CN110402819A - 一种黄檗组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种黄檗组织培养方法，本发明的黄檗的组织培养方法选择乙醇‑纳米银溶液消毒是由于纳米银离子具有促进胚胎细胞形成和生长作用，且利用破坏菌体后自然迁徙到培养基中形成二次消毒能力的特性，诱导启动培养基和增殖培养基中添加TBHQ起到抗褐变的作用，本发明的方法外植体经过预处理两次催芽获得低污染材料，同时诱导启动培养基和增殖培养基采用特定的原料制成，可以减少外植体的褐变；本发明的方法可以在短时间内快速获得大量的黄檗优良品种苗木，本发明以黄檗带芽茎段为外植体，经过外植体催芽、芽诱导、芽增殖培养、生根培养、练苗及移栽实现了黄檗的离体再生，为其大量选育、快速繁殖新品种推广起到了技术支持。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种黄檗组织培养方法。
背景技术
黄檗是国家二级保护植物，主要分布于我国西南地区，经常作为伴生树种分布在阔叶红松林中，蓄积量不多，加上人们对于黄檗资源的破坏，导致了黄檗资源处于枯竭状态、黄檗为我国传统的常用的药材，其化学成分较多，主要有小檗碱、药根碱、掌叶防己碱、黄檗碱等生物碱，均为黄檗抗菌有效成分，其中小檗碱及掌叶防己碱都具有不同程度的降压作用。
目前在黄檗的组织培养方面研究相对较少，采用黄檗的种子为外植体先已有报道，但采用种子为外植体处理起来比较麻烦，因为每次外植体都需要灭菌处理，如果灭菌不彻底，容易引发外植体大批污染。
CN104663499A公开了一种黄檗组织培养快繁方法，该发明以黄檗新梢茎尖为外植体，经过外植体处理、接种、培养、生根及移栽等过程建立了黄檗组织培养快繁体洗，但是该发明采用黄檗新梢茎尖为外植体容易产生褐变，污染率较高，降低外植体的存活率，出苗率低，苗势较弱，经过该方法培养的黄檗中药用成分含量低。
鉴于以上原因，特提出本发明。
发明内容
为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种黄檗组织培养方法，本发明的方法可以在短时间内快速获得大量的黄檗优良品种苗木，本发明以黄檗带芽茎段为外植体，经过外植体催芽、芽诱导、芽增殖培养、生根培养、练苗及移栽实现了黄檗的离体再生，为其大量选育、快速繁殖新品种推广起到了技术支持。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种黄檗组织培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)首先分别配制诱导启动培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基并调节pH值，加热溶解后注入玻璃瓶中，在110-120℃高压消毒13-17min后凝固备用；
(2)选择3-4月未萌发优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，依次经过乙醇-纳米银溶液消毒和升汞消毒，用无菌水冲洗4-5次，放入无菌条件下催芽备用；
(3)将步骤(2)催芽备用的新枝条剪切成带有隐芽长度为1cm的茎段，接种在装有所述的诱导启动培养基的玻璃瓶中，依次进行低温培养，升温，在光照下培养28-32天，在茎段隐芽处分化长成单芽苗；
(4)将所述的单芽苗剪切成带有隐芽的小段，放入装有所述的增殖培养基的玻璃瓶中，进行增殖培养至4.0-4.4倍时，得到试管芽苗；
(5)将所述的试管芽苗剪去基部愈伤组织，接种在装有所述的壮苗培养基的玻璃瓶中，进行壮苗培养30-35天，得到试管壮苗；
(6)将所述的试管壮苗剪去基部愈伤组织和部分叶片，保留3-5片叶片，接种在装有所述的生根培养基的玻璃瓶中，进行生根培养10-15天，得到具有完整根的小苗；
(7)将所述的具有完整根的小苗取出清洗，移栽到基质中，喷施多菌灵后浇透水，控制温度和湿度，20天后生根成活。
进一步的，步骤(1)中所述的诱导启动培养基为WPM培养基或B5培养基，所述的诱导启动培养中还加入TDZ 0.051mg/L、GA3 1.0mg/L、6-BA1.0mg/L、TBHQ 1mg/L和α-NAA0.05mg/L。
进一步的，步骤(1)中增殖培养基为WPM培养基或改良MS培养基，所述的增殖培养基中还加入了TDZ 0.02mg/L、6-BA 0.5mg/L、α-NAA0.1mg/L、间苯三酚0.01mg/L。
