CN110404054A - 一种艾塞那肽微球制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种艾塞那肽微球制剂及其制备方法和应用，所述的艾塞那肽微球制剂，包含下述质量百分比的组分：3‑10%艾塞那肽或艾塞那肽盐，和90‑97%聚合物共混物；所述的聚合物共混物包含聚丙交酯‑乙交酯和聚丙交酯，所述的聚丙交酯‑乙交酯包含末端为羧酸基团的第一聚丙交酯‑乙交酯和末端为酯基基团的第二聚丙交酯‑乙交酯。本发明的艾塞那肽微球注射后突释小、起效快、释药周期长，能明显简化Ⅱ型糖尿病治疗方案，具有较好的临床应用前景。

Description

一种艾塞那肽微球制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种艾塞那肽微球制剂及其制备方法和应用。
背景技术
艾塞那肽是人工合成的北美毒晰外泌肽，由39个氨基酸残基组成，为胰高血糖素-1(GLP-1)受体激动剂。艾塞那肽已知的药理作用包括：(1)增加葡萄糖依赖性促胰岛素分泌；(2)抑制型糖尿病患者胰高血糖素的分泌；(3)抑制餐后胃肠动力及分泌功能，延迟胃排空，从而有利于餐后血糖的控制；(4)降低食欲，减少食物的摄入；(5)刺激β细胞凋亡，从而增加β细胞的数量；(6)改善型糖尿病患者的空腹及餐后血糖水平。与传统的治疗糖尿病药物相比，艾塞那肽具有不可比拟的优点。
目前已上市的艾塞那肽注射液于2005年4月通过FDA批准，商品名Byetta。然而由于半衰期短，该产品需在每天早晚餐前各注射一次，长期的、每日两次地给药，患者顺应性较差。
因此，为降低给药频率、提高患者顺应性，Amylin和阿斯利康公司开发了一周注射一次的艾塞那肽微球制剂Bydureon，于2012年1月通过FDA批准，但该微球制剂在体内存在的初期突释明显、前期释药迟滞期长等问题（参考专利文献1），易造成血药浓度波动大，导致副作用明显。因此需要开发一种突释低、前期释药迟滞期短、起效快、血药浓度波动小的艾塞那肽微球制剂。
现有技术文献
专利文献1：CN 101065116 A。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速起效的长效艾塞那肽微球制剂及其制备方法和用途，以解决现有产品存在的突释快，释药迟滞期长，稳态血药浓度波动大问题。
本发明提供了一种艾塞那肽微球制剂，包含下述质量百分比的组分：3-10%艾塞那肽或艾塞那肽盐，和90-97%聚合物共混物；所述的聚合物共混物包含聚丙交酯-乙交酯和聚丙交酯，所述的聚丙交酯-乙交酯包含末端为羧酸基团的第一聚丙交酯-乙交酯和末端为酯基基团的第二聚丙交酯-乙交酯。
本发明的艾塞那肽微球通过包含末端为羧酸基团的第一聚丙交酯-乙交酯、和末端为酯基基团的第二聚丙交酯-乙交酯，可以使制备的微球释药更平稳；另外通过包含聚丙交酯，更有助于艾塞那肽微球制剂的前期释药。
其中，在上述艾塞那肽微球制剂中，优选包含下述质量百分比的组分：4-8%艾塞那肽或艾塞那肽盐，和92-96%聚合物共混物；更优选包含下述质量百分比的组分：5-8%艾塞那肽或艾塞那肽盐，和92-95%聚合物共混物；进一步优选包含下述质量百分比的组分：5-6%艾塞那肽或艾塞那肽盐，和94-95%聚合物共混物。
上述的艾塞那肽盐可以为任何可以药用的艾塞那肽盐，所述的艾塞那肽盐包括艾塞那肽有机酸盐和艾塞那肽无机酸盐；优选的为艾塞那肽醋酸盐、艾塞那肽盐酸盐、艾塞那肽乳酸盐、艾塞那肽三氟乙酸盐、艾塞那肽枸橼酸盐、艾塞那肽富马酸盐、艾塞那肽丙二酸盐、艾塞那肽马来酸盐、艾塞那肽酒石酸盐、艾塞那肽门冬氨酸盐、艾塞那肽苯甲酸盐、艾塞那肽琥珀酸盐或艾塞那肽扑酸盐。
在一些实施方案中，所述的第一聚丙交酯-乙交酯中丙交酯与乙交酯的摩尔比为25-75:25-75，优选为40-60:40-60，更优选为50:50。
在一些实施方案中，第二聚丙交酯-乙交酯中丙交酯与乙交酯的摩尔比为50-90:10-50，优选为65-85:15-35，更优选为75:25。
