d,J＝6.2Hz,1H),8.31(s,1H),8.46(d,J＝6.2Hz,1H),8.74(s,1H),10.81(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 53.7,55.4,99.6,110.7,112.4,115.8,117.0,119.9,126.7,127.3,130.4,130.7,131.9,133.1,135.5,136.7,139.6,142.4,147.2,151.8,155.4,164.3；LRMS(ES+)[C₂₂H₁₅Cl₂N₅O₂+H]的计算值453.1实验值453.3。

实施例3

1–(2,4-二氯苄基)-5-甲氧基-N-(2,4,6-三(三氟甲基)苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物3。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H3.80(s,3H),5.49(s,2H),7.05(m,1H),7.16-7.18(m,2H),7.41(s,1H),7.63(s,1H),7.81(s,2H),8.32(s,1H),10.11(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 53.5,55.6,112.5,115.7,119.4,121.3,125.1,125.9,126.5,126.8,127.5,127.7,130.0,130.4,131.7,132.6,135.6,136.4,139.5,147.2,164.3；LRMS(ES+)[C₂₅H₁₄Cl₂F₉N₃O₂+H]的计算值631.0实验值631.2。

实施例4

1-(2,4-二氯苄基)-N-(2,6-二氟苯基)-6-苯基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物4。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.49(s,2H),6.93(m,2H),7.05(m,1H),7.13-7.18(m,3H),7.42-7.51(m,4H),7.64(s,1H),7.81(d,J＝6.4Hz,1H),8.31(m,2H),10.31(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 53.4,111.5,112.3,113.4,115.8,116.6,125.4,126.7,127.5,127.6,127.8,129.5,129.9,130.4,131.9,132.2,135.9,136.4,139.1,148.3,150.4,164.1,164.6；LRMS(ES+)[C₂₇H₁₇Cl₂F₂N₃O+H]的计算值509.1实验值509.4。

实施例5

N-(2,6-二甲基苯基)-1-(4-(恶唑-5-基)苄基)-1H-吡咯[3,2-c]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物5。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 2.14(s,6H),5.52(s,2H),7.04-7.06(m,4H),7.15(s,1H),7.40(m,2H),7.54(d,J＝8.6Hz,1H),7.75(m,2H),7.93(s,1H),8.31(m,J＝8.6Hz,1H),9.31(s,1H),10.25(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 17.9,52.1,105.7,108.5,110.2,121.5,123.8,124.7,125.6,126.7,127.5,129.6,130.5,134.7,137.8,142.6,143.1,148.2,149.6,150.0,164.3；LRMS(ES+)[C₂₆H₂₂N₄O₂+H]的计算值423.2实验值423.3。

实施例6

N–(2,6-二氯苯基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物6。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 3.85(s,3H),5.54(s,2H),6.88(d,J＝10.4Hz,2H),7.15-7.17(m,3H),7.40(m,1H),7.54-7.55(m,3H),8.38(m,1H),9.44(s,1H),10.23(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C52.4,55.7,105.6,108.7,110.4,114.3,123.7,126.5,128.5,129.1,129.3,130.4,133.8,142.1,143.4,148.4,157.2,164.1；LRMS(ES+)[C₂₂H₁₇Cl₂N₃O₂+H]的计算值427.1实验值427.4。

实施例7

N-(2,6-二氟苯基)-1-(4-(恶唑-5-基)苄基)-1H-吡咯[3,2-c]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物7。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.55(s,2H),6.96(m,2H),7.08-7.12(m,3H),7.40(m,2H),7.54(d,J＝8.6Hz,1H),7.74(m,2H),7.92(s,1H),8.33(m,J＝8.6Hz,1H),9.41(s,1H),10.27(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 52.6,105.4,108.6,110.7,111.3,112.4,121.5,123.4,124.7,125.1,125.4,129.6,137.2,142.3,143.5,148.2,149.9,150.0,164.1,164.4；LRMS(ES+)[C₂₄H₁₆F₂N₄O₂+H]的计算值421.1实验值421.3。

