CN110408584B - 左旋手性纳米凝胶细胞支架材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种左旋手性纳米凝胶细胞支架材料及其制备方法，制备方法包括如下步骤：(1)将左旋氨基酸衍生物凝胶因子分散于去离子水中，获得质量体积浓度为0.5mg/mL～1.0mg/mL的左旋氨基酸衍生物凝胶因子分散溶液；(2)将上述分散液加热至澄清溶液；(3)将上述澄清溶液加入细胞培养板的孔板中；(4)将制得的细胞培养板在室温下静置20～30分钟，形成左旋水凝胶；(5)将细胞培养板在40‑50℃下进行干燥，即在孔板上覆盖左旋手性纳米凝胶细胞支架材料。本发明提供了一种用于促进细胞黏附和成骨分化的左旋手性纳米凝胶细胞支架材料的制备方法，解决了现有细胞培养过程中细胞在基质材料上黏附差、定向分化困难的问题。

Description

左旋手性纳米凝胶细胞支架材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及水凝胶细胞培养支架材料领域，具体地，涉及一种左旋手性纳米凝胶细胞支架材料及其制备方法，尤其涉及是一种促进细胞粘附和定向骨分化的左旋手性纳米凝胶细胞培养支架材料及其制备方法。
背景技术
人体组织损伤、缺损会导致功能障碍，传统的修复方法是自体组织移植术，虽然可以取得满意疗效，但它是以牺牲自体健康组织为代价的办法，会导致很多并发症及附加体器官来源极为有限，因免疫排斥反应需长期使用免疫抑制剂，由此而带来的并发症有时是致命的。据不完全统计，每年都有许多人被烧伤皮肤、角膜损坏或骨骼折断等，给受害人带来痛苦的同时，也严重影响他们的日常正常生活。因此组织再生医学已成为当今国内外急需解决的重大问题。医学上常用的人造组织和器官等由于不具有生物活性、有的甚至带有病原性，使其应用受限。目前体外细胞支架材料往往只考虑纤维支架结构，忽视了人体内胶原蛋白支架上手性螺旋结构对细胞黏附的影响。细胞培养支架材料手性信号的缺失限制了细胞某些行为在体外培养时的表达。
公开号为CN 109316632 A的发明专利申请公开了一种左旋水凝胶材料的制备方法，主要步骤为：(1)将左旋凝胶因子溶于二甲基亚砜溶液,获得质量体积浓度为12mg/ul～33mg/ul的左旋凝胶因子溶液，置于24孔板底部；(2)将制得的左旋凝胶因子溶液混入骨髓间充质干细胞的培养基悬液，在24孔板中混匀，在30～40℃条件下静置30～60min，形成水凝胶；(3)将制得的水凝胶放入无成骨诱导因子的间充质干细胞培养基培养，间隔时间更换间充质干细胞培养基。该发明提供了一种可以三维培养间充质干细胞的水凝胶材料，并能通过改变材料分子手性的基本特性，达到调控干细胞命运的目的。但在该左旋水凝胶材料的制备方法中，由于采用溶剂诱导制备水凝胶，导致细胞悬液与二甲基亚砜两种溶剂混合扩散过程中所得水凝胶均匀性和稳定性不足，每批次制备的水凝胶一致性较差，在实际应用过程中实用性不高。此外该发明凝胶制备中，引入二甲基亚砜，对细胞有明显毒副作用，不利于作为细胞培养材料使用。另外，在该发明中，由于对凝胶因子溶剂调控组装性能要求较高，所用凝胶因子仅局限于左旋苯丙氨酸衍生物，不利于材料多功能化修饰。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种左旋手性纳米凝胶细胞支架材料及其制备方法，即一种左旋手性超纳米凝胶细胞培养支架材料及其制备方法,以解决细胞在现有基质材料上黏附差、定向分化困难的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供一种左旋氨基酸衍生物凝胶因子，所述左旋氨基酸衍生物凝胶因子以环状疏水基团为中心核，以左旋氨基酸酯类衍生物为侧链，以酰胺键为连接键，所述中心核通过所述连接键与所述侧链连接；
