CN110396511B - 玉米赤霉烯酮水解酶的制备方法 - Google Patents

玉米赤霉烯酮水解酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及重组蛋白领域，特别是关于一种玉米赤霉烯酮水解酶的制备方法。本发明提供一种玉米赤霉烯酮水解酶的制备方法，包括将携带一编码玉米赤霉烯酮水解酶的基因的酵母菌细胞培养于一培养基中以表达该玉米赤霉烯酮水解酶，其中该培养基含有重量比20％至25％的糖蜜。该方法提供了以低成本有效率地制备玉米赤霉烯酮水解酶的新策略。

Description

玉米赤霉烯酮水解酶的制备方法
技术领域
本发明涉及重组蛋白领域，特别是关于一种玉米赤霉烯酮水解酶的制备方法。
背景技术
玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)生成于例如粉红镰刀菌(F.roseum)的镰刀菌属(Fusarium)霉菌所感染的谷物内，其为具有动情素(estrogen)活性的非固醇类霉菌毒素。常见遭污染的谷物包括玉米、大米、大麦、及小麦。单胃动物对玉米赤霉烯酮最敏感，其次是瘤胃动物，至于家禽受到的影响最小。在单胃动物中以猪受到的危害最为严重。先前关于猪只育种的研究显示，玉米赤霉烯酮可能导致死胎、新生仔猪死亡、仔猪木乃伊化、流产、及不规则的假性发情。受影响母猪的症状包括阴道脱垂、子宫与子宫角肿大、及卵巢萎缩，在严重情况下甚至会直肠脱垂。此种毒素对雄性猪只的外观病变没有显著影响，但是有研究证实雄性仔猪会受到影响，并且出现睾丸萎缩、阴茎包皮发炎、乳腺肿胀、及性欲降低。前述玉米赤霉烯酮对猪只繁殖造成的严重影响可以该毒素的物种特异性代谢来解释。玉米赤霉烯酮在猪的肝脏主要被代谢为α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol，α-Zol)，其动情素活性高于在家禽、牛、及羊中发现的α-玉米赤霉醇(α-zearalanol，α-Zal)和β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol，β-Zol)等其他玉米赤霉烯酮衍生物。
目前已有数种减少谷物遭受玉米赤霉烯酮污染的方法被采用，例如稀释受污染的饲料、使用抑制霉菌生长的杀真菌剂、以铝硅酸盐吸附毒素、通过热挤压使毒素降解、微生物转化、以及生产可降解玉米赤霉烯酮的基因改造作物。种植基因改造作物可能是最有潜力的处理方法，因为此法能彻底预防植株在田间的感染，但是这类作物带来的影响将难以估计。
Takahashi-Ando等人在2002年发现土壤真菌中的粉红黏帚霉(Clonostachysrosea)IFO 7063有效降低了玉米赤霉烯酮水平，并且分离出一编码玉米赤霉烯酮水解酵素的基因，将其命名为玉米赤霉烯酮水解酶(zearalenone hydrolase，ZHD101)。据推测，该酵素的作用是经由分解玉米赤霉烯酮的内酯环(lactone ring)，而使羧基及羟基裸露，并且通过羧化反应促进次级产物形成。该次级产物已证实对人类乳癌细胞株(MCF-7)没有动情素的效用。
Takahashi-Ando等人(2004)曾利用大肠杆菌(Escherichia coli)建构ZHD101基因的原核细胞蛋白表达系统。然而，使用细菌作为宿主以生产用于食物或动物饲料解毒的蛋白质有生物安全上的疑虑。此外，当以微生物生产玉米赤霉烯酮水解酶的过程因工业用途而放大时，尚需要考虑其他问题，例如发酵时间的限制以及培养基成本。因此，探索制备玉米赤霉烯酮水解酶的替代方法，实有其必要。
发明内容
缘此，本发明的一目的在提供一种玉米赤霉烯酮水解酶的制备方法，包含如下步骤：将携带一编码玉米赤霉烯酮水解酶的基因的一酵母菌细胞培养于一培养基中以表达该玉米赤霉烯酮水解酶的蛋白质，其中该培养基含有重量比20％至25％的糖蜜(molasses)。
在本发明的一实施例中，该酵母菌细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；该编码玉米赤霉烯酮水解酶的基因被插入一诱导型表达载体(inducible expressionvector)；该玉米赤霉烯酮水解酶的表达是通过在该培养基中添加甲醇而予以诱导，且该培养基中的甲醇浓度是0.25％至0.75％。
在本发明的另一实施例中，该酵母菌细胞是在28℃至30℃培养24至72小时，并且以100至150rpm震荡培养。
在本发明的另一实施例中，该培养基进一步包含尿素(urea)、磷酸二氢铵(ammonium dihydrogen phosphate)、硫胺(thiamine)、或其任何组合。
在本发明的又一实施例中，所述方法进一步包含如下步骤：在该培养步骤后，从该酵母菌细胞或该培养基中分离出该玉米赤霉烯酮水解酶。例如，通过裂解该酵母菌细胞以及收集由此获得的一细胞裂解物的一上清液，而分离得该玉米赤霉烯酮水解酶。