其中，TBHQ起到抗褐变的作用，间苯三酚为连续继带物质，TDZ、6-BA、NAA、GA3为植物生长激素，本发明中的诱导启动培养基和增殖培养基采用特定的原料制成，可以减少外植体的褐变，通过降低培养基盐浓度和添加还原性物质来减轻褐变提高外植体的存活率。
进一步的，步骤(1)中壮苗培养基为WPS培养基，所述的壮苗培养基中还加入了6-BA 0.8-1.5mg/L和α-NAA 0.1-0.5mg/L。
进一步的，步骤(1)中所述的生根培养基包括1/2MS培养基、蔗糖15g/L、微量元素37.745mg/L、有机物5mg/L、α-NAA0.05mg/L、IAA 0.2-0.9mg/L和活性炭粉1g/L。
其中，微量元素为络合铁36.7mg/L、碘化钾0.75mg/L、氯化钴0.025mg/L、钼酸钠0.25mg/L、氯化镧0.01mg/L、硝酸银0.01mg/L，有机物为椰汁。本发明采用上述的原料可以提高组织成活率。
进一步的，步骤(2)中用浓度为5％的乙醇-纳米银溶液进行消毒15min，用浓度为0.2％的升汞消毒5min。
本发明中选择纳米银是因为纳米银离子具有促进胚胎细胞形成和生长作用，且利用破坏菌体后自然迁徙到培养基中形成二次消毒能力的特性。
进一步的，无菌条件催芽为在浓度为0.1％PVP水中加入浓度为0.3％的GA3在18-22℃的水中培养。
采用本发明的无菌条件下可以防止外植体材料过度产生酚类物质和褐变导致材料自毒效应引起死亡。
进一步的，步骤(3)中低温培养为6-10℃下低温暗培养7天，升温为温度升至21-25℃。
进一步的，低温培养为8℃下低温暗培养7天，升温为升至23℃。
进一步的，步骤(3)中光照强度为1500-20000lx，每日光照8-12小时，湿度为55-65％。
进一步的，每日光照10小时，湿度为60％。
进一步的，步骤(7)中基质为草炭和珍珠岩的混合物或者草炭和花生壳粉的混合物。
进一步的，草炭与珍珠岩的体积比为5-7:3-5，草炭与花生壳粉的体积比为1:0.5-1.5。
进一步的，草炭与珍珠岩的体积比为6:4，草炭与花生壳粉的体积比为1:1。
由于草炭保水能力强需要使用花生壳和珍珠岩来减少草炭含水率，其中，花生壳价格低廉易于接种有益微生物5406，提高成活率。
进一步的，步骤(7)中温度为25-28℃，湿度大于80％，前10天遮光70％，20天后生根成活，35-45天后全光照。
WPM培养基由如下的原料制成：硝酸铵(NH4NO3)400mg/L、氯化钙(CaCl2)72.5mg/L、硫酸镁(MgSO4)180.54mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/L、硝酸钙{Ca(NO3)24H2O}471.26mg/L、硫酸钾(K2SO4)990mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.25mg/L、络合铁(FeNa-EDDHA)36.7mg/L、硫酸锰(MnSO4·H2O)22.3mg/L、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L、甘氨酸2mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素1mg/L。
B5培养基由如下原料制成：磷酸二氢(NaH2PO4·H2O)150mg/L、无水氯化钙113.24mg/L、硝酸钾2500mg/L、硫酸铵134mg/L、无水硫酸镁122.09mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg/L、硫酸锰(MnSO4·2H2O)10.0mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)2.0mg/L、硼酸3.0mg/L、钼酸钠(Na2MoSO4·2H2O)0.25mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L、碘化钾0.75mg/L、维生素B1(盐酸硫胺素)10.0mg/L、维生素B6(盐酸吡哆醇)1.0mg/L、烟酸1.0mg/L、肌醇100.0mg/L、蔗糖20000mg/L、琼脂7000mg/L，25℃下调节pH值为5.5。
