CN110412024A - 一种基于核酸适配体和纳米金的Hg2+检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于核酸适配体和纳米金的Hg²⁺检测方法，涉及Hg²⁺检测技术领域。所述Hg²⁺检测方法主要包括：核酸适配体的设计、标准液的制备、实验组设立、检测、建立标准曲线、根据标准曲线对实验组进行定量分析等步骤。本发明克服了现有技术的不足，采用能形成茎环结构的核酸适配体作为核酸探针，加强对纳米金的保护能力，且本方法的检测线性范围宽、抗干扰能力强、精密度高，检测Hg²⁺离子浓度跨度达到3个数量级，适宜推广使用。

Description

一种基于核酸适配体和纳米金的Hg2+检测方法

技术领域

本发明涉及Hg²⁺检测技术领域，具体涉及一种基于核酸适配体和纳米金的Hg²⁺检测方法。

背景技术

汞作为一种全球性的环境污染物，对人体也有着极大的毒害作用，其蓄积性，致畸、致癌作用也是非常为人们所关注，现已被我国《重金属污染综合防治规划(2010—2015)》列入5种第一类重点防控重金属中。目前对Hg²⁺的检测方法包括原子发射光谱法、质谱法、荧光法和电化学法等，虽然这些检测方法应用已经比较成熟，但仍存在一些弊端：用费较高、需要用到一些大型仪器、需要专业人员进行操作、不能达到快速测定的效果等。所已建立一种快速、简单、灵敏度高的检测方法仍是研究的热点。

适配体(Aptamer)是通过SELEXS技术，从人工体外合成的随机的寡核苷酸序列库中经过反复筛选得到的，与靶分子有极高的亲和性和特异性的寡核苷酸序列。纳米金是指金的微小颗粒，通常在水溶液中以胶体金的形态存在。直径在10～50nm之间的纳米金粒子颜色为红色，而粒径大于50nm或聚集状态的纳米金粒子呈现蓝色。近年来，纳米金与适配体在生物分析、药物应用、重金属的检测、微生物检测上均得到了广泛的应用。

目前基于纳米金与适配体检测Hg²⁺的方法研究已经有报道，但大多采用的是直链型适配体，对纳米金的保护性较弱，并且检测的抗干扰性和精密性较低。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供一种基于核酸适配体和纳米金的Hg²⁺检测方法，采用能形成茎环结构的核酸适配体作为核酸探针，加强对纳米金的保护能力，且本方法的检测线性范围宽、抗干扰能力强、精密度高，检测Hg²⁺离子浓度跨度达到3个数量级，适宜推广使用。

为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

一种基于核酸适配体和纳米金的Hg²⁺检测方法，所述Hg²⁺检测方法包括以下步骤：

(1)核酸适配体的设计：设计由28个碱基组成的单链DNA为核酸适配体，其中单链DNA含5′末端和3′末端相靠近的茎环发夹结构；

(2)标准液的制备：将纳米金溶液和10μmol/L的核酸适配体混匀，于室温下进行孵育，得标准液备用；

(3)实验组设立：向上述标准液中加入待检测含Hg²⁺样本溶液，混匀后加入1mol/L的氯化钠溶液，再补充缓冲液至核酸适配体浓度为0.32μmol/L，混匀后形成实验组备用；

(4)检测：将上述实验组在室温条件下孵育一段时间，并观察体系的颜色变化，进行定性检测，测定520nm、620nm处的吸光度；

(5)建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围；

(6)根据标准曲线对实验组进行定量分析。

优选的，所述步骤(1)中单链DNA从5′端至3′的序列为GAACACCCCTTCTTCTTCCTTGTTGTTC。

优选的，所述纳米金选用的粒径为15nm，纳米金溶液浓度为0.1％。

优选的，所述步骤(2)中纳米金溶液与核酸适配体混合的体积比为25∶2，且室温孵育的时间为5min。

优选的，所述步骤(3)中氯化钠的加入量为纳米金溶液加入量的3/10，待检测含Hg²⁺样本溶液的加入量为纳米金溶液体积的1/6，添加缓冲液后氯化钠浓度为0.12mol/L，且所选用缓冲体系为pH7.4的磷酸缓冲体系。