实施例8

1-((2’,4’-二氯-[1,1’-联苯基]-4-基)甲基)-N-(2,6-二氟苯基)-1H-吡咯[3,2-c]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物8。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.53(s,2H),6.93(m,2H),7.10-7.12(m,2H),7.40-7.44(m,5H),7.57(d,J＝8.6Hz,1H),7.68-7.72(m,2H),8.36(m,J＝8.4Hz,1H),9.47(s,1H),10.24(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 52.4,105.7,108.5,110.4,111.1,112.3,123.7,125.3,127.2,127.6,129.1,130.7,130.8,134.2,134.8,135.9,136.7,137.8,142.6,143.0,148.5,164.5,164.2；LRMS(ES+)[C₂₇H₁₇Cl₂F₂N₃O+H]的计算值509.1实验值509.3。

实施例9

1-(2,6-二氯苄基)-N-(5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-1H-吡咯[3,2-c]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物9。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.56(s,2H),7.12(s,1H),7.43-7.52(m,4H),8.32(m,J＝8.4Hz,1H),8.59(s,2H),9.33(s,1H),10.89(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 49.1,105.7,108.3,110.6,119.4,123.4,124.3,126.7,127.6,135.8,138.4,142.7,143.2,155.4,157.2,164.8；LRMS(ES+)[C₂₀H₁₂Cl₂F₃N₅O+H]的计算值467.0实验值467.2。

实施例10

1-(2-氯-4-氰基苄基)-N-(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1H-吡咯[3,2-c]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物10。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.54(s,2H),7.13(s,1H),7.25(d,J＝8.4Hz,1H),7.48-7.62(m,4H),8.22(d,J＝8.4Hz,1H),8.39(m,1H),8.55(s,1H),9.43(s,1H),10.96(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C53.2,,105.3,108.4,109.2,110.5,111.2,118.6,118.8,123.3,124.2,130.5,131.4,131.7,135.5,137.6,142.8,143.0,148.2,148.7,149.2,164.7；LRMS(ES+)[C₂₂H₁₃ClF₃N₅O+H]的计算值457.2实验值457.3。

实施例11

N-(2,4-双(三氟甲基)苯基)-1-(2,6-二氯苄基)-1H-吡咯[3,2-c]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物11。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.55(s,2H),7.12-7.13(m,2H),7.45-7.57(m,5H),7.88(s,1H),8.44(d,J＝10.2Hz,1H),9.47(s,1H),9.82(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 48.6,105.3,108.4,110.7,115.6,120.8,123.4,123.7,124.5,125.6,126.7,126.9,127.4,128.3,134.2,135.4,138.4,142.2,143.5,148.9,148.7,164.5；LRMS(ES+)[C₂₃H₁₃Cl₂F₆N₃O+H]的计算值533.0实验值533.3。

实施例12

5-溴-1-(2,4-二氯苄基)-N-(2,6-二氟苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物12。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.60(s,2H),6.88-7.03(m,3H),7.13-7.16(m,3H),7.58(s,1H),8.04(s,1H),9.16(s,1H),10.19(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 52.4,111.1,112.4,113.0,115.4,120.8,125.6,126.7,127.3,130.4,131.2,131.6,132.8,135.7,136.4,144.7,147.5,164.2,164.5；LRMS(ES+)[C₂₁H₁₂BrCl₂F₂N₃O+H]的计算值510.9实验值510.8。

实施例13

1-(2,4-二氯苄基)-N-(2,6-二氟苯基)-5-硝基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物13。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.49(s,2H),6.93-7.01(m,3H),7.14-7.18(m,3H),7.70(s,1H),8.54(s,1H),9.22(s,1H),10.16(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 53.1,111.4,112.3,115.7,120.4,123.5,125.6,126.7,127.6,130.4,131.6,131.7,132.9,135.8,36.4,137.5,154.2,164.3,164.9；LRMS(ES+)[C₂₁H₁₂Cl₂F₂N₄O₃+H]的计算值478.0实验值478.3。

实施例14

N-(3,5-双(三氟甲基)苯基)-1-(2-氯-4-氰基苄基)-1H-吡唑[4,3-c]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物14。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.38(s,2H),7.22(d,J＝9.6Hz,1H),7.45-7.53(m,3H),7.59(s,1H),8.04(s,1H),8.35(d,J＝8.2Hz,1H),9.44(s,1H),9.86(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 55.3,102.6,111.3,113.5,118.4,118.5,124.6,126.3,129.7,130.3,131.0,131.3,135.1,136.6,142.5,143.3,143.9,148.3,158.7；LRMS(ES+)[C₂₃H₁₂ClF₆N₅O+H]的计算值525.1实验值525.4。