所述环状疏水基团为环烷烃、苯环、五元杂环、六元杂环中的一种。
优选地，所述左旋氨基酸酯类衍生物包括左旋蛋氨酸酯类衍生物、左旋谷氨酸酯类衍生物、左旋赖氨酸酯类衍生物、左旋组氨酸酯类衍生物中的一种。
优选地，所述环状疏水基团为环己烷或苯环；所述中心核的1,4位与所述侧链连接。
更优选地，所述左旋氨基酸衍生物凝胶因子为：
Figure BDA0002116080420000021
第二方面，本发明提供一种所述的左旋氨基酸衍生物凝胶因子的制备方法，
当所述环状疏水基团为苯环或环己烷时，所述左旋氨基酸衍生物凝胶因子的制备方法包括如下步骤：
A1、将左旋氨基酸酯的盐酸盐溶于溶剂中，得到左旋氨基酸酯的盐酸盐溶液；将1,4-苯二酰氯或1,4-环己二酰氯溶于溶剂中，得到1,4-苯二酰氯溶液或1,4-环己二酰氯溶液；
A2、将所述1,4-苯二酰氯溶液或所述1,4-环己二酰氯溶液在低温下加至所述左旋氨基酸酯的盐酸盐溶液中，室温下搅拌，反应结束后除去溶剂，得到1,4-苯二-L-氨基酸酯化合物或1,4-环己二-L-氨基酸酯化合物；
A3、将所述1,4-苯二-L-氨基酸酯化合物或所述1,4-环己二-L-氨基酸酯化合物依次经碱处理、酸处理后，得到1,4-苯二-L-氨基酸或1,4-环己二-L-氨基酸；
A4、将所述1,4-苯二-L-氨基酸或所述1,4-环己二-L-氨基酸与一缩乙二醇在酸性条件下加热反应，反应结束后将反应液倒入冰水混合物中，收集沉淀物；将沉淀物经去离子水冲洗沉淀后，干燥，即得；
当所述环状疏水基团为五元杂环、六元杂环或其他环烷烃时，制备步骤与所述A1至A4基本相同，不同之处在于：所述1,4-苯二酰氯或1,4-环己二酰氯原料相应为五元杂环二酰氯(如2,5-呋喃二甲酰氯)、六元杂环二酰氯(如2,6-吡啶二甲酰氯)、其他环烷烃二酰氯，其中，所述其他环烷烃为除环己烷外的其他环烷烃。
优选地，步骤A1中，所述左旋氨基酸酯的盐酸盐包括L-蛋氨酸甲酯盐酸盐、L-谷氨酸甲酯盐酸盐、L-赖氨酸甲酯盐酸盐、L-组氨酸甲酯盐酸盐中的一种。
优选地，步骤A2中，所述低温通过冰浴实现。
优选地，步骤A3中，所述碱处理的步骤为：将氢氧化钠水溶液加入1,4-苯二-L-氨基酸酯化合物或所述1,4-环己二-L-氨基酸酯化合物的甲醇溶液中，室温下搅拌反应至溶液澄清。
优选地，步骤A3中，所述酸处理的步骤为：用盐酸溶液调节体系pH值小于3，出现白色沉淀，抽滤后得1,4-苯二-L-氨基酸或1,4-环己二-L-氨基酸。
优选地，步骤A4中，所述加热反应的温度为145℃。
第三方面，本发明提供一种左旋手性纳米凝胶纤维的制备方法，包括如下步骤：
S1、将权利要求1所述的左旋氨基酸衍生物凝胶因子分散于去离子水中，加热后得到左旋氨基酸衍生物凝胶因子的澄清溶液；
S2、将所述左旋氨基酸衍生物凝胶因子的澄清溶液加至细胞培养板中，在室温下静置后形成左旋水凝胶，将所述左旋水凝胶干燥处理后，得到所述左旋手性纳米凝胶纤维材料。