改良MS培养基由以下原料组成：硝酸钾80.0mg/L、抗坏血酸2.0mg/L、聚乙烯醇2000 1mg/L、硝酸钙287.0mg/L、硫酸镁738.0mg/L、硫酸钠53.0mg/L、氯化钾65.0mg/L、磷酸二氢钠19.1mg/L、盐酸硫胺素(维B1)0.2mg/L、盐酸吡哆素(维B6)0.1mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、甘氨酸3.0mg/L、蔗糖20000mg/L、硫酸锰6.6mg/L、硫酸锌2.7mg/L、碘化钾0.75mg/L、氯化钴0.025mg/L、硼酸1.5mg/L、钼酸钠0.25mg/L、EDTA-铁30mg/L、卡拉胶6.5g/L，25℃下调节pH值为5.7。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的黄檗的组织培养方法选择乙醇-纳米银溶液消毒是由于纳米银离子具有促进胚胎细胞形成和生长作用，且利用破坏菌体后自然迁徙到培养基中形成二次消毒能力的特性，诱导启动培养基和增殖培养基中添加TBHQ起到抗褐变的作用，间苯三酚为连续继带物质，TDZ、6-BA、NAA、GA3为植物生长激素，本发明的方法经过启动培养基和增殖培养基进行培养，使得外植体经过预处理两次催芽获得低污染材料，同时诱导启动培养基和增殖培养基采用特定的原料制成，可以减少外植体的褐变，通过降低培养基盐浓度和添加还原性物质来减轻褐变提高外植体的存活率，提高黄檗中的药物组分含量；
(2)本发明的方法使得黄檗组培外植体可以在30天获得无菌系，并通过含有连续继代培养物质的间苯三酚来减少继代死亡和弱化趋势增殖培养获得4倍的增值率，通过生根培养可以获得90％的生根苗，苗高10-15cm，新根5条以上，移栽练苗成活率达到98％以上；
(3)本发明的方法可以在短时间内快速获得大量的黄檗优良品种苗木，本发明以黄檗带芽茎段为外植体，经过外植体催芽、芽诱导、芽增殖培养、生根培养、练苗及移栽实现了黄檗的离体再生，为其大量选育、快速繁殖新品种推广起到了技术支持。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明中WPM培养基由如下的原料制成：硝酸铵(NH4NO3)400mg/L、氯化钙(CaCl2)72.5mg/L、硫酸镁(MgSO4)180.54mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/L、硝酸钙{Ca(NO3)24H2O}471.26mg/L、硫酸钾(K2SO4)990mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.25mg/L、络合铁(FeNa-EDDHA)36.7mg/L、硫酸锰(MnSO4·H2O)22.3mg/L、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L、甘氨酸2mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素1mg/L。
B5培养基由如下原料制成：磷酸二氢(NaH2PO4·H2O)150mg/L、无水氯化钙113.24mg/L、硝酸钾2500mg/L、硫酸铵134mg/L、无水硫酸镁122.09mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg/L、硫酸锰(MnSO4·2H2O)10.0mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)2.0mg/L、硼酸3.0mg/L、钼酸钠(Na2MoSO4·2H2O)0.25mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L、碘化钾0.75mg/L、维生素B1(盐酸硫胺素)10.0mg/L、维生素B6(盐酸吡哆醇)1.0mg/L、烟酸1.0mg/L、肌醇100.0mg/L、蔗糖20000mg/L、琼脂7000mg/L，25℃下调节pH值为5.5。
改良MS培养基由以下原料组成：硝酸钾80.0mg/L、抗坏血酸2.0mg/L、聚乙烯醇2000 1mg/L、硝酸钙287.0mg/L、硫酸镁738.0mg/L、硫酸钠53.0mg/L、氯化钾65.0mg/L、磷酸二氢钠19.1mg/L、盐酸硫胺素(维B1)0.2mg/L、盐酸吡哆素(维B6)0.1mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、甘氨酸3.0mg/L、蔗糖20000mg/L、硫酸锰6.6mg/L、硫酸锌2.7mg/L、碘化钾0.75mg/L、氯化钴0.025mg/L、硼酸1.5mg/L、钼酸钠0.25mg/L、EDTA-铁30mg/L、卡拉胶6.5g/L，25℃下调节pH值为5.7。
实施例1
