CN110415787B - 调节糖尿病患者尿液微生态结构的营养制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种调节糖尿病患者尿液微生态结构的营养制剂的制备方法，具体包括四个步骤，分别为：健康个体尿液微生态数据库的建立；糖尿病患者尿液微生态的采集、微生态结构的数据统计及与健康个体尿液微生态数据库的比对分析，确定导致患者尿液微生态发生紊乱的功能菌；营养素摄入量与功能菌的回归模型的构建及对膳食摄入的指导分析；针对性营养制剂的形成。通过上述步骤形成的个体化的尿液微生态紊乱调节制剂，针对性强，调节效果显著。

Description

调节糖尿病患者尿液微生态结构的营养制剂的制备方法
技术领域
本发明涉及制剂制备技术领域，具体是涉及一种调节糖尿病患者尿液微生态结构的营养制剂的制备方法。
背景技术
糖尿病患者较非糖尿病患者更易发生感染，其中泌尿系统是最常见的受感染部位。相关调查显示，因糖尿病诱发尿路感染而住院治疗的人数比因其它因素导致尿路感染者高约2倍；2型糖尿病患者发生尿路感染的机率更是比非糖尿病患者高60％。
微生态是指存在于机体的微生物，它包括真核生物、古生菌、细菌和病毒等。通常来说，微生态不仅不会对机体产生危害，而且有利于维持机体健康，它可帮助机体免疫系统辨别外界侵袭物是否有害，甚至产生抗炎因子帮助机体抵抗病原微生物的侵袭。近年来公布的研究成果显示人体膀胱中的尿液也存在微生态，而且尿液微生态的结构可反映糖尿病的严重程度。同时，尿液微生态还受人体膳食结构的影响，所以可根据尿液微生态的结构来反推糖尿病患者的膳食结构是否合理，而调节患者的膳食结构、制备相应的调节膳食结构的制剂又可以起到调整患者尿液微生态结构的作用，可在一定程度上改善患者病情。
发明内容
本发明的目的在于通过对糖尿病患者尿液微生态结构的分析来制备一种个体化调节糖尿病患者尿液微生态结构的营养制剂。
本发明的技术方案为：调节糖尿病患者尿液微生态结构的营养制剂的制备方法，具体包括如下步骤：
1.健康个体尿液微生态数据库的建立：
使用导尿术采集100例健康个体未受到会阴部及尿道外口细菌污染的尿液样本，其中男、女各50例，老年与非老年各50例，以使样本具有性别和年龄的代表性；
提取尿液细菌DNA，采用引物341F和806R进行聚合酶链式反应，设计合成含有测序接头的双Index融合引物，以基因组DNA为模板，进行融合引物PCR，磁珠筛选目的Amplicon片段，最后，用合格的文库进行cluster制备和测序，用下机得到的数据进行相应的生物信息分析，下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data方可用于后期分析，通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags，在给定的相似度下将Tags聚成OTU，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释，利用UPARSE在97％相似度下进行聚类，得到OTU的代表序列，得到OTU代表序列后，通过RDP classifer(v2.2)软件将OTU代表序列与数据库Greengene 2013.5比对，进行物种注释，置信度阈值设置为0.6，采用Decontam(v 1.2.1)过滤污染序列，过滤值设置为小于0.1，从而防止污染序列对样本信息的影响，通过上述生物学信息分析，得到健康个体尿液微生态数据库；
2.糖尿病患者尿液微生态结构与健康个体尿液微生态数据库的比对：
采用与健康人体相同的尿液样本采集方法和生物信息学分析方法，对个体糖尿病患者的尿液微生态结构进行统计分析，以判断其是否发生了微生态紊乱，如果患者尿液中某一细菌的相对丰度超过了健康个体尿液微生态数据库中该细菌的相对丰度的上限或下限，则判断为微生态紊乱，并进一步将患者发生紊乱的细菌定义为功能菌；
3.营养素摄入量与功能菌的回归模型的构建及对膳食摄入的指导分析；
叮嘱患者在采集微生态标本前3天使用智能秤精准监测每日膳食摄入量，并用相关软件将每日摄入的食物转换为营养素摄入量，计算患者平均每日摄入的营养素，最后，将营养素摄入量作为自变量，将步骤2中已确定的功能菌作为因变量，利用SPSS24.0逐步回归分析，根据分析结果辨别影响功能菌相对丰度的营养素，进一步判断患者需要调节摄入的营养素种类；
4.针对性营养制剂的形成：
通过步骤3得知导致患者微生态结构紊乱的营养素种类后，利用SPSS软件和Pearson计算功能菌的相对丰度与导致功能菌相对丰度超过或低于数据库中该细菌相对丰度的上限或下限的营养素之间的相关系数r，以确定其相关程度，如果r值所对应的p值<0.05(p值是指当原假设为真时所得到的样本观察结果或更极端结果出现的概率。如果p值很小，说明原假设情况的发生的概率很小，而如果出现了，根据小概率原理，我们就有理由拒绝原假设，p值越小，我们拒绝原假设的理由越充分)，则进一步证实是该营养素的摄入不足导致患者尿液微生态中功能菌相对丰度的升高，接下来，在SPSS中逐步增加该营养素的摄入量，每一次以5％的增幅递增，直至r值所对应的p值≥0.05，表明患者达到这种摄入量时功能菌将不会因该种营养素的摄入量不足而发生改变，将此时营养素的量减去步骤3中患者每日的平均摄入量，得到营养制剂中该营养素所需添加的剂量，其它营养素的补充剂量均照此方法计算，并将这些营养素配制成胶囊制剂，从而形成个体化的微生态紊乱调节制剂。