优选的，所述步骤(4)中室温孵育的时间为15min，且体系颜色变化范围为从红色至蓝色的变化，定性检测的方式为将孵育后溶液于1cm比色皿中常温检测。

优选的，所述步骤(5)中标准曲线中横坐标为Hg²⁺离子浓度，纵坐标为A620与A520的比值。

本发明提供一种基于核酸适配体和纳米金的Hg²⁺检测方法及其制备方法，与现有技术相比优点在于：

本发明利用核酸适配体的特异性识别作用，构建新型的核酸探针，设计了一个能形成茎环结构的核酸适配体，由28个碱基组成，该适配体可以使纳米金在高盐溶液中处于一个稳定的分散状态，溶液呈现红色，在520nm处存在特征吸收峰；当溶液中存在Hg²⁺时，适配体与Hg²⁺特异性的结合，纳米金团聚，溶液颜色由红变蓝，特征吸收峰由520nm红移至620nm处。本方法快速简单，具有较高的灵敏度和选择性，线性范围宽，适用于液体试样中Hg²⁺的快速检测；且本方法的检测线性范围宽、抗干扰能力强、精密度高，检测Hg²⁺离子浓度跨度达到3个数量级，对实际样品的检测可行性强，适宜推广使用。

附图说明

图1：核酸适配体的二级结构示意图；

图2：本发明检测原理对照曲线图；

图3：不同Hg²⁺离子浓度与A620和A520比值的标准曲线图；

图4：不同金属离子对检测结果干扰强度柱状图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

检测对比本发明原理，设置a、b、c、d、e五组溶液，其中a组为纳米金+Hg²⁺混合，其中Hg²⁺浓度为1000nmol/L；b组为纳米金+适配体+氯化钠混合，其中适配体浓度为0.32μmol/L，氯化钠浓度为0.12mol/L；c组为纳米金溶液；d组为纳米金+适配体+Hg²⁺+氯化钠混合，其中Hg²⁺浓度为1000nmol/L，适配体浓度为0.32μmol/L，氯化钠浓度为0.12mol/L；e组为纳米金+氯化钠混合，其中氯化钠浓度为0.12mol/L，检测各组的体系颜色和在520nm和620nm处的吸光度，结果如图2所示。

实施例2：

一种基于核酸适配体和纳米金的Hg²⁺检测方法，所述Hg²⁺检测方法包括以下步骤：

(1)核酸适配体的设计：设计由28个碱基组成的单链DNA为核酸适配体，其中单链DNA含5′末端和3′末端相靠近的茎环发夹结构；

(2)标准液的制备：将纳米金溶液和10μmol/L的核酸适配体混匀，于室温下进行孵育，得标准液备用；

(3)实验组设立：向上述标准液中加入待检测含Hg²⁺样本溶液，混匀后加入1mol/L的氯化钠溶液，再补充缓冲液至核酸适配体浓度为0.32μmol/L，混匀后形成实验组备用；

(4)检测：将上述实验组在室温条件下孵育一段时间，并观察体系的颜色变化，进行定性检测，测定520nm、620nm处的吸光度；

(5)建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围；

(6)根据标准曲线对实验组进行定量分析。

其中，所述步骤(1)中单链DNA从5′端至3′的序列为GAACACCCCTTCTTCTTCCTTGTTGTTC；所述纳米金选用的粒径为15nm，纳米金溶液浓度为0.1％；所述步骤(2)中纳米金溶液的添加量为600μL，核酸适配体的添加量为48μL，且室温孵育的时间为5min；所述步骤(3)中氯化钠的加入量180μL，待检测含Hg²⁺样本溶液的加入量100μL，补充缓冲液至溶液体积为1500μL，添加缓冲液后氯化钠浓度为0.12mol/L，且所选用缓冲体系为pH7.4的磷酸缓冲体系；所述步骤(4)中室温孵育的时间为15min，且体系颜色变化范围为从红色至蓝色的变化，定性检测的方式为将孵育后溶液于1cm比色皿中常温检测；所述步骤(5)中标准曲线中横坐标为Hg²⁺离子浓度，纵坐标为A620与A520的比值。

