CN110396555B - 箭筈豌豆ilp分子标记引物及在品种鉴定中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及箭筈豌豆ILP分子标记引物及在品种鉴定中的应用，本发明利用41对分子标记引物，可以对30种箭筈豌豆品种进行鉴定，鉴定品种多，并且具有准确、高效、快速、成本低以及操作方便等优势。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及箭管豌豆ILP分子标记引物及在品种鉴定中的应用。
背景技术
箭筈豌豆(Vicia sativa L.)是一种优质的一年生、自花授粉、二倍体豆科牧草，具有营养 成分高、蛋白质含量丰富、抗逆性强和种植区域广等特点，可用作绿肥、牧草和青贮饲料等， 在我国的农业生态系统中具有十分重要的地位。随着畜牧业的快速发展，箭管豌豆新品种的 选育和审定工作也进入一个崭新的阶段，而新品种的审定和品种真实性的鉴定方法还相对滞 后。目前，主要从形态学角度通过田间性状差异进行鉴别。但该方法受环境因子和主观因素 的影响太大，且周期过长，费时费力。另外，物种的遗传多样性及品种差异大部分表现在分 子水平上；相较于表型多态性，分子水平的多态性则具有更直观的差异性和更高的丰度。因 此，迫切需要在分子水平上开发一套行之有效且快速、精确、廉价的箭管豌豆品种鉴定技术。
近年来，随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术被越来越多的应用于植物品种 鉴定中，包含AFLP、SSR、SNP等在内的数十种。同外显子相比，内含子具有更丰富的多态 性可用于遗传标记，内含子长度多态性(ILP)标记是其中较易被鉴定的标记类型。相较于其 它DNA分子标记，ILP分子标记具有数量丰富、特异性、共显性、操作简单等优点，目前已 广泛应用于基因指纹图谱构建、遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基 因库构建等方面，在牧草选育以及品种鉴定过程中扮演着十分重要的角色。
作为一种具有多种优良性质的分子标记，迄今为止，ILP标记已在包括水稻、玉米、小麦 等粮食作物中进行了开发和应用。而箭管豌豆由于全基因组数据的缺乏，相关研究尚未见报 道。随着高通量转录组测序的发展，在全转录组水平开发箭管豌豆ILP分子标记并研究其在 品种鉴定中的应用，对箭筈豌豆品种鉴定以及分子标记辅助育种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种箭管豌豆ILP分子标记引物。
本发明的目的之二在于提供上述箭管豌豆ILP分子标记引物在箭管豌豆品种鉴定中的应 用。
本发明目的之三在于提供一种鉴定箭管豌豆的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
箭筈豌豆ILP分子标记引物，所述分子标记引物包括如下41对，其正向引物和反向引物 的核苷酸序列具体如下：
(1)VsILP004：正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2；
(2)VsILP012：正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4；
(3)VsILP020：正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6；
(4)VsILP021：正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8；
(5)VsILP032：正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10；
(6)VsILP047：正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12；
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(9)VsILP102：正向引物序列为SEQ ID NO.17，反向引物序列为SEQ ID NO.18；
(10)VsILP103：正向引物序列为SEQ ID NO.19，反向引物序列为SEQ ID NO.20；
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(12)VsILP110：正向引物序列为SEQ ID NO.23，反向引物序列为SEQ ID NO.24；
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(14)VsILP118：正向引物序列为SEQ ID NO.27，反向引物序列为SEQ ID NO.28；
(15)VsILP136：正向引物序列为SEQ ID NO.29，反向引物序列为SEQ ID NO.30；
(16)VsILP146：正向引物序列为SEQ ID NO.31，反向引物序列为SEQ ID NO.32；
(17)VsILP147：正向引物序列为SEQ ID NO.33，反向引物序列为SEQ ID NO.34；
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(29)VsILP199：正向引物序列为SEQ ID NO.57，反向引物序列为SEQ ID NO.58；
(30)VsILP211：正向引物序列为SEQ ID NO.59，反向引物序列为SEQ ID NO.60；
(31)VsILP224：正向引物序列为SEQ ID NO.61，反向引物序列为SEQ ID NO.62；