进一步地，步骤1中健康个体的入选标准为：无糖尿病或其它代谢性疾病、无基础疾病、C-反应蛋白正常、尿液分析所有参数正常、近一个月未发生过尿路感染、近一个月内未使用过抗生素和益生菌制剂。
本发明的有益效果为：
本发明公开一种调节糖尿病患者尿液微生态结构的营养制剂的制备方法，通过比较糖尿病患者与健康个体的尿液微生态数据综合分析患者体内营养素的摄入情况，并辨明相关营养素对功能菌的影响后再通过科学合理的步骤形成个体化的尿液微生态紊乱调节制剂，针对性强，调节效果明显。
附图说明
图1为本发明实施例公开的健康人体尿液微生态数据库图表；
图2为本发明实施例公开的营养素与葡萄球菌的回归分析模型统计图表。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
1.健康人体尿液微生态数据库的建立
使用导尿术采集100例健康个体的尿液样本，其中男、女各50例，老年与非老年各50例。根据世界卫生组织的定义来界定老年与非老年人，本案例中老年人是指年满65岁者。健康人的入选标准为：无糖尿病或其它代谢性疾病、无基础疾病、C-反应蛋白正常、尿液分析所有参数正常、近一个月未发生过尿路感染、近一个月内未使用过抗生素和益生菌制剂。
提取尿液样本的细菌DNA，采用引物341F和806R进行聚合酶链式反应，设计合成含有测序接头的双Index融合引物，以基因组DNA为模板，进行融合引物PCR，磁珠筛选目的Amplicon片段，最后，用合格的文库进行cluster制备和测序，用下机得到的数据进行相应的生物信息分析，下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data方可用于后期分析，通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags，在给定的相似度下将Tags聚成OTU，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释，利用UPARSE在97％相似度下进行聚类，得到OTU的代表序列，得到OTU代表序列后，通过RDPclassifer(v2.2)软件将OTU代表序列与数据库Greengene 2013.5比对，进行物种注释，置信度阈值设置为0.6，采用Decontam(v 1.2.1)过滤污染序列，过滤值设置为小于0.1，从而防止污染序列对样本信息的影响，通过上述生物学信息分析，得到健康个体尿液微生态数据库。如图1所示，其中，均值表示每一种细菌的相对丰度，标准差为该细菌相对丰度的标准差，“均数+1.96*标准差”为该细菌相对丰度的上限，“均数-1.96*标准差”为该细菌相对丰度的下限。
2.糖尿病患者尿液微生态与健康人体尿液微生态数据库的比对
采用与健康人体相同的尿液样本采集方法和生物信息学分析方法，对个体糖尿病患者的尿液微生态结构进行统计分析，以判断其是否发生了微生态紊乱，如果患者尿液中某一细菌的相对丰度超过了健康个体尿液微生态数据库中该细菌的相对丰度的上限或下限，则判断为微生态紊乱，并进一步将患者发生紊乱的细菌定义为功能菌。结合图1进行分析可知，患者尿液微生态中葡萄球菌的相对丰度超过了6.85％时，则认为其尿液中葡萄球菌超过正常范围。
3.营养素摄入量与功能菌的回归模型的构建及对膳食摄入的指导
叮嘱患者在采集微生态标本前3天使用智能秤精准监测每日膳食摄入量，并用相关软件将每日摄入的食物转换为营养素摄入量，计算患者平均每日摄入的营养素，最后，将营养素摄入量作为自变量，将步骤2中已确定的功能菌作为因变量，利用SPSS24.0逐步回归分析，根据分析结果辨别影响功能菌相对丰度的营养素，分析结果如图2所示，其中，t值是T检验的结果，T检验是为检验回归关系的显著性，p1值表示T检验是否具有显著性。本案例中维生素B2和尼克酸所对应的p1值<0.05，则说明这个回归关系是有显著性的。F值是F检验的结果，表示F检验能用作检验整个回归关系的显著性。本案例中F值所对应的p2值是0.006(<0.05)，所以整个模型是有显著性的，即整个模型是可以用于解释营养素摄入量对于葡萄球菌相对丰度所产生的影响(F＝3.761，p2＝0.006)。同时，患者维生素B2和尼克酸的摄入量与葡萄球菌的相对丰度成负相关，即当维生素B2和尼克酸摄入量的增加可以减少葡萄球菌的产生。因此，患者应增加这两种营养素的摄入量。
4.针对性营养制剂的形成