优选地，步骤S1中，所述加热的温度为90℃～100℃，加热的时间为2～3分钟。加热温度若低于90℃，凝胶因子不能在水中完全溶解；加热温度若高于100℃，需要特殊耐高压容器，不利于材料方便制备。
优选地，步骤S1中，在所述左旋氨基酸衍生物凝胶因子的澄清溶液中，左旋氨基酸衍生物凝胶因子的质量体积浓度为0.5mg/mL～1.0mg/mL。凝胶因子浓度若低于0.5mg/mL，不能形成稳定凝胶；凝胶因子浓度若高于1.0mg/mL,不利于凝胶干燥后形成均匀透明的薄膜。
优选地，步骤S2中，所述滴加的步骤为：在细胞培养板的每孔中滴加可覆盖孔板底部的左旋氨基酸衍生物凝胶因子的澄清溶液。
优选地，所述细胞培养板为24孔板、96孔板、12孔板或6孔板。
更优选地，步骤S2中，在24孔板中，每孔中滴加200μL凝胶因子溶液。
优选地，所述静置的时间为20～30分钟。
优选地，所述干燥的温度为40-50℃，干燥的时间为1-3天。
第四方面，本发明提供一种根据所述的制备方法得到的左旋手性纳米凝胶纤维。
第五方面，本发明提供一种所述左旋手性纳米凝胶纤维作为细胞培养支架材料的应用，所述应用包括：将细胞悬液加至所述左旋手性纳米凝胶纤维的表面进行培养。
本发明提供的具有左手螺旋结构的水凝胶支架材料制备，具体步骤如下：
步骤(1)：将左旋氨基酸衍生物凝胶因子分散于去离子水中，获得质量体积浓度为0.5mg/mL～1.0mg/mL的左旋氨基酸衍生物凝胶因子分散溶液；
步骤(2)：将步骤(1)中的左旋凝胶因子分散溶液在90℃～100℃加热2～3分钟至其溶解，获得左旋氨基酸衍生物凝胶因子的澄清溶液；将左旋氨基酸衍生物凝胶因子的澄清溶液加入细胞培养板，覆盖孔板底部；
步骤(3)：将步骤(2)中加有左旋氨基酸衍生物凝胶因子的澄清溶液的细胞培养板在室温下静置20～30分钟，形成左旋水凝胶；
步骤(4)：将步骤(3)中制得的细胞培养板进行干燥，干燥温度为40-50℃，干燥时间为1-3天，得到覆盖在细胞培养孔板底部的凝胶纤维支架材料。
目前常用细胞培养纤维支架材料均未考虑材料手性因素，为非手性支架材料。而本发明中手性纳米凝胶纤维具有左手螺旋结构，不仅为细胞生长提供了适合的微纳米空间，并且纤维支架上的仿生手性螺旋结构可以进一步模仿体内胶原蛋白，在手性结构尺度上影响细胞与支架的相互作用，进而广泛促进细胞黏附、调控细胞分化。
本发明中利用左旋手性超纳米凝胶支架的物理结构促进细胞黏附行为无需额外添加促细胞黏附多肽或蛋白，操作方便，具有实际应用价值。材料制备方法无需复杂的合成步骤，易于大批量工业生产，所得产物纯度高，分散性好，适宜于大规模细胞培养的商业化应用。
本发明中所述左旋氨基酸衍生物凝胶因子为以刚苯环、环己烷等疏水基团为为中心核，酰胺键为连接链，1,4位连接各类左旋氨基酸酯类衍生物，左旋氨基酸酯类衍生物如左旋蛋氨酸酯类、左旋谷氨酸酯类、左旋赖氨酸酯类、左旋组氨酸酯类衍生物等。由于中心核的疏水-疏水或π-π堆积相互作用，以及酰胺键间的氢键作用保证了该类凝胶因子自组装成手性水凝胶。针对不同细胞种类，可以选择不同左旋氨基酸连接在中心核两侧作为功能基团，支持细胞生长。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明中左旋手性纳米凝胶细胞支架材料用于细胞培养，不仅为细胞黏附、分化提供位点，更将纳米纤维的手性结构引入细胞培养环境中，进一步模拟人体内胶原蛋白的手性螺旋结构，为细胞体外培养提供高度仿生的微环境。