相比制备重组玉米赤霉烯酮水解酶的常规方法，本发明的方法是利用含糖蜜培养基，在三天内诱导酵母菌大量生产玉米赤霉烯酮水解酶。因此，本发明提供了以低成本有效率地制备玉米赤霉烯酮水解酶的新策略。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明的发明特点及应用，而非以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1是西方墨点影像图，显示在添加或不添加甲醇的BMMY培养基中，一巴斯德毕赤酵母转型株经培养指定时间后，其细胞内及细胞外玉米赤霉烯酮水解酶(ZHD101)的表达量；
图2是西方墨点影像图，显示在添加或不添加甲醇的含糖蜜培养基中，该巴斯德毕赤酵母转型株经培养指定时间后，其细胞内及细胞外ZHD101蛋白的表达量；
图3A显示在巴斯德毕赤酵母野生株或转型株的培养物中，所表达的重组ZHD101蛋白表现出对玉米赤霉烯酮的水解活性图；图中a及b代表于指定时间收集得的巴斯德毕赤酵母野生株及转型株的培养物在玉米赤霉烯酮水平有显著差异；
图3B显示在巴斯德毕赤酵母野生株或转型株的培养物中，所表达的重组ZHD101蛋白表现出对α-玉米赤霉烯醇的水解活性图；图中a及b代表于指定时间收集得的巴斯德毕赤酵母野生株及转型株的培养物在α-玉米赤霉烯醇水平有显著差异。
具体实施方式
定义
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
本文中所述「酵母菌细胞」是指通过重组DNA技术被设计为表达外源蛋白质的任何品种酵母菌细胞。
本发明提供了一种玉米赤霉烯酮水解酶的制备方法，包含如下步骤：在一含糖蜜培养基中培养携带一编码玉米赤霉烯酮水解酶基因的酵母菌细胞，以促进该玉米赤霉烯酮水解酶的蛋白质表达。以下详述本发明的细节。
材料与方法
糖蜜
糖蜜是购自当地供货商。在一实施例中，糖蜜含有依重量计30％蔗糖、15％葡萄糖、及15％果糖。
制备玉米赤霉烯酮水解酶表达载体
为了制备用于酵母菌细胞转形(transformation)的玉米赤霉烯酮水解酶表达载体，将编码玉米赤霉烯酮水解酶(ZHD101)并具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的基因转殖(clone)至一含有甲醇诱导型启动子(promoter)的表达载体，例如pPICZα载体(ThermoFisher Scientific)。为了便利蛋白质纯化，该基因可进一步包含一编码数个组氨酸的短DNA序列，其被称为His标签(His tag)。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺胶体电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)
SDS-PAGE是依如下方法进行。简言之，浇铸15％分离胶体(2.5ml 1M三氢甲基氨基甲烷(Tris；pH 8.8)，2.3ml去离子水，5ml 30％丙烯酰胺预混液(acrylamide mix)，0.1ml10％SDS，0.1ml 10％过硫酸铵(ammonium persulfate，APS)，及0.05ml四甲基乙二胺(TEMED))以及4％焦集胶体(0.63ml 1M Tris(pH 6.8)，3.4ml去离子水，0.83ml 30％丙烯酰胺预混液，0.05ml 10％SDS，0.05ml 10％APS，及0.005ml TEMED)，可制备得一用于电泳的胶体。并且，将来自酵母菌细胞的蛋白质样品(称为细胞内蛋白质样品)或来自酵母菌培养基的蛋白质样品(称为细胞外蛋白质样品)与SDS上样缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 6.8)，200mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，4％SDS，0.2％溴酚蓝(bromophenol blue)，20％甘油，及10％(v/v)2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol))等体积混合，其后在100℃加热该混合物10分钟。电泳是在70V下进行焦集，及在110V下进行分离。
西方墨点法(Western blotting)
依如下所述进行西方墨点法以验证玉米赤霉烯酮水解酶在细胞内及细胞外产生。将带有经分离的细胞内或细胞外蛋白质样品的SDS-PAGE胶体及一聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜(ImmobilonTM-P Transfer Membrane；Millipore)夹在海绵和滤纸之间并且夹紧以形成夹层，然后将其浸入转印缓冲液(200mM甘氨酸，20％甲醇，25mM Tris-HCl，pH 8.3)。该蛋白质样品以1.2mA/cm2转印至PVDF膜45分钟。其后，该PVDF膜在添加5％脱脂奶的含Tween-20磷酸缓冲盐溶液(简称PBST；137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，4.3mM磷酸氢钠，1.4mM磷酸二氢钾，及0.5％Tween-20，pH 7.4)中温育至少一小时，以避免非特异性结合。