在一些实施方案中，所述的第一聚丙交酯-乙交酯的特性粘度为0.20-0.55 dL/g，优选为0.35-0.50dL/g，更优选为0.40-0.50 dL/g。
在一些实施方案中，所述的第二聚丙交酯-乙交酯的特性粘度为0.50-0.90 dL/g，优选为0.60-0.80 dL/g。
在一些实施方案中，聚丙交酯的特性粘度范围为0.05-0.25 dL/g，优选为0.05-0.15 dL/g。
在一些实施方案中，所述的第一聚丙交酯-乙交酯的重均分子量为20000-80000道尔顿，优选为30000-75000道尔顿，更优选为50000-70000道尔顿。
在一些实施方案中，所述的第二聚丙交酯-乙交酯的重均分子量为50000-150000道尔顿，优选为80000-145000道尔顿，更优选为95000-140000道尔顿。
在一些实施方案中，所述的聚丙交酯的重均分子量为4000-20000道尔顿，优选为5000-17000道尔顿。
在一些实施方案中，所述的聚合物共混物中含有下述质量份的组分：第一聚丙交酯-乙交酯25-40份，优选为25-35份，更优选为30-35份；第二聚丙交酯-乙交酯25-40份，优选为28-35份，更优选为30-35份；聚丙交酯25-40份，优选为28-35份，更优选为30-35份。
在一些实施方案中，所述的聚合物共混物中第一聚丙交酯-乙交酯、第二聚丙交酯-乙交酯和聚丙交酯的质量比为25-40：25-40：25-40；优选为25-35：28-35：28-35；更优选为30-35：30-35：30-35。
本发明还提供了艾塞那肽微球制剂的制备方法，该方法采用O/W乳化挥发法，制备方法中油相（O相）中的有机溶剂为甲醇和二氯甲烷混合物，水相（W相）中包含稳定剂、水和平衡溶剂。
一种优选的艾塞那肽微球制剂的制备方法，包括以下步骤：
a、艾塞那肽或艾塞那肽盐和聚合物共混物溶于有机溶剂中制备成油相；稳定剂和平衡溶剂溶解于水中制备成水相；
b、将油相注入水相中，高速剪切，制备成O/W乳液，然后搅拌固化；优选为，将水相分为第一水相（有时简写为“W1”）和第二水相（有时简写为“W2”）两部分，将油相注入第一水相中，高速剪切，制备成O/W乳液，再将所述乳液加入第二水相中搅拌固化；
c、冲洗微球，过筛收集，干燥。
在一些实施方案中，所述第一水相和第二水相的体积比为1:2~1:12，优选1:4~1:10，进一步优选1:6~1:8。
在一些实施方案中，有机溶剂为甲醇和二氯甲烷混合物，其中，甲醇的主要作用是溶解艾塞那肽或艾塞那肽盐和加快乳滴形成初期的表面固化速度，有益于提高包封率；二氯甲烷的作用是溶解PLGA和维持混合溶剂乳化和固化时的成球能力。在固化时，该混合溶剂形成的乳滴可以维持良好的球形，从而能保证乳滴以良好的球形完成固化过程，固化形成的微球表面性质有利于降低突释，同时该混合溶剂能使艾塞那肽在球内的分散更加均匀。
在一些实施方案中，所述的混合溶剂中甲醇和二氯甲烷的体积比为1:3至2:3；水相与油相的体积比为3-100:1，优选为5-70:1，更优选为39-66:1。
在一些实施方案中，所述的油相中艾塞那肽或艾塞那肽盐的浓度为2-20 mg/ml，优选为5-15 mg/ml。
在一些实施方案中，油相中聚合物共混物的浓度为0.05-0.5g/ml，优选为0.1-0.4g/ml，更优选的为0.19 g/ml。
在一些实施方案中，水相中稳定剂的质量浓度为0.1%-5%（w/v），优选为0.5%-2%（w/v）；稳定剂选自聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、海藻糖、吐温中的一种或多种，优选地，稳定剂至少包括聚乙烯醇。聚乙烯醇能使制备初期形成的油相乳滴更加稳定。
在一些实施方案中，水相中平衡溶剂的质量浓度为0.1-5%（w/v），优选为0.1-1%（w/v）；所述的平衡溶剂为二氯甲烷。
本发明还提供了艾塞那肽微球制剂在制备用于治疗II型糖尿病的药物中的用途。
本发明还提供了艾塞那肽微球制剂用于治疗II型糖尿病的用途。
本发明还提供治疗患有II型糖尿病患者的方法，包括给予患者治疗有效量的艾塞那肽微球制剂。