本实施例的一种黄檗组织培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)首先分别配制诱导启动培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基并调节pH值，加热溶解后注入玻璃瓶中，在110℃高压消毒17min后凝固备用，其中，所述的诱导启动培养基为WPM培养基，所述的诱导启动培养中还加入TDZ 0.051mg/L、GA3 1.0mg/L、6-BA1.0mg/L、TBHQ 1mg/L和α-NAA0.05mg/L，增殖培养基为WPM培养基，所述的增殖培养基中还加入了TDZ 0.02mg/L、6-BA 0.5mg/L、α-NAA0.1mg/L、间苯三酚0.01mg/L，壮苗培养基为WPS培养基，所述的壮苗培养基中还加入了6-BA 0.8mg/L和α-NAA0.1mg/L，所述的生根培养基包括1/2MS培养基、蔗糖15g/L、络合铁36.7mg/L、碘化钾0.75mg/L、氯化钴0.025mg/L、钼酸钠0.25mg/L、氯化镧0.01mg/L、硝酸银0.01mg/L、椰汁5mg/L、α-NAA0.05mg/L、IAA 0.2mg/L和活性炭粉1g/L；
(2)选择3-4月未萌发优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，依次经过浓度为5％的乙醇-纳米银溶液消毒15min，浓度为2％的升汞消毒15min，用无菌水冲洗4-5次，在浓度为0.1％PVP无菌水中加入浓度为0.3％的GA3隔离无菌条件下18℃的水中培养催芽备用；
(3)将步骤(2)催芽备用的新枝条剪切成带有隐芽长度为1cm的茎段，接种在装有所述的诱导启动培养基的玻璃瓶中，依次进行6℃下低温暗培养7天，升温至21℃，日光为光源，光照强度为1500lx，每日光照8小时，湿度为55％，培养28天，在茎段隐芽处分化长成单芽苗；
(4)将所述的单芽苗剪切成带有隐芽的小段，放入装有所述的增殖培养基的玻璃瓶中，进行增殖培养至4.0倍时，得到试管芽苗；
(5)将所述的试管芽苗剪去基部愈伤组织，接种在装有所述的壮苗培养基的玻璃瓶中，进行壮苗培养30天，得到试管壮苗；
(6)将所述的试管壮苗剪去基部愈伤组织和部分叶片，保留3-5片叶片，接种在装有所述的生根培养基的玻璃瓶中，进行生根培养10-15天，得到具有完整根的小苗；
(7)将所述的具有完整根的小苗取出清洗，移栽到基质中，所述的基质为基质为草炭和珍珠岩的混合物，草炭与珍珠岩的体积比为5:3，喷施多菌灵后浇透水，控制温度25-28℃和湿度大于80％，前10天遮光70％，后逐渐见光，20天后生根成活，35-45天后，全光照。
实施例2
本实施例的一种黄檗组织培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)首先分别配制诱导启动培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基并调节pH值，加热溶解后注入玻璃瓶中，在115℃高压消毒15min后凝固备用，其中，所述的诱导启动培养基为B5培养基，所述的诱导启动培养中还加入TDZ 0.051mg/L、GA3 1.0mg/L、6-BA1.0mg/L、TBHQ 1mg/L和α-NAA0.05mg/L，增殖培养基为改良MS培养基，所述的增殖培养基中还加入了TDZ 0.02mg/L、6-BA 0.5mg/L、α-NAA0.1mg/L、间苯三酚0.01mg/L，壮苗培养基为WPS培养基，所述的壮苗培养基中还加入了6-BA 1.15mg/L和α-NAA0.3mg/L，所述的生根培养基包括1/2MS培养基、蔗糖15g/L、络合铁36.7mg/L、碘化钾0.75mg/L、氯化钴0.025mg/L、钼酸钠0.25mg/L、氯化镧0.01mg/L、硝酸银0.01mg/L、椰汁5mg/L、α-NAA0.05mg/L、IAA0.55mg/L和活性炭粉1g/L；
(2)选择3-4月未萌发优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，依次经过浓度为5％的乙醇-纳米银溶液消毒15min，浓度为2％的升汞消毒15min，用无菌水冲洗4-5次，在浓度为0.1％PVP无菌水中加入浓度为0.3％的GA3隔离无菌条件下20℃的水中培养催芽备用；
(3)将步骤(2)催芽备用的新枝条剪切成带有隐芽长度为1cm的茎段，接种在装有所述的诱导启动培养基的玻璃瓶中，依次进行8℃下低温暗培养7天，升温至23℃，日光为光源，光照强度为10750lx，每日光照10小时，湿度为60％，培养28天，在茎段隐芽处分化长成单芽苗；