在此条件下，Hg²⁺离子浓度在9×10^-8～3.5×10^-6mol/L范围内呈线性关系，其线性回归方程为y＝0.0003x+0.0377(n＝9,R2＝0.9964)，检出限为8×10^-8mol/L，RSD＝2.46％(n＝10)。(如图2所示)

实施例3：

测定本发明方法Hg²⁺的回收率：

(1)选取Hg²⁺含量为1430nmol/L的水样为试验水样，将试验水样分三组，各取1L，分别添加90nmol、500nmol和2000nmol的Hg²⁺，混合均匀后备用；

(2)将上述各组水样采用实施例1的检测方法分别检测其Hg²⁺的测定值，计算出回收率，结果如下表所示：

由上表可知，本发明方法对Hg²⁺的检测灵敏度和准确度高，适宜推广使用。

实施例4：

采用实施例1所述检测方法，分别替换待检测含Hg²⁺溶液为含Mn²⁺溶液、含Ca²⁺溶液、含Mg²⁺溶液、含Cu²⁺溶液、含Ba²⁺溶液、含Co²⁺溶液、含Fe³⁺溶液、含Zn²⁺溶液、含Cr²⁺溶液和含Sn²⁺溶液，测定不同金属离子对检测结果的影响，结果如图4所示。

由图4可知本发明检测方法使用时，其余金属离子对检测结果的干扰度较低，检测准确性高。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种基于核酸适配体和纳米金的Hg²⁺检测方法，其特征在于，所述Hg²⁺检测方法包括以下步骤：

(1)核酸适配体的设计：设计由28个碱基组成的单链DNA为核酸适配体，其中单链DNA含5′末端和3′末端相靠近的茎环发夹结构；

(2)标准液的制备：将纳米金溶液和10μmol/L的核酸适配体混匀，于室温下进行孵育，得标准液备用；

(3)实验组设立：向上述标准液中加入待检测含Hg²⁺样本溶液，混匀后加入1mol/L的氯化钠溶液，再补充缓冲液至核酸适配体浓度为0.32μmol/L，混匀后形成实验组备用；

(4)检测：将上述实验组在室温条件下孵育一段时间，并观察体系的颜色变化，进行定性检测，测定520nm、620nm处的吸光度；

(5)建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围；

(6)根据标准曲线对实验组进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体和纳米金的Hg²⁺检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中单链DNA从5′端至3′的序列为GAACACCCCTTCTTCTTCCTTGTTGTTC。

3.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体和纳米金的Hg²⁺检测方法，其特征在于：所述纳米金选用的粒径为15nm，纳米金溶液浓度为0.1％。

4.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体和纳米金的Hg²⁺检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中纳米金溶液与核酸适配体混合的体积比为25∶2，且室温孵育的时间为5min。

5.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体和纳米金的Hg²⁺检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中氯化钠的加入量为纳米金溶液加入量的3/10，待检测含Hg²⁺样本溶液的加入量为纳米金溶液体积的1/6，添加缓冲液后氯化钠浓度为0.12mol/L，且所选用缓冲体系为pH7.4的磷酸缓冲体系。

6.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体和纳米金的Hg²⁺检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中室温孵育的时间为15min，且体系颜色变化范围为从红色至蓝色的变化，定性检测的方式为将孵育后溶液于1cm比色皿中常温检测。

7.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体和纳米金的Hg²⁺检测方法，其特征在于：所述步骤(5)中标准曲线中横坐标为Hg²⁺离子浓度，纵坐标为A620与A520的比值。