本发明具有以下的技术效果：
（1）本发明的艾塞那肽微球释药更平稳、且前期释药迟滞期明显缩短，释药周期更长，更有利于降低多次给药时血药浓度的波动，从而降低毒副作用。
（2）本发明的艾塞那肽微球可以实现每月或更久给药一次，将显著降低给药频率，提高患者顺应性，具有良好的临床应用前景。
（3）本发明的艾塞那肽微球采用O/W乳化挥发法，可以获得艾塞那肽分布均匀的微球。
附图说明
图1示出了实施例2、对比例2、对比例3的艾塞那肽微球和Bydureon艾塞那肽微球的45℃体外累积释放率曲线。
图2示出了实施例2、对比例4、对比例5制备的艾塞那肽微球和Bydureon艾塞那肽微球的45℃体外累积释放率曲线。
图3示出了实施例2、实施例5制备的艾塞那肽微球的45℃累积释放率曲线。
图4示出了实施例4、实施例5和实施例6制备的艾塞那肽微球的45℃累积释放率曲线。
图5示出了实施例4、实施例5制备的艾塞那肽微球和Bydureon艾塞那肽微球在比格犬体内血药浓度的曲线。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述本发明，但提供这些实施例并非意图限制本发明的范围。
本文中，聚丙交酯-乙交酯，又称聚乳酸-羟基乙酸共聚物，简称PLGA，是丙交酯、乙交酯的环状二聚合物在亲核引发剂催化作用下的开环聚合物。PLGA末端基团可以为羧基、酯基等。在本申请中，使用了羧基末端的聚丙交酯-乙交酯和酯基末端的聚丙交酯-乙交酯。
本文中，聚丙交酯，也称聚乳酸，简称PLA，是丙交酯环状二聚合物在亲核引发剂催化作用下的开环聚合物。
本文中，所述的特性粘度是指PLGA或PLA的比浓对数粘度，即PLGA或PLA溶液相对黏度的自然对数与其质量浓度之比；特性粘度（inherent viscosity）测定方法：将聚合物材料用氯仿配制成约0.5％（w/v）的溶液，于30℃下，按照英国药典2013版Appendix VH.粘度测定方法II所述方法（毛细管法）测定。
在本文中，重均分子量，是按质量的统计平均分子量，在单位重量上平均得到的分子量，通常有光散射法，凝胶渗透色谱法来获得，重均分子量其分子量较大的部分占有较高的权重。
为方便描述，在本文中，PLGA的命名组成是丙交酯与乙交酯的摩尔比+旋光性+G+高分子末端类型，并在其括号中对特性粘度范围和重均分子量进行表示。旋光性的表示方式为：D代表右旋，L代表左旋，DL代表外消旋。高分子末端类型的表示方式为：A为羧基末端，E为酯基末端。例如 “5050 DLG A（0.4-0.5，61000）”表示该PLGA是外消旋物质，其中丙交酯与乙交酯的摩尔比为 50:50，末端基团为羧基，特性粘度为0.4-0.5 dL/g，重均分子量为61000道尔顿。
为方便描述，在本文中，PLA的命名组成是：丙交酯含量+旋光性+高分子末端类型，并在其括号中对特性粘度范围和重均分子量进行表示。例如 “100 DL A（0.15-0.25，16000）”表示该PLA是外消旋物质，其中丙交酯与乙交酯的摩尔比为 100: 0，末端基团为羧基，特性粘度为0.15-0.25 dL/g，重均分子量为16000道尔顿。
本发明的艾塞那肽微球制剂，通常制备成注射用的混悬剂，或以无菌粉末的形式存在。
本发明的艾塞那肽微球制剂，可以采用溶媒混悬后给药。所述的溶媒是含有粘度增强剂、润湿剂、渗透压调节剂、pH调节剂的水性溶媒。所述粘度增强剂优选羧甲基纤维素钠(CMC-Na)；所述润湿剂选自非离子表面活性剂如泊洛沙姆、聚山梨酯（吐温Tween）或失水山梨醇脂肪酸酯（司盘Span）；所述渗透压调节剂选自山梨醇、氯化钠、甘露醇、葡萄糖等；所述pH调节剂优选磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。所述溶媒可以与微球混合后包装，或溶媒与微球分开独立包装而在给药前将溶媒与微球混合。