2、本发明左旋手性纳米凝胶细胞支架材料可通过纤维手性结构调控细胞黏附行为：具有左手螺旋结构的凝胶纤维可促进细胞黏附和定向骨分化。揭示了手性结构是细胞培养支架材料制备中不可忽略的重要因素。解决了现有基质材料难以精确调控细胞黏附及分化的技术难点。
3、本发明手性纳米凝胶支架材料的制备方法通过具有手性氨基酸单元的小分子衍生物自组装而成，纤维结构手性易于调控，且无需复杂的合成步骤，易于大批量工业生产，适宜于商业化细胞三维培养使用。
4、本发明中凝胶因子通过加热溶解于去离子水中，冷却过程中利用分子间氢键、π-π堆积、疏水-疏水相互作用自组装形成热力学稳定的纳米纤维水凝胶。凝胶因子中氨基酸基团不局限于某一单一氨基酸，左旋蛋氨酸、左旋谷氨酸、左旋赖氨酸等衍生物均可制备出相应左旋水凝胶材料。特别地，当氨基酸基团为左旋蛋氨酸时，所形成的凝胶稳定性最好，有利于细胞培养。
5、本发明所涉及手性水凝胶支架材料可适用于多种细胞的培养。本发明左旋水凝胶制备中，无需引入对细胞有毒副作用的二甲基亚砜，更加利于细胞培养。水凝胶制备方法更加简化，直接将凝胶因子粉末高温溶解于去离子水中，冷却后即可获得材质均匀的手性水凝胶，材料制备重复性高。可批次制备生产。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明中左旋蛋氨酸酯类衍生物凝胶因子形成的水凝胶(图1a)和干燥后凝胶中具有左手螺旋结构的纳米纤维沉积在基底上的扫描电镜图(图1b)；
图2为NIH 3T3细胞在手性纳米凝胶薄膜上培养5天的细胞黏附对比图；
图3为PaTu 8988t细胞在手性纳米凝胶薄膜上培养5天的细胞黏附对比图；
图4为RT-qPCR分析DPSC细胞培养7天后BMP2基因的相对表达；
图5为左旋蛋氨酸衍生物凝胶因子和右旋蛋氨酸衍生物溶于甲醇干燥后形成的没有超分子手性螺旋结构的无规聚集体的电镜照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1、左旋纳米凝胶纤维支架材料的制备
本实施例涉及一种用于细胞培养的手性纳米凝胶支架材料，所述手性纳米凝胶支架材料由具有手性氨基酸单元的小分子凝胶因子自组装而成，该凝胶因子以环己烷为中心核，酰胺键为连接键，环己烷1、4位连接左旋蛋氨酸一缩乙二醇基团。
1.1左旋蛋氨酸酯类衍生物凝胶因子的制备
将5.6g L-蛋氨酸甲酯盐酸盐加入20mL二氯甲烷中搅拌后，滴加8.0mL三乙胺。冰浴下，将2.4g 1,4-环己二酰氯溶于10mL二氯甲烷中并滴加入上述溶液中，撤去冰浴，室温下搅拌反应24小时，旋转蒸发除去二氯甲烷溶剂，得1,4-环己二-L-蛋氨酸甲酯。将10mL氢氧化钠水溶液(摩尔浓度为2M)加入1,4-环己二-L-蛋氨酸甲酯的甲醇溶液(1,4-环己二-L-蛋氨酸甲酯为3.0g，甲醇体积为20mL)，室温下搅拌反应12小时至溶液澄清。反应结束后，用盐酸溶液(摩尔浓度为3M)调节体系pH值小于3，出现白色沉淀，抽滤后得1,4-环己二-L-蛋氨酸。将2.5g 1,4-环己二-L-蛋氨酸加入50mL一缩乙二醇中，将0.5mL浓盐酸滴加入上述反应液中，加热到145℃搅拌回流反应4小时。反应结束后将反应液倒入冰水混合物中，出现大量凝胶中白色沉淀。抽滤收集沉淀，用去离子水冲洗沉淀后，干燥得左旋蛋氨酸衍生物凝胶因子，结构式如下所示。
Figure BDA0002116080420000071
1.2左旋手性纳米凝胶纤维的制备