(32)VsILP226：正向引物序列为SEQ ID NO.63，反向引物序列为SEQ ID NO.64；
(33)VsILP244：正向引物序列为SEQ ID NO.65，反向引物序列为SEQ ID NO.66；
(34)VsILP246：正向引物序列为SEQ ID NO.67，反向引物序列为SEQ ID NO.68；
(35)VsILP247：正向引物序列为SEQ ID NO.69，反向引物序列为SEQ ID NO.70；
(36)VsILP253：正向引物序列为SEQ ID NO.71，反向引物序列为SEQ ID NO.72。
(37)：VsILP262正向引物序列为SEQ ID NO.73，反向引物序列为SEQ ID NO.74；
(38)VsILP273：正向引物序列为SEQ ID NO.75，反向引物序列为SEQ ID NO.76；
(39)VsILP278：正向引物序列为SEQ ID NO.77，反向引物序列为SEQ ID NO.78；
(40)VsILP279：正向引物序列为SEQ ID NO.79，反向引物序列为SEQ ID NO.80；
(41)VsILP297：正向引物序列为SEQ ID NO.81，反向引物序列为SEQ ID NO.82。
箭筈豌豆ILP分子标记引物在紫花苜蓿品种鉴定中的应用，其中所述的箭筈豌豆品种包 括表1所列品种：
表1
一种鉴定箭管豌豆的试剂盒，包含所述的箭筈豌豆ILP分子标记引物。
本发明的有益效果是：本发明的检测方法可利用较少的引物组合在较短时间(约为4h， 不包括DNA提取过程所消耗的时间)完成对供试箭管豌豆品种与已知箭管豌豆品种的比对 和鉴定，具有准确、高效、快速、成本低以及操作方便等优势，本申请具有较高的灵敏度和 精确度。
附图说明
图1是本发明VsILP分子标记开发流程图；
图2是引物VsILP147对箭管豌豆的扩增结果图；
图3是引物VsILP189对箭筈豌豆的扩增结果图；
图4是引物VsILP244对箭管豌豆的扩增结果图。
具体实施方式
下面更详细地描述本发明的具体实施例。应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应 被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且 能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成 “包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书 的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界 定者为准。
实施例：
1、鉴定材料DNA提取
参照SDS法，具体操作步骤如下：
1)取所采集的新鲜叶片5g放入研钵中研磨成粉末，加入600μl DNA buffer(30％SDS 裂解液)至研钵，混合均匀。
2)将匀液倒入离心管中，60℃水浴10min，过程中每隔3-4min摇匀一次。
3)取出后冷却至室温，加入195μl的5M KAc溶液，混匀后在冰上放置5min。
4)加入氯仿异戊醇(24∶1)600μl(通风橱中打开通风系统操作)，混合均匀。
5)放至室温，12000r/min离心机中离心10min，吸取上清液360μl至干净离心管中。
6)加入240μl异丙醇和36μl 3M NaAc溶液至上清液中，混合均匀，室温下静置10min。
7)室温条件下，12000r/min的离心机中离心10min后小心取出，用10μl移液枪将残液 吸出。
8)加入75％乙醇溶液500μl，将沉淀弹起。
9)室温条件下，12000r/min离心5min，用10μl移液枪将残液吸出。
10)重复步骤8和步骤9。
11)最大转速离心30-40s后，在通风橱中放置30min直至将残留的乙醇挥发彻底，之后 加入20-50μl的灭菌ddH2O溶解充分。
12)在震荡机上轻微震荡后瞬时离心。
13)2.5μl移液枪吸取2μl DNA母液，点样至含有核酸染料的1％琼脂糖凝胶的上样孔中， 130V电压条件下电泳5min，然后在紫外凝胶成像仪下观察DNA条带，检验样品DNA质量。
14)以ddH2O为对照，在NanoDrop1000上测定DNA浓度，导出结果。
15)将DNA母液浓度稀释到50ng/μl，于-20℃冰箱中保存备用。
2.鉴定材料DNA的ILP-PCR扩增
箭筈豌豆转录组数据来自NCBI SAR数据库(SRX2400610)(Dong et al.，2017b)。从 http：//www.arabidopsis.org/下载拟南芥基因组数据信息，在 https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htm下载大豆基因组相关数据，从 http：//www.medicagogenome.org/下载蒺藜苜蓿相关信息。利用Perl脚本将箭筈豌豆CDS序列 与拟南芥、蒺藜苜蓿、大豆基因组序列进行BLASTn比对以预测内含子位置，为保证开发的 ILP标记的质量和可用性，我们只保留所预测的内含子长度≤400bp的序列信息。提取内含子位置的前后各100bp序列，使用Array Designer 4.2软件 (http：//www.softpedia.com/get/Science-CAD/Array-Designer，shtml)设计引物。
所设计出来的41对引物如表2所示。
表2 41对引物信息
利用本方法给出的41对引物对待鉴定材料DNA进行PCR扩增，反应体系及程序如下：