本发明的艾塞那肽微球制剂用于治疗II型糖尿病；可以用于通过降低血浆葡萄糖水平的药剂而获益的疾病的治疗；用于预防高血糖；用于预防高血压；和用于治疗会通过给予延迟和/或延缓胃排空的药剂而获益的疾病的治疗；还可以用于减少食物摄入、抑制食欲并治疗肥胖症；本发明的艾塞那肽微球制剂还可以用于治疗充血性心力衰竭。尽管“肥胖症”通常被定义为体重指数超过30 ，出于本发明公开的目的，需要或希望减轻体重的任何对象，包括体重指数小于30 的对象，都被包括在"肥胖"的范围内。
本发明艾塞那肽微球制剂通常可按照本领域通常所知方法给药。可通过注射、植入(例如皮下、肌内、腹膜内、颅内和皮内)、粘膜给药(例如鼻内、阴道内、肺内或借助栓剂)、口服、无针注射或原位递送(例如通过灌肠剂或气雾剂)将本发明的缓释微球制剂给予患者(例如需要该制剂的人类)或其它动物。
可用在所需时间内达到所需治疗水平的任何给药时间给予该微球制剂。举例而言，可给予微球制剂，监测患者直到所递送的药物水平回到基线。回到基线后，可再次给予微球制剂。或者，可在患者体内达到基线水平前序惯给予微球制剂。
本发明的微球制剂还可与皮质类固醇一起给予。本发明的微球制剂与皮质类固醇一起给予可进一步提高微球制剂中生物活性多肽的生物利用度。本发明所定义的皮质类固醇指类固醇类抗炎性剂，也称为糖皮质激素。
本发明中所用术语患者是指人类，例如需要该药剂或治疗方法、预防方法或诊断方法的人类。
实施例1
准确称量174mg艾塞那肽，0.667g 5050 DLG A（0.4-0.5，61000），0.667g 7525 DLG E（0.6-0.8，115000）和0.667g 100 DL A（0.05-0.15，6100）于30mL西林瓶中，加入10.5mL甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。室温条件下，调节高速剪切机转速至1300rpm，用注射器将油相注入水相中，剪至3min，然后搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
实施例2
准确称量106mg艾塞那肽，0.667g 5050 DLG A（0.4-0.5，61000），0.667g 7525 DLG E（0.6-0.8，115000）和0.667g 100 DL A（0.05-0.15，6100）于30mL西林瓶中，加入10.5mL甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。室温条件下，调节高速剪切机转速至1300rpm，用注射器将油相注入水相中，剪至3min，然后搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
实施例3
准确称量106mg艾塞那肽，0.667g 5050 DLG A（0.35-0.45，52000），0.667g 7525 DLGE（0.5-0.6，86000）和0.667g 100 DL A（0.05-0.15，6100）于30mL西林瓶中，加入10.5mL甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。室温条件下，调节高速剪切机转速至1300rpm，用注射器将油相注入水相中，剪至3min，然后搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
实施例4
准确称量106mg艾塞那肽，0.800g 5050 DLG A（0.4-0.5，61000），0.600g 7525 DLG E（0.6-0.8，115000）和0.600g 100 DL A（0.05-0.15，6100）于30mL西林瓶中，加入10.5mL甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。将水相分为两部分，第一水相:第二水相=1:7(v/v)。室温条件下，调节高速剪切机转速至780rpm，用注射器将油相注入第一水相中，剪至3min，然后将微球初乳转移至第二水相中，搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
实施例5