实施例15

1-(2-氯-4-氰基苄基)-N-(全氟苯基)-1H-吡咯[3,2-b]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物15。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.56(s,2H),7.12(s,1H),7.25-7.31(m,2H),7.49(s,1H),7.54(d,J＝6.4Hz,1H),8.04(m,1H),8.45(d,J＝8.2Hz,1H),10.18(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 53.2,110.5,110.7,111.6,118.7,121.6,123.1,123.3,130.4,130.9,131.2,131.5,135.1,138.8,140.2,142.7,149.5,151.3,164.6；LRMS(ES+)[C₂₂H₁₂ClF₅N₄O+H]的计算值478.0实验值478.2。

实施例16

1-(2,4-二氯苄基)-N-(2,6-二氟苯基)-5-氟-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物16。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.50(s,2H),6.98-7.02(m,3H),7.15-7.22(m,3H),7.51(m,1H),7.63(s,1H),8.24(m,1H),8.45(d,J＝8.2Hz,1H),10.25(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 52.4,111.5,112.3,115.4,115.5,120.7,125.6,126.9,127.3,130.4,131.2,131.9,135.4,136.5,144.0,152.8,164.3,164.6；LRMS(ES+)[C₂₁H₁₂Cl₂F₃N₃O+H]的计算值451.0实验值451.3。

实施例17

5-氯-N-(2,6-二氯苯基)-1-(2,4-二氟苄基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物17。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.52(s,2H),6.65(m,1H),6.79(s,1H),7.12-7.13(m,2H),7.28(m,1H),7.57(m,2H),7.97(s,1H),8.64(s,1H),10.23(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 51.3,104.4,111.2,115.4,120.6,120.7,124.1,126.0,127.3,128.4,128.5,129.6,132.5,133.7,142.8,146.7,158.2,163.1,164.4；LRMS(ES+)[C₂₁H₁₂Cl₃F₂N₃O+H]的计算值467.0实验值467.4。

实施例18

7-(2,4-二氯苄基)-N-(2,6-二氟苯基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-5-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物18。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.54(s,2H),6.65(m,1H),6.99-7.02(m,3H),7.14-7.19(m,3H),7.58(s,1H),8.82(s,1H),9.18(s,1H),10.18(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 53.2,108.4,110.5,111.4,112.6,123.8,125.4,126.7,130.2,131.1,132.5,135.7,136.4,149.2,151.3,151.7,164.2,164.8；LRMS(ES+)[C₂₀H₁₂Cl₂F₂N₄O+H]的计算值434.0实验值434.1。

实施例19

N-(2,6-双(三氟甲基)苯基)-1-(2-氯-4-硝基苄基)-1H-吡咯[2,3-c]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物19。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.51(s,2H),7.11(s,1H),7.25(m,3H),7.34-7.39(m,2H),7.68(m,2H),8.02(m,1H),8.18(s,1H),8.45(m,1H),8.76(s,1H),10.24(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 52.4,,108.1,110.5,110.7,116.6,121.8,122.4,123.7,124.5,124.8,126.1,130.0,131.2,134.0,134.4,135.1,144.8,146.3,164.7；LRMS(ES+)[C₂₃H₁₃ClF₆N₄O₃+H]的计算值544.1实验值544.3。

实施例20

N-(2,6-双(三氟甲基)苯基)-1-(2,4-二氯苄基)-1H-吡咯[2,3-c]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物20。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.52(s,2H),7.06(m,1H),7.12-7.21(m,3H),7.32(m,1H),7.68-7.72(m,3H),8.33(m,1H),8.65(s,1H),10.20(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C53.1,108.3,110.5,110.7,116.4,122.1,123.8,124.6,126.4,126.5,130.1,130.5,131.5,132.8,134.1,134.5,135.6,136.4,144.2,164.7；LRMS(ES+)[C₂₃H₁₃Cl₂F₆N₃O+H]的计算值533.0实验值533.1。