1)反应体系：10μL体系包括鉴定材料DNA模板50ng，正、反向引物各10ng，5μL 2×power Taq MasterMix(百泰克)，剩余体积用超纯水补足；
2)反应程序：使用降落PCR，首先94℃变性30s，58-61℃退火30s，72℃延伸30s，共5个循环；接着94℃变性30s，55-58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸7min， 4℃保存。
3.变性聚丙烯酰氨凝胶电泳与银染检测
以使用DYCZ-28C双板夹芯式垂直电泳槽为例，操作步骤如下：
1)制胶，6％变性聚丙烯酰胺凝胶(4板胶)配制方法如下：
6％变性聚丙烯酰胺母液200mL，10％过硫酸铵(APS)2000μl，TEMED 150μl。
6％变性聚丙烯酰胺母液(1L)配制：Urea 120g、10×TBE 100mL、40％Acr-Bis150mL， 最后加入蒸馏水定容至1L，避光保存。
10×TBE(1L)配制：Tris 108g、EDTA 7.44g、硼酸55g，最后加蒸馏水定容至1L，其中 100mL用于配置母液，剩余稀释为1×TBE作为电解液使用。40％Acr-Bis(150mL)配制：Acr 57g、Bis 3g，最后加蒸馏水定容至150mL。10％APS(50mL)配制：APS 5g，蒸馏水定容至50mL，4℃保存。
2)倒胶，将制好的胶迅速沿着胶板的一侧倒入，以防止胶凝固，梳子预先放好并固定， 排除产生的气泡。
3)将胶板静置35min，使其充分凝固。然后拔梳子，转移至电泳槽，使用1×TBE作为电泳液。
4)点样，将PCR产物根据一定顺序依次点至泳道里，根据产物大小点合适的Marker。
5)接通电源，200V 90min电泳。
6)电泳结束后，关掉电源，取出胶板，从胶板上分离胶，蒸馏水洗10s，洗去胶上的电 解液。
7)银染，将胶放入适量银染液中，置于震荡仪上，银染10min。银染液配制(4板胶用量)： 0.8g AgNO3加入1L蒸馏水。
8)倒掉银染液，加入蒸馏水，震荡10s，洗去胶上残留的银染液。
9)显影，倒掉蒸馏水，加入显影液，震荡至胶上出现条带。显影液配制(4板胶用量)： 15g NaOH加入1000mL蒸馏水和4mL甲醛。
10)拍照。
其中，例如引物VsILP147对箭管豌豆的扩增结果见图2，引物VsILP189对箭管豌豆的 扩增结果见图3，引物VsILP244对箭管豌豆的扩增结果见图4。
11)将各鉴定品种同一位点扩增片段的带型和迁移位置进行比较，扩增带型以0、1表示， 在相同迁移位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，构建“1”、“0”矩阵。各引物对30种品种的 区分信息见表3(表中横向1-30表示的是品种编号，纵向1-41表示的是各个引物名称的编号， A代表的是等位基因数)。
表3 30个箭管豌豆品种基于41个ILP分子标记构建的“0”、“1”矩阵
对于表3中的等位基因，以VsILP147为例，对应的显示是有7个等位基因，但其实都是扩增的VsILP147对应的一个基因，之所以会出现多个等位基因的情况，是因为箭筈豌豆 是二倍体植物，另外，某个基因可能有多个拷贝(即一个基因可能在基因组中出现多次，且 之间的内含子有可能有差异)，所以有可能出现多条条带(等位基因)的情况。
在表3中可以看出每个引物扩增结果的情况，41对箭管豌豆ILP分子标记在30个供试 箭筈豌豆品种中都能够扩增出多态性条带，且扩增结果稳定，具有重复性。其中，41对ILP 分子标记在30个箭筈豌豆品种中共扩增出166个等位基因条带，平均每个位点为4.0个等位 基因条带。41对ILP分子标记的多态性指数(PIC)范围为0.06(VsILP172)到0.81(VsILP151)， 平均值为0.49。预期杂合度(He)范围为0.06(VsILP172)到0.83(VsILP151)，平均值为0.54。
12)对每对引物的鉴定结果进行统计分析，不同鉴定品种间差异位点数≥则判定两品种为 不同品种。
具体的品种鉴定结果见表4(品种编号对应品种信息见表1)。
表4 41个ILP分子标记区分品种信息
以VsILP211为例对表4进行说明，其对30个箭管豌豆品种进行PCR扩增，根据每个品 种扩增出的条带差异，可以将30个品种分为8个类群情况。其中，品种1、10、24、28、30 归属于类群1，是因为他们的扩增条带一样；品种2、4、7、8、9、11、13、14、16、19、20、 21、23、26、27的扩增条带一样，归属于类群2，但他们的条带类型和类群1的条带类型又 有差别。其后同理。因此，如果仅仅利用VsILP211引物的话，仅能将30个品种中的部分区 分开。而如果要完全区分30个品种的话，就需要利用不同引物的组合。例如，单一VsILP211 无法区分品种1和10，但是如果再结合VsILP020的结果的话，就可以把品种1和10区分开， 且上述结果也可证明本申请具有较高的灵敏度和精确度。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明 书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理 包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (4)
1.箭筈豌豆ILP分子标记引物，其特征在于，所述分子标记引物为如下41对，其正向引物和反向引物的核苷酸序列具体如下：
(1)VsILP004：正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2；