准确称量106mg艾塞那肽，0.667g 5050 DLG A（0.4-0.5，61000），0.667g 7525 DLG E（0.6-0.8，115000）和0.667g 100 DL A（0.05-0.15，6100）于30mL西林瓶中，加入10.5mL甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。将水相分为两部分，第一水相:第二水相=1:7(v/v)。室温条件下，调节高速剪切机转速至780rpm，用注射器将油相注入第一水相中，剪至3min，然后将微球初乳转移至第二水相中，搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
实施例6
准确称量106mg艾塞那肽，0.600g 5050 DLG A（0.4-0.5，61000），0.700g 7525 DLG E（0.6-0.8，115000）和0.700g 100 DL A（0.05-0.15，6100）于30mL西林瓶中，加入10.5mL甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。将水相分为两部分，第一水相:第二水相=1:7(v/v)。室温条件下，调节高速剪切机转速至780rpm，用注射器将油相注入第一水相中，剪至3min，然后将微球初乳转移至第二水相中，搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
实施例7
准确称量106mg艾塞那肽，0.400g 5050 DLG A（0.4-0.5，61000），0.400g 7525 DLG E（0.6-0.8，115000）和1.200g 100 DL A（0.05-0.15，6100）于30mL西林瓶中，加入10.5mL甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。室温条件下，调节高速剪切机转速至1300rpm，用注射器将油相注入水相中，剪至3min，然后搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
实施例8
准确称量106mg艾塞那肽，0.400g 5050 DLG A（0.4-0.5，61000），1.200g 7525 DLG E（0.6-0.8，115000）和0.400g 100 DL A（0.05-0.15，6100）于30mL西林瓶中，加入10.5mL甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。室温条件下，调节高速剪切机转速至1300rpm，用注射器将油相注入水相中，剪至3min，然后搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
对比例1
准确称量106mg艾塞那肽，2.000g 100 DL A（0.05-0.15，6100）于30mL西林瓶中，加入10.5mL甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。室温条件下，调节高速剪切机转速至1300rpm，用注射器将油相注入水相中，剪至3min，然后搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
对比例2
准确称量106mg艾塞那肽，2.000g 5050 DLG A（0.4-0.5，61000）于30mL西林瓶中，加入10.5mL甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。室温条件下，调节高速剪切机转速至1300rpm，用注射器将油相注入水相中，剪至3min，然后搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
对比例3