(4)将所述的单芽苗剪切成带有隐芽的小段，放入装有所述的增殖培养基的玻璃瓶中，进行增殖培养至4.2倍时，得到试管芽苗；
(5)将所述的试管芽苗剪去基部愈伤组织，接种在装有所述的壮苗培养基的玻璃瓶中，进行壮苗培养33天，得到试管壮苗；
(6)将所述的试管壮苗剪去基部愈伤组织和部分叶片，保留3-5片叶片，接种在装有所述的生根培养基的玻璃瓶中，进行生根培养10-15天，得到具有完整根的小苗；
(7)将所述的具有完整根的小苗取出清洗，移栽到基质中，所述的基质为基质为草炭和珍珠岩的混合物，草炭与珍珠岩的体积比为6:4，喷施多菌灵后浇透水，控制温度25-28℃和湿度大于80％，前10天遮光70％，后逐渐见光，20天后生根成活，35-45天后，全光照。
实施例3
本实施例的一种黄檗组织培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)首先分别配制诱导启动培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基并调节pH值，加热溶解后注入玻璃瓶中，在120℃高压消毒13min后凝固备用，其中，所述的诱导启动培养基为WPM培养基，所述的诱导启动培养中还加入TDZ 0.051mg/L、GA3 1.0mg/L、6-BA1.0mg/L、TBHQ 1mg/L和α-NAA0.05mg/L，增殖培养基为改良MS培养基，所述的增殖培养基中还加入了TDZ 0.02mg/L、6-BA 0.5mg/L、α-NAA0.1mg/L、间苯三酚0.01mg/L，壮苗培养基为WPS培养基，所述的壮苗培养基中还加入了6-BA 1.5mg/L和α-NAA0.5mg/L，所述的生根培养基包括1/2MS培养基、蔗糖15g/L、络合铁36.7mg/L、碘化钾0.75mg/L、氯化钴0.025mg/L、钼酸钠0.25mg/L、氯化镧0.01mg/L、硝酸银0.01mg/L、椰汁5mg/L、α-NAA0.05mg/L、IAA 0.9mg/L和活性炭粉1g/L；
(2)选择3-4月未萌发优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，依次经过浓度为5％的乙醇-纳米银溶液消毒15min，浓度为2％的升汞消毒15min，用无菌水冲洗4-5次，在浓度为0.1％PVP无菌水中加入浓度为0.3％的GA3隔离无菌条件下22℃的水中培养催芽备用；
(3)将步骤(2)催芽备用的新枝条剪切成带有隐芽长度为1cm的茎段，接种在装有所述的诱导启动培养基的玻璃瓶中，依次进行10℃下低温暗培养7天，升温至25℃，日光为光源，光照强度为2000lx，每日光照12小时，湿度为65％，培养28天，在茎段隐芽处分化长成单芽苗；
(4)将所述的单芽苗剪切成带有隐芽的小段，放入装有所述的增殖培养基的玻璃瓶中，进行增殖培养至4.4倍时，得到试管芽苗；
(5)将所述的试管芽苗剪去基部愈伤组织，接种在装有所述的壮苗培养基的玻璃瓶中，进行壮苗培养35天，得到试管壮苗；
(6)将所述的试管壮苗剪去基部愈伤组织和部分叶片，保留3-5片叶片，接种在装有所述的生根培养基的玻璃瓶中，进行生根培养10-15天，得到具有完整根的小苗；
(7)将所述的具有完整根的小苗取出清洗，移栽到基质中，所述的基质为基质为草炭与花生壳粉的混合物，草炭与花生壳粉的体积比为1:1，喷施多菌灵后浇透水，控制温度25-28℃和湿度大于80％，前10天遮光70％，后逐渐见光，20天后生根成活，35-45天后，全光照。
对比例1
本对比例1的黄檗组织培养方法与实施例2相同，不同之处在于，步骤(2)中只采用乙醇代替乙醇-纳米银溶液消毒。
对比例2
本对比例1的黄檗组织培养方法与实施例2相同，不同之处在于，步骤(1)中的诱导启动培养基不添加TBHQ。
对比例3
本对比例1的黄檗组织培养方法与实施例2相同，不同之处在于，步骤(1)中的增殖培养基中不添加间苯三酚。
对比例4
本对比例1的黄檗组织培养方法与实施例2相同，不同之处在于，步骤(1)中的诱导启动培养基不添加TBHQ，增殖培养基中不添加间苯三酚。
试验例1
按照实施例1-3和对比例1-4的方法分别进行组织培养黄檗，分别统计经过生根培养基后获得的生根苗的百分比、平均苗高、平均每颗生根苗上新根的数量、移栽练苗成活率，结果见表1。
表1