(2)VsILP012：正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4；
(3)VsILP020：正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6；
(4)VsILP021：正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8；
(5)VsILP032：正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10；
(6)VsILP047：正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12；
(7)VsILP079：正向引物序列为SEQ ID NO.13，反向引物序列为SEQ ID NO.14；
(8)VsILP100：正向引物序列为SEQ ID NO.15，反向引物序列为SEQ ID NO.16；
(9)VsILP102：正向引物序列为SEQ ID NO.17，反向引物序列为SEQ ID NO.18；
(10)VsILP103：正向引物序列为SEQ ID NO.19，反向引物序列为SEQ ID NO.20；
(11)VsILP108：正向引物序列为SEQ ID NO.21，反向引物序列为SEQ ID NO.22；
(12)VsILP110：正向引物序列为SEQ ID NO.23，反向引物序列为SEQ ID NO.24；
(13)VsILP117：正向引物序列为SEQ ID NO.25，反向引物序列为SEQ ID NO.26；
(14)VsILP118：正向引物序列为SEQ ID NO.27，反向引物序列为SEQ ID NO.28；
(15)VsILP136：正向引物序列为SEQ ID NO.29，反向引物序列为SEQ ID NO.30；
(16)VsILP146：正向引物序列为SEQ ID NO.31，反向引物序列为SEQ ID NO.32；
(17)VsILP147：正向引物序列为SEQ ID NO.33，反向引物序列为SEQ ID NO.34；
(18)VsILP151：正向引物序列为SEQ ID NO.35，反向引物序列为SEQ ID NO.36；
(19)VsILP157：正向引物序列为SEQ ID NO.37，反向引物序列为SEQ ID NO.38；
(20)VsILP158：正向引物序列为SEQ ID NO.39，反向引物序列为SEQ ID NO.40；
(21)VsILP160：正向引物序列为SEQ ID NO.41，反向引物序列为SEQ ID NO.42；
(22)VsILP172：正向引物序列为SEQ ID NO.43，反向引物序列为SEQ ID NO.44；
(23)VsILP174：正向引物序列为SEQ ID NO.45，反向引物序列为SEQ ID NO.46；
(24)VsILP176：正向引物序列为SEQ ID NO.47，反向引物序列为SEQ ID NO.48；
(25)VsILP180：正向引物序列为SEQ ID NO.49，反向引物序列为SEQ ID NO.50；
(26)VsILP181：正向引物序列为SEQ ID NO.51，反向引物序列为SEQ ID NO.52；
(27)VsILP189：正向引物序列为SEQ ID NO.53，反向引物序列为SEQ ID NO.54；
(28)VsILP196：正向引物序列为SEQ ID NO.55，反向引物序列为SEQ ID NO.56；
(29)VsILP199：正向引物序列为SEQ ID NO.57，反向引物序列为SEQ ID NO.58；
(30)VsILP211：正向引物序列为SEQ ID NO.59，反向引物序列为SEQ ID NO.60；
(31)VsILP224：正向引物序列为SEQ ID NO.61，反向引物序列为SEQ ID NO.62；
(32)VsILP226：正向引物序列为SEQ ID NO.63，反向引物序列为SEQ ID NO.64；
(33)VsILP244：正向引物序列为SEQ ID NO.65，反向引物序列为SEQ ID NO.66；
(34)VsILP246：正向引物序列为SEQ ID NO.67，反向引物序列为SEQ ID NO.68；
(35)VsILP247：正向引物序列为SEQ ID NO.69，反向引物序列为SEQ ID NO.70；
(36)VsILP253：正向引物序列为SEQ ID NO.71，反向引物序列为SEQ ID NO.72。
(37)：VsILP262正向引物序列为SEQ ID NO.73，反向引物序列为SEQ ID NO.74；
(38)VsILP273：正向引物序列为SEQ ID NO.75，反向引物序列为SEQ ID NO.76；
(39)VsILP278：正向引物序列为SEQ ID NO.77，反向引物序列为SEQ ID NO.78；
(40)VsILP279：正向引物序列为SEQ ID NO.79，反向引物序列为SEQ ID NO.80；
(41)VsILP297：正向引物序列为SEQ ID NO.81，反向引物序列为SEQ ID NO.82。
2.如权利要求1所述的箭筈豌豆ILP分子标记引物在箭筈豌豆品种鉴定中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其中所述的箭筈豌豆品种如下：
4.一种鉴定箭筈豌豆的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的箭筈豌豆ILP分子标记引物。
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