准确称量106mg艾塞那肽，2.000g 7525 DLG E（0.5-0.6，86000）于30mL西林瓶中，加入10.5mL甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。室温条件下，调节高速剪切机转速至1300rpm，用注射器将油相注入水相中，剪至3min，然后搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
对比例4
准确称量106mg艾塞那肽，0.400g 100 DL A（0.05-0.15，6100），1.600g 5050 DLG A（0.4-0.5，61000）于30mL西林瓶中，加入10.5mL甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。室温条件下，调节高速剪切机转速至1300rpm，用注射器将油相注入水相中，剪至3min，然后搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
对比例5
准确称量106mg艾塞那肽，0.400g 100 DL A（0.05-0.15，6100），1.600g 7525 DLG E（0.6-0.8，115000）于30mL西林瓶中，加入10.5mL甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。室温条件下，调节高速剪切机转速至1300rpm，用注射器将油相注入水相中，剪至3min，然后搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
对比例6
准确称量106mg艾塞那肽，1.000g 5050 DLG A（0.25-0.35，34000），1.000g 7525 DLGE（0.6-0.8，115000）于30ml西林瓶中，加入10.5ml甲醇和二氯甲烷（2:5，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，并加入3.5g二氯甲烷制成水相。室温条件下，调节高速剪切机转速至1300rpm，用注射器将油相注入水相中，剪至3min，然后搅拌固化5h，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
对比例7
准确称量107mg艾塞那肽，1.08g 5050 DLG A（0.2，18000）， 0.72g 5050 DLG A（0.43，64000），23mg蔗糖于30ml西林瓶中，加入20ml二甲亚砜和二氯甲烷（9:11，v/v）混合溶剂溶解，制得油相。将3.3g聚乙烯醇溶解于660ml去离子水中，制成水相。在25℃水浴条件下，调节高速剪切机转速至1300rpm，用注射器将油相注入水相中，完成注入后，维持剪切2min，在25℃搅拌固化3h后，用金属筛筛分微球，并用2L去离子水冲洗微球，干燥得粉末状微球。
实验方法：
粒径检测：
称取适量微球粉末，用0.1%曲拉通溶液润湿分散，采用Mastersizer 3000激光粒度仪测得微球粒径。
载药量检测或计算：
载药量测定方法是先用乙酸和乙腈溶液破坏微球，使艾塞那肽释放至溶液中，再用水将PLGA析出，离心测定上清液中艾塞那肽浓度。
载药量（%）= 实际测得艾塞那肽含量/微球质量*100%
突释检测：
取微球约150±5mg，精密称量，置密闭西林瓶中，加入5mL pH 7.4±0.1的HEPES缓冲溶液，置于37±0.5℃水浴摇床中，静置1h后取样，HPLC测量释放至缓冲液中艾塞那肽量，除以称量微球中的艾塞那肽总量，即可获得突释量。
45℃体外释放度检测：
取微球约50±5mg，精密称量，加入50mL pH 9.4±0.1的Tris缓冲溶液，置于45±0.5℃水浴摇床中，在不同时间点取样，HPLC测量释放至缓冲液中艾塞那肽量，除以称量微球中的艾塞那肽总量，即可获得不同时间微球的艾塞那肽累积释放度。45℃体外加速条件下，本发明实施例释放周期10d-25d，而对应比格犬体内释放周期为20-40d。
体内血药浓度检测：