实施例21

1-(2,4-二氯苄基)-N-(3-氟-4'-(三氟甲基)-[1,1'-联苯基]-4-基)-1H-吡咯[3,2-c]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物21。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.53(s,2H),7.03(m,1H),7.18-7.20(m,2H),7.29(m,2H),7.44-7.50(m,2H),7.62-7.68(m,4H),7.84(m,1H),8.27(m,1H),9.46(s,1H),10.19(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 54.1,105.7,108.3,110.5,116.4,118.3,123.0,123.1,124.5,125.3,126.7,128.9,129.5,130.5,131.7,132.4,135.6,136.4,137.5,142.6,143.5,144.2,142.6,148.1,163.2,164.4；LRMS(ES+)[C₂₈H₁₇Cl₂F₄N₃O+H]的计算值559.1实验值559.2。

实施例22

1-(2,4-二氯苄基)-N-(2,6-二甲基苯基)-1H-吡咯[3,2-b]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物22。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 2.18(s,6H),5.52(s,2H),7.03-7.04(m,4H),7.16-7.19(m,3H),7.59(s,1H),7.98(m,1H),8.33(m,1H),10.25(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 18.2,53.9,110.4,110.6,121.5,123.6,123.4,126.5,127.0,130.1,130.8,130.9,131.6,132.5,134.3,135.4,136.6,149.5,164.3；LRMS(ES+)[C₂₃H₁₉Cl₂N₃O+H]的计算值425.1实验值425.3。

实施例23

1-(2,4-二氯苄基)-N-(2,4,6-三氟苯基)-1H-吡唑[3,4-c]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物23。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 5.49(s,2H),6.57(m,2H),7.05(m,1H),7.22(m,1H),7.49(m,1H),7.78(s,1H),8.37(m,1H),8.76(s,1H),10.75(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C55.3,100.2,102.5,107.4,116.0,125.6,126.9,130.4,131.7,132.2,135.9,136.8,140.5,143.2,144.6,158.1,161.2,166.5；LRMS(ES+)[C₂₀H₁₁Cl₂F₃N₄O+H]的计算值452.0实验值451.9。

实施例24

1-(2,4-二甲氧基苄基)-N-(2,6-二甲基苯基)-1H-吡咯[3,2-b]吡啶-3-甲酰胺

按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备化合物24。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ_H 2.18(s,6H),3.68(s,3H),3.80(s,3H),5.53(s,2H),6.37(m,2H),7.09(m,3H),7.12-7.21(m,3H),7.78(m,1H),8.36(m,1H),10.25(s,1H)¹³C(100MHz,d₆-DMSO)δ_C 18.5,52.9,55.6,56.3,100.4,106.3,110.2,110.6,121.1,123.5,123.8,126.7,127.3,130.5,130.7,131.5,134.8,149.3,156.4,159.1,164.7；LRMS(ES+)[C₂₅H₂₅N₃O₃+H]的计算值416.2实验值416.5。

试验例

细胞内Ca²⁺浓度的测量。

将RBL-2H3细胞(ATCC)以4×10⁴个细胞/孔接种于在补充有2％FBS的DMEM的96孔板中，并使其粘附过夜。然后用50μl不含Ca²⁺的Tyrode溶液替换培养基，以1:1将Ca²⁺-探针Fluo-4NW(Molecular Probe，Thermo Fisher，MA，USA)加载到细胞中。在探针加载期间从开始提供指定浓度的新化合物。细胞在存在或不存在新化合物的情况下，在不含Ca²⁺的培养基中于37℃温育60分钟。在温育的最后5分钟期间，用1μM毒胡萝卜素(Sigma Aldrich)处理细胞以消耗[Ca²⁺]_ER。将在盐水溶液中的20mM CaCl₂补充回至[Ca²⁺]_ER耗尽的细胞，最终为2mM。在再加载Ca²⁺后1分钟除去细胞培养基，并用多模板读数器(FilterMax F5MolecularDevices/Thermo Fisher Scientific，MA，USA)记录Fluo-4NW荧光(RFU)的变化，激发波长为485nm，发射波长为535nm。