将2.5mg上述左旋蛋氨酸衍生物凝胶因子粉末分散于5.0mL去离子水中，在90℃～100℃加热2～3分钟将其溶解制成5.0mL左旋蛋氨酸酯类衍生物凝胶因子溶液(0.5mg/mL)，在24孔细胞培养板中每孔加入200uL，在室温下静置20～30分钟，形成左旋水凝胶。40℃下干燥2天，紫外光照射30min灭菌。
图1为本实施例中左旋蛋氨酸酯类衍生物凝胶因子形成的水凝胶(图1a)和干燥后凝胶中具有左手螺旋结构的纳米纤维沉积在基底上的扫描电镜图(图1b)。
实施例2、左旋纳米凝胶支架材料促进细胞黏附
2.1左旋手性纳米凝胶纤维支架促进小鼠成纤维细胞(NIH 3T3)细胞的黏附
本实施例采用左旋纳米凝胶支架为前述实施例1制备具有左旋手性单元的蛋氨酸衍生物凝胶因子在水中通过氢键等非共价键相互作用自组装而得。右旋纳米凝胶支架由具有右旋手性单元的蛋氨酸衍生物凝胶因子在水中通过氢键等非共价键相互作用自组装而得，作为实验对照材料。
将NIH 3T3细胞用胰酶消化2-3min，离心，去除消化液，1×PBS冲洗，再加完全培养液吹打细胞，形成均匀细胞悬液，将NIH 3T3细胞密度调至5.0×104/mL，24孔板中每孔加200μL NIH 3T3细胞悬液，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养5天后观察细胞的粘附情况。NIH 3T3细胞黏附情况见图2，在左手螺旋(L型)支架材料表面的平均细胞黏附铺展面积比在右手螺旋(D型)支架材料上提高了2.5倍。
2.2左旋手性纳米凝胶纤维支架促进人胰腺癌细胞(PaTu 8988t)的黏附
将PaTu 8988t细胞用胰酶消化2-3min，离心，去除消化液，1×PBS冲洗，再加完全培养液吹打细胞，形成均匀细胞悬液，将PaTu 8988t细胞密度调至5.0×103/mL，24孔板中每孔加200uL细胞悬液，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育5天后观察细胞的粘附铺展情况。PaTu 8988t细胞黏附铺展情况见图3，PaTu 8988t单个细胞粘附铺展面积在左手螺旋(L型)支架材料表面比右手螺旋(D型)支架材料上提高了约1.3倍。
实施例3、左旋纳米凝胶支架材料促进细胞定向分化
将牙髓干细胞(DPSC)用胰酶消化2-3min，离心，去除消化液，1×PBS冲洗，再加完全培养液吹打细胞，形成均匀细胞悬液，将DPSC细胞密度调至1.0×105/mL，24孔板中每孔加200uL细胞悬液，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育7天后观察细胞分化情况。DPSC细胞在左旋纤维上明显朝成骨细胞方向分化，其中成骨细胞特征基因(BMP2)相对表达(见图4)是在右旋纤维上细胞的1.5～2.0倍。
实施例4、左旋纳米凝胶纤维支架材料的制备
本实施例涉及一种用于细胞培养的手性纳米凝胶支架材料。所述手性纳米凝胶支架材料由具有手性氨基酸单元的小分子凝胶因子自组装而成，该凝胶因子以环己烷为中心核，酰胺键为连接键，环己烷1、4位连接左旋组氨酸一缩乙二醇基团。
4.1左旋组氨酸酯类衍生物凝胶因子的制备
左旋组氨酸酯类衍生物凝胶因子的合成步骤与实施例1中左旋蛋氨酸酯类衍生物凝胶因子的合成步骤基本一致，不同之处仅在于：合成原料中L-蛋氨酸甲酯盐酸盐改为L-组氨酸甲酯盐酸盐。