经PBST清洗三次后，该膜与小鼠抗His标签抗体(2633；Cell SignalingTechnology)于PBST中依抗体稀释倍数1∶1000在4℃温育过夜。经PBST清洗三次后，该膜与连结山葵过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)二级抗体(GTX213111-01；GeneTex)于PBST中依抗体稀释倍数1∶10000在室温下震荡温育1小时，再以PBST清洗三次。进行检测时，将增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂(PerkinElmer)添加至该膜以产生发光信号，其显影于X射线胶片。
酵素活性分析
首先，将表达玉米赤霉烯酮水解酶的酵母菌转形株细胞的250ml培养物与0.5％甲醇、1.5μg/ml玉米赤霉烯酮(Z2125；Sigma)、及1.5μg/mlα-玉米赤霉烯醇(Z0166；Sigma)在30℃温育96小时以进行水解反应，再将150μl培养基的上清液与100％甲醇等体积混合。所得混合物取25μl用0.22μm尼龙膜(Chromtech)过滤后，对水解产物进行高效液相层析(high-performance liquid chromatography，HPLC)-荧光分析(激发波长为271nm，放射波长为452nm)。HPLC的流动相是乙腈、甲醇、及水(体积比为10∶55∶35)的混合物，其含有15mM乙酸铵。用于分析的管柱是反相C18管柱(LiChroCART 250-4，RP-C18；Merck，德国)。
实施例1
小规模生产玉米赤霉烯酮水解酶
将经过玉米赤霉烯酮水解酶(ZHD101)表达载体转形的巴斯德毕赤酵母GS115菌株(ATCC 20864)接种至约3至5ml新鲜酵母萃取物，蛋白胨，葡萄糖(yeast extract-peptone-dextrose，YPD)培养基中，并在28℃至30℃及150rpm震荡培养24小时。然后，将300μl该酵母菌培养物接种至250ml缓冲最小甘油酵母(buffered minimal glycerol yeast，BMGY)培养基(1％酵母萃取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，1.34％酵母氮源(yeastnitrogen base，YNB)，4×10-5M生物素(biotin)，及1％甘油)，以获得一第一培养物，其在28℃至30℃及100至150rpm震荡隔夜培养。当该第一培养物于600nm的吸光值(OD600)达到大约2，在4℃将其以5000xg离心5分钟，收集所得细胞沉淀并重新悬浮于一含糖蜜培养基(表1)，以获得一第二培养物。作为对比，依前述方法制备细胞沉淀，并将其重新悬浮于缓冲最小甲醇酵母(buffered minimal methanol yeast，BMMY)培养基(表2)，以配制得另一培养物。将该第二培养物稀释至OD600值约为1，再于28℃至30℃及100至150rpm震荡培养72至96小时，并且任选地每隔24小时补充甲醇以维持最终甲醇浓度为0.25至0.75％(v/v)，较佳为0.5％(v/v)。
表1
Figure BSA0000182046870000061
表2
Figure BSA0000182046870000062
为了检视细胞内及细胞外ZHD101蛋白的产生，每隔24小时收集5ml该第二培养物，并以13,000xg离心1分钟，以便分离酵母菌细胞及酵母菌培养基。为了萃取细胞内蛋白质，通过八次超声波振荡(30秒)-冰上冷却(30秒)的循环使酵母菌细胞在100μl破菌缓冲液(50mM磷酸钠(pH 7.4)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，1mM苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)，及5％甘油)中裂解，然后以13,000xg离心该细胞裂解物10分钟以收集上清液，此即细胞内蛋白质样品。为了制备细胞外蛋白质样品，该酵母菌培养基用Amicon Ultra 15mL离心过滤器(EMD Millipore)浓缩。该细胞内及细胞外蛋白质样品皆以Bradford蛋白质分析法(Bio-Rad)定量，并且进行SDS-PAGE及西方墨点法以分析ZHD101蛋白的表达量。
图1是西方墨点影像，其显示在添加或不添加甲醇的BMMY培养基中，所述巴斯德毕赤酵母转型株经培养后的细胞内及细胞外ZHD101蛋白表达量。依据图1，未添加甲醇的BMMY培养基中的酵母菌仅在培养96小时后产生少量的细胞内ZHD101蛋白，而且无法产生可检测的细胞外ZHD101蛋白。相对地，甲醇的添加则诱导较高量的细胞内及细胞外ZHD101蛋白表达。细胞内ZHD101蛋白在甲醇诱导培养96小时后可检测到，而细胞外ZHD101蛋白则在培养72小时后便可检测到。此结果说明只有添加甲醇的BMMY培养基适合使巴斯德毕赤酵母转型株以有效率的方式生产ZHD101蛋白。