将实施例或对比例中微球，采用溶媒混悬后给药，每组选择比格犬6 只，给药剂量为0.6mg/kg，血浆样品经SPE（Solid-Phase Extraction）处理后，采用LC-MS/MS法测定艾塞那肽浓度，方法线性范围为0.05~10 ng/ml。
表1 汇总了Amylin 公司上市的1周制剂Bydureon 和上述实施例及对比例涉及的艾塞那肽微球、制备方法、载药量和粒径等特性，以便于对本发明有益效果的理解。
表1 艾塞那肽微球特性
“-“表示未检测。
由表1可知，对比例1采用单一材料100 DL A作为聚合物制备微球，因PLA与艾塞那肽结合能力弱，因此对比例1的载药量仅为1.46%。
根据突释检测实验结果，实施例3~实施例6的体外1小时突释量分别为0.16%、0.33%、0.17%、0.29%，证明本发明的微球均具有理想的抗突释效果。
图1示出了实施例2、对比例2、对比例3的艾塞那肽微球和Bydureon艾塞那肽微球的45℃体外累积释放率曲线。Bydureon有较长的释药迟滞期；对比例2制备的艾塞那肽微球，平台期较长，中后期释放变快；对比例3的艾塞那肽微球，平台期较长，中后期释放很慢；实施例2的艾塞那肽微球与对比例3的微球相比，其没有明显的释药迟滞期，又能维持适当的释药周期。当实施例2的艾塞那肽微球释放到19天时，累积释放率达到80.97%。
图2示出了实施例2、对比例4、对比例5制备的艾塞那肽微球和Bydureon艾塞那肽微球的45℃体外累积释放率曲线。实施例2与对比例5以及Bydureon相比，显著缩短前期平台期；对比例4虽然中期释放快，但是释放周期太短；对比例5虽然释放周期较对比例4延长，但是中期释放有平台。
图3示出了实施例2、实施例5制备的艾塞那肽微球的45℃累积释放率曲线。从图中释放曲线可知，水相一步加入或分步加入，获得的艾塞那肽微球虽然在45℃加速条件下，体外释放行为有一定差异，但整体趋势一致，且比格犬体内释药行为一致，根据产业化需求，两种方式均可实现本发明目的，优选分步加入。
图4示出了实施例4、实施例5和实施例6制备的艾塞那肽微球的45℃累积释放率曲线。从图中可以看出，上述实施例获得的艾塞那肽微球无明显平台期，释药平稳。45℃体外释放，实施例4在14天时累积释放率为91.66%，实施例5在19天时累积释放率为80.97%，实施例5在21天时累积释放率为77.93%。
图5示出了实施例4、实施例5制备的艾塞那肽微球和Bydureon艾塞那肽微球在比格犬体内血药浓度的曲线。从图5可知，Bydureon艾塞那肽微球在比格犬体内有接近29天的释药迟滞期，本发明的艾塞那肽微球将释药迟滞期缩短至8天。将微球注入比格犬体内，0.5h后，Bydureon艾塞那肽微球的突释血药浓度为1670pg/mL，实施例4、5的突释分别为322pg/mL，193pg/mL；Bydureon艾塞那肽微球在1h时达到最大突释量2730.0 pg/ml，实施例4和实施例5艾塞那肽微球分别在2h时达到最大突释量842.5和618.3 pg/mL，可见本发明所述微球制剂可降低体内突释。实施例4、5在比格犬体内的释药周期长达25-35天。
本发明的艾塞那肽微球，比格犬给药后体内突释618pg/ml较Bydureon 2730pg/ml明显降低。释药迟滞期8天较Bydureon 29天明显缩短，平稳释药周期25天较Bydureon 6天更长，说明本发明的艾塞那肽微球人体释药周期更长，可满足1月或更长周期给药一次，减少给药频率，提高患者顺应性，简化Ⅱ型糖尿病治疗方案，具有良好的临床应用前景。

Claims (12)

1.一种艾塞那肽微球制剂，其特征在于，包含下述质量百分比的组分：3-10%艾塞那肽或艾塞那肽盐，和90-97%聚合物共混物，所述聚合物共混物包含聚丙交酯-乙交酯和聚丙交酯，所述聚丙交酯-乙交酯包含末端为羧酸基团的第一聚丙交酯-乙交酯和末端为酯基基团的第二聚丙交酯-乙交酯；
优选地，包含下述质量百分比的组分：4-8%艾塞那肽或艾塞那肽盐，和92-96%聚合物共混物。