4.2左旋手性纳米凝胶纤维的制备
左旋手性纳米凝胶纤维的制备步骤为：将2.5mg左旋组氨酸酯类衍生物凝胶因子粉末分散于2.5mL去离子水中，在90℃～100℃加热2～3分钟将其溶解制成2.5mL左旋组氨酸酯类衍生物凝胶因子溶液(1.0mg/mL)，在24孔细胞培养板中每孔加入200uL，在室温下静置20～30分钟，形成左旋水凝胶。40-50℃干燥1-3天，紫外光照射30min灭菌。
实施例5、左旋纳米凝胶纤维支架材料的制备
本实施例涉及一种用于细胞培养的手性纳米凝胶支架材料。所述手性纳米凝胶支架材料由具有手性氨基酸单元的小分子凝胶因子自组装而成，该凝胶因子以环己烷为中心核，酰胺键为连接键，环己烷1、4位连接谷氨酸氨酸一缩乙二醇基团。
5.1左旋蛋氨酸酯类衍生物凝胶因子的制备
左旋谷氨酸酯类衍生物凝胶因子的具体合成步骤与实施例1中左旋蛋氨酸酯类衍生物凝胶因子的合成步骤基本一致，不同之处仅在于：合成原料中L-蛋氨酸甲酯盐酸盐改为L-谷氨酸甲酯盐酸盐。
5.2左旋手性纳米凝胶纤维的制备
左旋手性纳米凝胶纤维的制备步骤为：将2.5mg凝胶因子粉末分散于2.5mL去离子水中，在90℃～100℃加热2～3分钟将其溶解制成2.5mL左旋谷氨酸酯类衍生物凝胶因子溶液(1.0mg/mL)，在24孔细胞培养板中每孔加入200uL，在室温下静置20～30分钟，形成左旋水凝胶。40-50℃干燥1-3天，紫外光照射30min灭菌。
实施例6、左旋纳米凝胶纤维支架材料的制备
本实施例涉及一种用于细胞培养的手性纳米凝胶支架材料。所述手性纳米凝胶支架材料由具有手性氨基酸单元的小分子凝胶因子自组装而成，该凝胶因子以苯环为中心核，酰胺键为连接键，苯环1、4位连接左旋蛋氨酸一缩乙二醇基团。
6.1左旋蛋氨酸酯类衍生物凝胶因子的制备
将5.6g L-蛋氨酸甲酯盐酸盐加入20mL二氯甲烷中搅拌后，滴加8.0mL三乙胺。冰浴下，将2.5g 1,4-苯二酰氯溶于10mL二氯甲烷中并滴加入上述溶液中，撤去冰浴，室温下搅拌反应24小时，旋转蒸发除去二氯甲烷溶剂，得1,4-苯二-L-蛋氨酸甲酯。将10mL氢氧化钠水溶液(摩尔浓度为2M)加入1,4-苯二-L-蛋氨酸甲酯的甲醇溶液(1,4-苯二-L-蛋氨酸甲酯为3.0g，甲醇体积为20mL)，室温下搅拌反应12小时至溶液澄清。反应结束后，用盐酸溶液(摩尔浓度为3M)调节体系pH值小于3，出现白色沉淀，抽滤后得1,4-苯二-L-蛋氨酸。将2.5g1,4-苯二-L-蛋氨酸加入50mL一缩乙二醇中，将0.5mL浓盐酸滴加入上述反应液中，加热到145℃搅拌回流反应4小时。反应结束后将反应液倒入冰水混合物中，出现大量凝胶中白色沉淀。抽滤收集沉淀，用去离子水冲洗沉淀后，干燥得左旋蛋氨酸衍生物凝胶因子，结构式如下所示。
Figure BDA0002116080420000091
6.2左旋手性纳米凝胶纤维的制备
将2.5mg上述左旋蛋氨酸衍生物凝胶因子粉末分散于5.0mL去离子水中，在90℃～100℃加热2～3分钟将其溶解制成5.0mL左旋蛋氨酸酯类衍生物凝胶因子溶液(0.5mg/mL)，在24孔细胞培养板中每孔加入200uL，在室温下静置20～30分钟，形成左旋水凝胶。40℃下干燥2天，紫外光照射30min灭菌。
细胞实验结果
将上述实施例4至实施例6制备的左旋纳米凝胶纤维支架材料用于细胞实验，获得的效果为：
当凝胶因子侧链氨基酸相同时：凝胶因子中心核为环己烷时，细胞在凝胶纤维上的粘附增殖量略高于凝胶因子中心核为苯环时。