核NFAT、脱颗粒和细胞因子释放。

RBL-2H3细胞中的[Ca²⁺]_ER在CRAC通道阻断剂存在下以与[Ca²⁺]_i测量相同的方式通过Tg耗尽，但不用Fluo-4NW加载细胞。然后在相应浓度的CRAC通道阻断剂存在下补充200μl DMEM-3％FBS(含有3mMCa²⁺)。在添加Ca²⁺后30分钟，收集培养上清液用于脱颗粒测量。根据测定试剂盒(Sigma-Aldrich，MO，USA)的方案测量脱颗粒作为分泌的β-己糖胺酶。通过使用亚细胞蛋白质分级试剂盒(NE-PER^TM Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents，Pierce Biotechnology，Thermo FisheRScientific，MA，USA)从NFAT细胞制备核部分。用ELISA试剂盒(Active Motif，CA，USA)测量核NFAT-c1。此时，用ELISA试剂盒(R&D SystemsMN，USA)测量TNFα作为预先存储的释放。在Ca²⁺添加后的部分中，延长温育4小时以测量从头产生的细胞因子TNFα。

细胞毒性。

在RBL-2H3细胞中测试毒性。将细胞以4×10⁴个细胞/孔接种于在补充有2％FBS的DMEM中的96孔板中，并使其粘附过夜。然后将细胞以指定浓度暴露于MCS化合物4小时。通过使用计数测定法(CCK8细胞计数试剂盒，Dojindo Molecular Technologies，MD，USA)测定细胞活力。

数据分析。使用Prims Graphpad软件通过非线性回归计算IC₅₀和EC₅₀。通过单向ANOVA和事后检验(Tukey检验)进行统计学分析。

抑制活性

使用RBL-2H3啮齿动物MC细胞系作为主要的体外试验测定所述化合物对钙内流的抑制活性。已知RBL-2H3细胞表达功能性CRAC通道。毒胡萝卜素(Tg)是一种肌质网/内质网(ER)Ca²⁺-ATP酶(SERCA)抑制剂，通过消耗ER储存中的Ca²⁺([Ca²⁺]ER)选择性激活CRAC通道。Fluo-4NW被用作分子传感器来检测细胞内钙浓度([Ca²⁺]_i)。在这些测定条件下，在用Tg(1μM)处理的RBL细胞中始终观察到比未处理的静息MC中高约3.5倍的[Ca²⁺]_i。IC₅₀结果如表2所示。

表2

化合物	IC<sub>50</sub>(μM)	化合物	IC<sub>50</sub>(μM)	化合物	IC<sub>50</sub>(μM)
						1	<10	9	<30	17	>30
2	>30	10	>30	18	<10
						3	<10	11	<30	19	<30
4	>30	12	<10	20	<10
						5	<30	13	>30	21	>30
6	<10	14	<30	22	<30
						7	>30	15	<30	23	<30
8	>30	16	>30	24	>30

化合物18用于通过测量MC活化时预先储存的β-己糖胺酶(β-hex)的释放来确定MC脱颗粒的抑制。在不存在或存在各种浓度的化合物18的情况下，通过在不含Ca²⁺培养物中处理1μM毒胡萝卜素来活化RBL-2H3细胞。在测定培养基补充细胞外Ca²⁺30分钟后，通过ELISA分析上清液和细胞裂解物的β-hex浓度。上清液中的β-hex与β-hex的总量(在上清液和细胞裂解物中)之间的比率表明，化合物18显著地且剂量依赖性地抑制β-hex的释放(参见图3)。在不存在CRAC抑制剂的情况下，释放出40％的β-hex，而化合物18在所测试的最高浓度下显示出几乎完全抑制β-hex的释放。

化合物18在活化的MC中对活化的T细胞核因子(NFAT)的核易位的抑制已得到验证。核因子NFAT是许多细胞因子(包括TNFα)的主要调节因子。胞质NFAT被磷酸酶钙调神经磷酸酶去磷酸化，这导致NFAT的核易位和随后的用于表达相应的细胞因子基因被激活。在不存在或存在各种浓度的化合物18的情况下，首先用不含Ca²⁺培养物中的1μM毒胡萝卜素处理RBL细胞，然后用细胞外Ca²⁺补充30分钟。通过亚细胞蛋白质分级从细胞制备核部分，并通过ELISA测量核NFAT-c1含量。与静息MC相比，活化MC中核NFAT的成倍增加，这表明MC的活化水平。在没有CRAC通道阻断剂的情况下，我们观察到活化的MC中核NFAT增加了5倍，并且化合物18显著地且剂量依赖性地降低了活化的RBL细胞中NFAT-c1的核部分(图4)。此外，在8.1μM或更高浓度下，化合物18能够将核NFAT的水平恢复为静息MC的水平。