由于个体的饮食习惯是相对比较固定的，因此营养失衡的改善很难从常规饮食的改变入手，根据步骤3可知导致患者微生态结构紊乱的营养素种类，接下来，利用SPSS软件和Pearson计算造成个体微生态紊乱的功能菌的相对丰度与导致这一功能菌相对丰度超过或低于健康个体的营养素相关系数r，延续上例继续进行分析，计算维生素B2(X)与葡萄球菌相对丰度(Y)的相关系数(r)，以确定其相关程度。如果r值所对应的p值<0.05，则进一步证实两者是维生素B2摄入不足是导致患者尿液葡萄球菌升高的原因。接下来，在SPSS中逐步增加维生素B2(X)的摄入量，每一次增加5％X递增，直至r值所对应的p值≥0.05，表明患者达到这种摄入量时葡萄球菌将不会因维生素B2摄入量而发生改变。将此时营养素的量减去步骤3中患者每日的平均摄入量，得到营养制剂中所需添加维生素B2的剂量。最后，根据此方法计算患者所有营养素补充剂量，并将这些营养素配制成胶囊制剂，从而形成个体化的微生态紊乱调节制剂。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (4)

1.调节糖尿病患者尿液微生态结构的营养制剂的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1)健康个体尿液微生态数据库的建立；
2)糖尿病患者尿液微生态的采集、微生态结构的数据统计及与健康个体尿液微生态数据库的比对分析，确定导致患者尿液微生态发生紊乱的功能菌；
3)营养素摄入量与功能菌的回归模型的构建及对膳食摄入的指导分析；
4)针对性营养制剂的形成；
步骤3)的具体操作方法为：叮嘱患者在采集微生态标本前3天使用智能秤精准监测每日膳食摄入量，并用相关软件将每日摄入的食物转换为营养素摄入量，计算患者平均每日摄入的营养素，最后，将营养素摄入量作为自变量，将步骤2)中已确定的功能菌作为因变量，利用SPSS24.0逐步回归分析，根据分析结果辨别影响功能菌相对丰度的营养素，进一步判断患者需要调节摄入量的营养素种类；
步骤4)的具体操作方法为：通过步骤3)得知导致患者微生态结构紊乱的营养素种类后，利用SPSS软件和Pearson计算功能菌的相对丰度与导致功能菌相对丰度超过或低于数据库中该功能菌相对丰度的上限或下限的营养素之间的相关系数r，以确定其相关程度，如果r值所对应的p值<0.05，p值是指当原假设为真时所得到的样本观察结果或更极端结果出现的概率，则进一步证实是该营养素的摄入不足导致患者尿液微生态中功能菌相对丰度的升高，接下来，在SPSS中逐步增加该营养素的摄入量，每一次以5％的增幅递增，直至r值所对应的p值≥0.05，表明患者达到这种摄入量时功能菌将不会因该种营养素的摄入量不足而发生改变，将此时营养素的量减去步骤3)中患者每日的平均摄入量，得到营养制剂中该营养素所需添加的剂量，其它营养素的补充剂量均照此方法计算，并将这些营养素配制成胶囊制剂，从而形成个体化的微生态紊乱调节制剂。
2.如权利要求1所述的调节糖尿病患者尿液微生态结构的营养制剂的制备方法，其特征在于，步骤1)中健康个体尿液微生态数据库的建立方法为：
使用导尿术采集100例健康个体未受到会阴部及尿道外口细菌污染的尿液样本，其中男、女各50例，老年与非老年各50例；
提取尿液样本的细菌DNA，采用引物341F和806R进行聚合酶链式反应，设计合成含有测序接头的双Index融合引物，以基因组DNA为模板，进行融合引物PCR，磁珠筛选目的Amplicon片段，最后，用合格的文库进行cluster制备和测序，用下机得到的数据进行相应的生物信息分析，下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data方可用于后期分析，通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags，在给定的相似度下将Tags聚成OTU，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释，利用UPARSE在97％相似度下进行聚类，得到OTU的代表序列，得到OTU代表序列后，通过RDP classifer v2.2软件将OTU代表序列与数据库Greengene 2013.5比对，进行物种注释，置信度阈值设置为0.6，采用Decontam v1.2.1过滤污染序列，过滤值设置为小于0.1，从而防止污染序列对样本信息的影响，通过上述生物学信息分析，得到健康个体尿液微生态数据库。
3.如权利要求2所述的调节糖尿病患者尿液微生态结构的营养制剂的制备方法，其特征在于，步骤2)的具体操作方法为：采用与采集健康人体尿液样本相同的方法采集糖尿病患者的尿液标本并做相同的生物信息学分析，对个体糖尿病患者的尿液微生态结构进行相关数据的统计分析，以判断其是否发生了微生态紊乱，如果患者尿液中某一细菌的相对丰度超过了健康个体尿液微生态数据库中该细菌的相对丰度的上限或下限，则判断为微生态紊乱，并进一步将患者发生紊乱的细菌定义为功能菌。
4.如权利要求2所述的调节糖尿病患者尿液微生态结构的营养制剂的制备方法，其特征在于，健康个体的入选标准为：无糖尿病或其它代谢性疾病、无基础疾病、C-反应蛋白正常、尿液分析所有参数正常、近一个月未发生过尿路感染、近一个月内未使用过抗生素和益生菌制剂。
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