当凝胶因子中心核相同时：凝胶因子侧链为左旋蛋氨酸时，细胞在凝胶纤维上的粘附增殖量略高于凝胶因子侧链为其左旋他氨基酸时。
综上，当凝胶因子中心核为环己烷，侧链为左旋蛋氨酸时，所形成的的凝胶稳定性最好，细胞在凝胶纤维上的粘附增殖量最大，最有利于细胞培养。
综上所述，本实施制得的左旋手性纳米凝胶支架材料成功将人体内胶原蛋白手性螺旋结构引入体外细胞培养支架体系中，是具有通过纳米纤维的手性螺旋结构调控细胞黏附及分化行为的高仿生细胞支架材料，能够普遍促进细胞在材料上的粘附，有利于细胞进一步的增殖生长，并对干细胞的定向分化具有显著诱导效果；纳米凝胶支架的手性螺旋结构是通过具有手性单元的氨基酸酯类衍生物通过疏水-疏水、氢键、π-π堆积等非共价相互作用自组装而得，无需复杂的合成步骤，易于大批量工业生产，所得产物纯度高，分散性好，适宜于商业化细胞体外三维培养支架材料使用。
对比例1
本对比例涉及一种凝胶支架材料，具体制备步骤与实施例1基本一致，不同之处仅在于：将凝胶因子粉末分散于甲醇中。凝胶因子溶解于甲醇溶剂中，将含有凝胶因子的甲醇溶液干燥后，形成的无规聚集纳米颗粒，不能得到具有超分子手性螺旋结构纳米纤维。图5为左旋蛋氨酸酯类衍生物凝胶因子(实施例1的第1.2点中制得的左旋蛋氨酸酯类衍生物凝胶因子)和右旋蛋氨酸酯类衍生物溶于甲醇干燥后形成的没有超分子手性螺旋结构的无规聚集体。
采用本对比例制得的支架材料进行细胞实验，实验结果表明，NIH 3T3细胞在上述没有超分子手性结构的左旋蛋氨酸衍生物和右旋蛋氨酸衍生物材料上培养4小时后，细胞黏附量没有显著性差异。与实施例2的第2.1点结果对比，进一步证明实施例2的第2.1点中左旋蛋氨酸酯类衍生物在水中形成的左旋超分子螺旋结构对细胞粘附铺展有明显促进作用。
对比例2
本对比例涉及一种凝胶支架材料，具体制备步骤与实施例1基本一致，不同之处仅在于：将凝胶因子粉末在80℃加热溶解。
采用本对比例制得的支架材料进行细胞实验，实验结果表明由于凝胶因子未充分溶解，不能在细胞培养板上制备出均匀的纳米凝胶纤维，导致细胞在纳米凝胶纤维上的黏附不均匀，不利于实验结果统计分析。
对比例3
本对比例涉及一种凝胶支架材料，具体制备步骤与实施例1基本一致，不同之处仅在于：凝胶因子的合成原料中L-蛋氨酸甲酯盐酸盐改为D,L-蛋氨酸甲酯盐酸盐，凝胶因子的侧链为外消旋蛋氨酸衍生物。
采用本对比例制得的支架材料进行细胞实验，实验结果表明牙髓干细胞(DPSC)在外消旋蛋氨酸衍生物形成的纳米纤维上成骨特征基因(BMP2)的相对表达比在左旋蛋氨酸衍生物形成的纳米纤维上低50％左右。
本发明提供了一种用于促进细胞黏附和成骨分化的左旋手性纳米凝胶细胞支架材料的制备方法，解决了现有细胞培养过程中细胞在基质材料上黏附差、定向分化困难的问题，其主要步骤为：(1)将左旋氨基酸酯类衍生物凝胶因子分散于去离子水中，获得质量体积浓度为0.5mg/mL～1.0mg/mL的左旋氨基酸酯类衍生物凝胶因子分散溶液；(2)将上述分散液加热至澄清溶液；(3)将上述澄清溶液加入细胞培养板的孔板中；(4)将制得的细胞培养板在室温下静置20～30分钟，形成左旋水凝胶；(5)将细胞培养板进行干燥，得到底部被凝胶纤维支架覆盖的孔板；(6)将细胞悬液加入上述细胞培养板的孔板中进行细胞培养。本发明可用于促进细胞黏附和成骨定向分化的研究领域中。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (6)