2.根据权利要求1所述的艾塞那肽微球制剂，其特征在于，所述艾塞那肽盐选自艾塞那肽有机酸盐或艾塞那肽无机酸盐；优选为艾塞那肽醋酸盐、艾塞那肽盐酸盐、艾塞那肽乳酸盐、艾塞那肽三氟乙酸盐、艾塞那肽枸橼酸盐、艾塞那肽富马酸盐、艾塞那肽丙二酸盐、艾塞那肽马来酸盐、艾塞那肽酒石酸盐、艾塞那肽门冬氨酸盐、艾塞那肽苯甲酸盐、艾塞那肽琥珀酸盐或艾塞那肽扑酸盐。
3.根据权利要求1或2所述的艾塞那肽微球制剂，其特征在于，所述第一聚丙交酯-乙交酯中丙交酯与乙交酯的摩尔比为25-75:25-75，优选为40-60:40-60，更优选为50:50。
4.根据权利要求1-3任一项所述的艾塞那肽微球制剂，其特征在于，所述第二聚丙交酯-乙交酯中丙交酯与乙交酯的摩尔比为50-90:10-50，优选为65-85:15-35，更优选为75:25。
5.根据权利要求1-4任一项所述的艾塞那肽微球制剂，其特征在于，所述第一聚丙交酯-乙交酯的特性粘度为0.20-0.55 dL/g，优选为0.35-0.50dL/g，更优选为0.40-0.50 dL/g；所述第二聚丙交酯-乙交酯的特性粘度为0.50-0.90 dL/g，优选为0.60-0.80 dL/g；所述聚丙交酯的特性粘度为0.05-0.25 dL/g，优选为0.05-0.15 dL/g。
6.根据权利要求1-5任一项所述的艾塞那肽微球制剂，其特征在于，所述第一聚丙交酯-乙交酯的重均分子量为20000-80000道尔顿，优选为30000-75000道尔顿，更优选为50000-70000道尔顿；
所述第二聚丙交酯-乙交酯的重均分子量为50000-150000道尔顿，优选为80000-145000道尔顿，更优选为95000-140000道尔顿；
所述聚丙交酯的重均分子量为4000-20000道尔顿，优选为5000-17000道尔顿。
7.根据权利要求1-6任一项所述的艾塞那肽微球制剂，其特征在于，所述聚合物共混物中含有下述质量份的组分：第一聚丙交酯-乙交酯25-40份，优选为25-35份；第二聚丙交酯-乙交酯25-40份，优选为28-35份；聚丙交酯25-40份，优选为28-35份。
8.一种权利要求1-7任一项所述的艾塞那肽微球制剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法采用O/W乳化挥发法，制备方法中油相中的有机溶剂为甲醇和二氯甲烷混合物，水相中包含稳定剂、水和平衡溶剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a、艾塞那肽或艾塞那肽盐和聚合物共混物溶于有机溶剂中制备成油相；稳定剂和平衡溶剂溶解于水中制备成水相；
b、将油相注入水相中，并高速剪切，制备成O/W乳液，并搅拌固化；优选为，将水相分为第一水相和第二水相两部分，将油相注入第一水相中，高速剪切，制备成O/W乳液，再将乳液加入第二水相中搅拌固化；
c、冲洗微球，过筛收集，干燥。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于所述甲醇和二氯甲烷的体积比为1:3至2:3；水相与油相的体积比为3-100:1，优选为5-70:1，更优选为39-66:1。
11.根据权利要求8-10任一项所述的制备方法，其特征在于所述油相中艾塞那肽或艾塞那肽盐的浓度为2-20g/ml，优选为5-15g/ml；油相中聚合物共混物的浓度为0.05-0.5g/ml，优选为0.1-0.4g/ml；
水相中稳定剂的质量浓度为0.1-5%（w/v），优选为0.5-2%(w/v)；稳定剂选自聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、海藻糖、吐温中的一种或多种，优选地，稳定剂至少包括聚乙烯醇；
水相中平衡溶剂的质量浓度为0.1-5%（w/v），优选为0.1-1%（w/v）；所述平衡溶剂为二氯甲烷。
12.权利要求1-7任一项所述的艾塞那肽微球制剂在制备用于治疗II型糖尿病的药物中的用途。
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