已筛选出相应的化合物，并证明其剂量依懒性地抑制活化的MCs对TNFα蛋白的产生作用。肥大细胞可以在激活后立即分泌预先储存的TNFα，以及需要几个小时才能从头合成的TNFα。在存在各种浓度的CRAC通道阻断剂的情况下，如上所述类似地激活RBL细胞。将RBL细胞再次暴露于Ca²⁺4小时后，通过ELISA测量上清液中分泌的TNFα(其代表预先储存的和从头合成的TNFα蛋白)。化合物显示剂量依赖性地抑制TNFα蛋白分泌(表3)。

表3

糖尿病小鼠的伤口愈合

使用链脲佐菌素(STZ)造成C57B16小鼠糖尿病(DM)模型，并使用四氧嘧啶造成兔DM模型。选择10天的伤口愈合期，因为非DM小鼠和兔子中至少80％的伤口在该时间点愈合。按照WO2014/169250中描述的方法产生基于藻酸盐绷带的用于局部持续释放化合物18的敷料，然后在受伤前(伤前)或受伤后(伤后)应用于DM小鼠的剃毛的背部。在非DM和DM小鼠中对FDA批准的MC稳定剂、色甘酸二钠(DSCG)(酮替芬、色甘酸钠、色甘酸二钠目前常用的肥大细胞稳定剂)50mg/kgDSCG(每天腹膜内(ip)，创伤前连续10天)进行比较，然后进行伤口手术。监测伤口愈合10天。

结果显示，每日腹膜内注射DSCG改善了糖尿病小鼠伤口愈合。见图1，*p<0.05。然而，还发现化合物18的局部施用(伤前10天或伤后10天)改善了伤口愈合，类似于全身性DSCG预处理。见图1。另外，在DM小鼠的皮肤中，用化合物18处理10天，而没有任何伤口，增加了M2巨噬细胞的数量。见图2。类似地，DSCG处理降低了完整皮肤中的M1/M2比率。这些结果表明MC稳定剂最有可能通过增加M2来促进M1/M2比率降低。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种式(Ⅰ)的化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯，其中：

Y为N或CH，

A，M和Q分别独立的为N或CH，并且A，M和Q至少有一个是N；

2.根据权利要求1所述的化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯，其中R₁可为任意位置被卤素、-NO₂、-CN、-CF₃、甲基、-OCH₃、-COOH、-CHF₂或-O-CF₃取代。

3.根据权利要求1所述的化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯，R₁选自以下结构：

4.根据权利要求1所述化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯，R₂为任意位置被卤素、甲基、-NO₂、-CN、-SO₃H、甲硫基取代、-OCH₃或被噻吩、噻唑、恶唑、异恶唑、咪唑或三氮唑芳杂环取代的苯环。

5.根据权利要求1所述化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯，R₂选自以下结构：

6.根据权利要求1所述的化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯，R₃为-H或-OH、-OCH3、-CH3、卤素、-NO₂或被-OH、-OCH3、-CH3、卤素或-NO₂取代的苯环。

7.一种化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯，所述化合物选自：

8.一种制备权利要求1所述化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯的方法包括以下步骤，

9.一种制备权利要求1所述化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯的方法包括以下步骤，

10.一种药物组合物，包含权利要求1至7中任一项所述化合物其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯。

11.一种权利要求1-7所述化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯在制备治疗或预防糖尿病及其并发症的应用，包括给所述个体施用有效量的权利要求1-7所述的化合物。

12.根据权利要求11所述的应用，所述的糖尿病并发症包括但不限于个体中外周神经病变，糖尿病的个体获得外周神经病变，糖尿病的个体的伤口的发作、或个体中基质金属蛋白酶-9增加。

13.一种包含权利要求1-7所述化合物，其药学上可接受的盐，异构体，溶剂化物，晶型，水合物，或其酯的药物制剂，其为口服制剂、注射给药制剂或局部给药制剂。