1.一种左旋手性纳米凝胶纤维的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将左旋氨基酸衍生物凝胶因子分散于去离子水中，加热后得到左旋氨基酸衍生物凝胶因子的澄清溶液；
S2、将所述左旋氨基酸衍生物凝胶因子的澄清溶液加至细胞培养板中，在室温下静置后形成左旋水凝胶，将所述左旋水凝胶干燥处理后，得到所述左旋手性纳米凝胶纤维材料；
所述的左旋手性纳米凝胶纤维的制备方法，步骤S1中，所述加热的温度为90℃～100℃，加热的时间为2～3分钟；
步骤S1中，在所述左旋氨基酸衍生物凝胶因子的澄清溶液中，所述左旋氨基酸衍生物凝胶因子的质量体积浓度为0.5 mg/mL～1.0mg/mL；
所述左旋氨基酸衍生物凝胶因子为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.一种根据权利要求1所述的左旋手性纳米凝胶纤维的制备方法，其特征在于，所述左旋氨基酸衍生物凝胶因子的制备方法包括如下步骤：
A1、将左旋氨基酸酯的盐酸盐溶于溶剂中，得到左旋氨基酸酯的盐酸盐溶液； 1,4-环己二酰氯溶于溶剂中，得到1,4-环己二酰氯溶液；
A2、将所述1,4-环己二酰氯溶液在低温下加至所述左旋氨基酸酯的盐酸盐溶液中，室温下搅拌，反应结束后除去溶剂，得到1,4-环己二-L-氨基酸酯化合物；
A3、将所述1,4-环己二-L-氨基酸酯化合物依次经碱处理、酸处理后，得到1,4-环己二-L-氨基酸；
A4、将所述1,4-环己二-L-氨基酸与一缩乙二醇在酸性条件下加热反应，反应结束后将反应液倒入冰水混合物中，收集沉淀物；将沉淀物经去离子水冲洗沉淀后，干燥，即得。
3.根据权利要求2所述的左旋手性纳米凝胶纤维的制备方法，其特征在于，所述凝胶因子制备方法的步骤A1中，所述左旋氨基酸酯的盐酸盐包括L-蛋氨酸甲酯盐酸盐。
4.根据权利要求1所述的左旋手性纳米凝胶纤维的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述滴加的步骤为：在细胞培养板的每孔中滴加可覆盖孔板底部的左旋氨基酸衍生物凝胶因子的澄清溶液；
所述细胞培养板为24孔板、96孔板、12孔板或6孔板；
所述静置的时间为20～30分钟；
所述干燥的温度为40-50℃，干燥的时间为1-3天。
5.一种根据权利要求1所述的制备方法得到的左旋手性纳米凝胶纤维。
6.一种根据权利要求5所述的左旋手性纳米凝胶纤维作为细胞培养支架材料的应用，所述应用包括：将细胞悬液加至所述左旋手性纳米凝胶纤维的表面进行培养。
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CN111735897B (zh) * 2020-06-15 2022-10-14 上海交通大学 一种氧化石墨烯基手性纳米复合材料在氨基酸对映体分离和含量分析中的应用
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CN109569445A (zh) * 2018-10-09 2019-04-05 上海交通大学 奇偶效应功能化的手性水凝胶材料及制备方法
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