图2是西方墨点影像，其显示在添加或不添加甲醇的含糖蜜培养基中，所述巴斯德毕赤酵母转型株经培养后的细胞内及细胞外ZHD101蛋白表达量。依据图2，未添加甲醇的含糖蜜培养基中的酵母菌在少于72小时的培养后即产生可检测量的细胞内及细胞外ZHD101蛋白。在含糖蜜培养基中加入甲醇则导致细胞内及细胞外ZHD101蛋白分别在培养24小时及72小时后有高产量。此结果说明与BMMY培养基相比，含糖蜜培养基足以使巴斯德毕赤酵母转型株以有效率的方式生产ZHD101蛋白，并且添加甲醇可进一步减少生产ZHD101蛋白所需的培养时间。
为评估重组ZHD101蛋白的酵素活性，在表达ZHD101蛋白的巴斯德毕赤酵母转型株的含甲醇BMMY培养物中加入玉米赤霉烯酮及α-玉米赤霉烯醇，并监测该二者的分解状况。同时，依类似方式制备一未经转形的巴斯德毕赤酵母(标示为野生株)的培养物以作为对照组。如图3A所示，在水解反应12小时后，巴斯德毕赤酵母野生株及转型株的培养物的玉米赤霉烯酮水平皆显著降低，并且在巴斯德毕赤酵母转型株的培养物可观察到更为显著的降低，说明表达的重组ZHD101蛋白具备对玉米赤霉烯酮的水解活性。如图3B所示，在水解反应的12小时内，该二种培养物中的α-玉米赤霉烯醇水平亦降低，说明重组ZHD101蛋白亦具有对α-玉米赤霉烯醇的水解活性。
实施例2
工业规模生产玉米赤霉烯酮水解酶
将经过ZHD101表达载体转形的巴斯德毕赤酵母GS115菌株接种至约3至5ml新鲜YPD培养基中，并在28℃至30℃及150rpm震荡培养24小时。然后，将300μl该酵母菌培养物接种至250ml BMGY培养基，以获得一第一培养物，其在28℃至30℃及100至150rpm震荡隔夜培养。为了扩大ZHD101蛋白的产量，大量制备该第一培养物。当该些第一培养物的OD600值达到大约2，在4℃将其以5000xg离心5分钟，收集所得细胞沉淀并重新悬浮于含糖蜜培养基(表1)以获得一第二培养物。该第二培养物(约6L)被稀释至OD600值约为1，并添加0.25至0.75％(v/v)、较佳为0.5％(v/v)甲醇及一消泡剂后，在28°至30℃及150rpm持续72小时震荡培养于一10L发酵槽中，同时保持溶氧量为20％。该发酵过程中每隔24小时收集酵母菌培养物以测量OD值，并且产出酵母菌生长曲线。培养于含糖蜜培养基中的巴斯德毕赤酵母转形株被发现能在工业发酵过程中有效率地生产具有玉米赤霉烯酮降解能力的ZHD101蛋白。
为了自酵母菌细胞或酵母菌培养基中纯化细胞内或细胞外ZHD101蛋白，可利用常规生物化学技术，例如金属螯合亲和层析(metal chelate affinity chromatography)及基于分子量的蛋白质分划(fractionation)技术。
综上所述，本发明的方法是利用含糖蜜培养基，在三天内诱导酵母菌大量生产玉米赤霉烯酮水解酶。因此，本发明提供了以低成本有效率地制备玉米赤霉烯酮水解酶的新策略。
Figure ISA0000182046890000011
Figure ISA0000182046890000021

Claims (8)

1.一种玉米赤霉烯酮水解酶的制备方法，包含如下步骤：将携带编码玉米赤霉烯酮水解酶的基因的酵母菌细胞培养于培养基中以表达该玉米赤霉烯酮水解酶，其中所述培养基含有重量比20%至25%的糖蜜、尿素、磷酸二氢铵、硫胺、甲醇，所述编码玉米赤霉烯酮水解酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，所述酵母菌细胞为巴斯德毕赤酵母。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码玉米赤霉烯酮水解酶的基因被插入诱导型表达载体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮水解酶的表达是通过在所述培养基中添加甲醇而予以诱导。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养基中的甲醇浓度是0.25%至0.75%(v/v)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母菌细胞是在28°C至30°C培养24至72小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母菌细胞是以100至150 rpm震荡培养。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含在培养步骤后，从所述酵母菌细胞或该培养基中分离出所述玉米赤霉烯酮水解酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮水解酶的分离是通过裂解该酵母菌细胞以及收集由此获得的细胞裂解物的上清液。
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