从表中可以看出，本发明的方法进行培养的黄檗的生根苗的百分比、平均苗高、平均每颗生根苗上新根的数量、移栽练苗成活率均高于对比例1-4，这是由于纳米银离子具有促进胚胎细胞形成和生长作用，且利用破坏菌体后自然迁徙到培养基中形成二次消毒能力的特性，减少外植体褐变产生，经过启动培养基和增殖培养基进行培养，使得外植体经过预处理两次催芽获得低污染材料，同时诱导启动培养基和增殖培养基采用特定的原料制成，可以减少外植体的褐变，提高了黄檗的生根苗的百分比、平均苗高、平均每颗生根苗上新根的数量、移栽练苗成活率。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种黄檗组织培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)首先分别配制诱导启动培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基并调节pH值，加热溶解后注入玻璃瓶中，在110-120℃高压消毒13-17min后凝固备用；
(2)选择3-4月未萌发优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，依次经过乙醇-纳米银溶液消毒和升汞消毒，用无菌水冲洗4-5次，放入无菌条件下催芽备用；
(3)将步骤(2)催芽备用的新枝条剪切成带有隐芽长度为1cm的茎段，接种在装有所述的诱导启动培养基的玻璃瓶中，依次进行低温培养，升温，在光照下培养28-32天，在茎段隐芽处分化长成单芽苗；
(4)将所述的单芽苗剪切成带有隐芽的小段，放入装有所述的增殖培养基的玻璃瓶中，进行增殖培养至4.0-4.4倍时，得到试管芽苗；
(5)将所述的试管芽苗剪去基部愈伤组织，接种在装有所述的壮苗培养基的玻璃瓶中，进行壮苗培养30-35天，得到试管壮苗；
(6)将所述的试管壮苗剪去基部愈伤组织和部分叶片，保留3-5片叶片，接种在装有所述的生根培养基的玻璃瓶中，进行生根培养10-15天，得到具有完整根的小苗；
(7)将所述的具有完整根的小苗取出清洗，移栽到基质中，喷施多菌灵后浇透水，控制温度和湿度，20天后生根成活。
2.根据权利要求1所述的黄檗组织培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述的诱导启动培养基为WPM培养基或B5培养基，所述的诱导启动培养中还加入TDZ 0.051mg/L、GA31.0mg/L、6-BA 1.0mg/L、TBHQ 1mg/L和α-NAA0.05mg/L。
3.根据权利要求1所述的黄檗组织培养方法，其特征在于，步骤(1)中增殖培养基为WPM培养基或改良MS培养基，所述的增殖培养基中还加入了TDZ 0.02mg/L、6-BA 0.5mg/L、α-NAA0.1mg/L、间苯三酚0.01mg/L。
4.根据权利要求1所述的黄檗组织培养方法，其特征在于，步骤(1)中壮苗培养基为WPS培养基，所述的壮苗培养基中还加入了6-BA 0.8-1.5mg/L和α-NAA 0.1-0.5mg/L。
5.根据权利要求1所述的黄檗组织培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述的生根培养基包括1/2MS培养基、蔗糖15g/L、微量元素37.745mg/L、有机物5mg/L、α-NAA0.05mg/L、IAA0.2-0.9mg/L和活性炭粉1g/L。
6.根据权利要求1所述的黄檗组织培养方法，其特征在于，步骤(2)中用浓度为5％的乙醇-纳米银溶液进行消毒15min，用浓度为0.2％的升汞消毒5min，优选的，无菌条件催芽为在浓度为0.1％PVP水中加入浓度为0.3％的GA3在18-22℃的水中培养。
7.根据权利要求1所述的黄檗组织培养方法，其特征在于，步骤(3)中低温培养为6-10℃下低温暗培养7天，升温为升至21-25℃，优选的，低温培养为8℃下低温暗培养7天，升温为温度升至23℃。
8.根据权利要求1或7所述的黄檗组织培养方法，其特征在于，步骤(3)中光照强度为1500-20000lx，每日光照8-12小时，湿度为55-65％，优选的，每日光照10小时，湿度为60％。
9.根据权利要求1所述的黄檗组织培养方法，其特征在于，步骤(7)中基质为草炭和珍珠岩的混合物或者草炭和花生壳粉的混合物，优选的，草炭与珍珠岩的体积比为5-7:3-5，草炭与花生壳粉的体积比为1:0.5-1.5，更优选的，草炭与珍珠岩的体积比为6:4，草炭与花生壳粉的体积比为1:1。
10.根据权利要求1或9所述的黄檗组织培养方法，其特征在于，步骤(7)中温度为25-28℃，湿度大于80％，前10天遮光70％，20天后生根成活，35-45天后全光照。
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