CN110383060A - 使用色谱法确定极性农药 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及使用色谱法确定样品中的农药，例如极性农药。本公开可提供使用高效液相色谱法来直接分析极性农药，包括阴离子极性农药。所述极性农药被充分保留和拆分以允许在单一分析中进行多重极性农药确定。

Description

使用色谱法确定极性农药
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月8日提交的标题为“Polar Pesticide DeterminationUsing Chromatography”(使用色谱法确定极性农药)的美国临时申请No.62/468,700以及2017年11月6日提交的标题为“Polar Pesticide Determination Using Chromatography”(使用色谱法确定极性农药)的美国临时申请No.62/582,237的权益和优先权，这些临时申请各自的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及使用色谱法确定样品中的农药，例如极性农药。本公开可提供使用例如液相色谱法和/或高效液相色谱法来直接分析极性农药，包括阴离子极性农药。
背景技术
因在食品或饲料生产所用的农作物上使用植物保护产品而产生的农药残留给公众健康带来了风险因素。各国已经制定了全面的法律架构，其中定义了植物保护产品(如农药)中使用的活性物质的审批规则。这些规则规定了植物保护产品的使用并设定了食品中允许的最大残留量。残留定义在活性物质的评估过程期间设定，该活性物质可包括相关代谢物和其他转化产物。食品监督测试程序检查对最大残留限量(MRL)的合规性，评估膳食暴露，并且检查未经许可的农药的使用。食品工业还承担成分和成品的测试以实现尽责调查或产品放行目的。还测试了来自环境(例如，水)和生物流体的样品以分别确定污染和人体暴露的水平。一些极性农药属于最常用的植物保护产品之列，因此需要监测食品和环境中的残留的稳健方法以确保对当地法定最大允许限量的合规性并评估暴露和人体健康。
发明内容
本公开涉及使用色谱法确定样品中的农药，例如极性农药。本公开可提供使用例如液相色谱法、高效液相色谱法和/或超高效液相色谱法来直接分析极性农药，包括阴离子极性农药。
在一个实施方案中，本公开涉及用于确定(例如，分离和检测)至少一种极性农药和/或代谢物的色谱方法，该方法包括获得样品基质中包含至少一种极性农药和/或代谢物的样品；将样品引入到包括柱的色谱系统，该柱具有包含在柱内部的固定相材料；使用流动相洗脱液使样品流过柱，其中所述至少一种极性农药和/或代谢物基本上被拆分和/或保留；以及使用检测器来检测所述至少一种极性农药和/或代谢物。
该样品可包含多种极性农药和/或代谢物(诸如2种或更多种)，其中这些极性农药和/或代谢物基本上被拆分，例如，具有大于约1的分离度。例如，所述至少两种极性农药可为同质异位极性农药。该方法还可包括从样品基质提取一种或多种极性农药和/或一种或多种代谢物，然后将经提取的样品引入到色谱系统。一种或多种极性农药和/或一种或多种代谢物的保留时间可为柱空隙体积的保留时间的至少1.5倍。通过峰面积所测量的相同样品(或标准品)的多重分析的可重复性具有小于约20％的相对标准偏差(RSD)。
在另一个实施方案中，本公开涉及套件。该套件可包括具有适用于确定(例如，保留、分离、检测)极性农药和/或代谢物的柱和检测器的色谱系统。该柱可具有包含在该柱内部的固定相材料。该套件还可包括用于获得样品基质中包含至少一种极性农药和/或代谢物的样品的说明书。该套件还可包括用于将样品引入到色谱系统的说明书。该套件还可包括用于使用流动相洗脱液使样品流过柱的说明书，其中所述至少一种极性农药和/或代谢物基本上被拆分和/或保留。最后，该套件还可包括用于使用检测器来检测所述至少一种极性农药的说明书。
至少一种极性农药和/或代谢物可选自乙烯利、草铵膦铵盐、草甘膦、三乙膦酸铝、膦酸、马来酰肼、高氯酸盐、氯酸盐、灭蝇胺、杀草强、丁酰肼、乙烯硫脲、丙烯硫脲、矮壮素、助壮素、敌草快、百草枯，以及它们的代谢物和它们的组合。
固定相材料可包括无机/有机杂化颗粒，并且可被构造为在处于1,000psi或高于1,000psi的压力下操作。固定相材料可包含胺官能团。固定相材料可包括二乙基胺官能团、2-吡啶甲基胺官能团、2-乙基吡啶官能团或4-乙基吡啶官能团。固定相材料可包括二醇官能团。固定相材料可包括第一胺官能团和第二二醇官能团，其中胺官能团与二醇官能团的比率介于约0.01∶1和1∶1之间。
流动相洗脱液可包括乙腈、缓冲液或它们的组合。流动相洗脱液可具有介于0.2mL/min和1.0mL/min之间的流速。流动相洗脱液可包括包含缓冲液的有机溶剂和水溶剂或它们的组合，并且可使用梯度洗脱来洗脱所述至少一种极性农药或代谢物，该洗脱包括含有含水溶剂的第一溶剂和含有有机溶剂的第二溶剂的梯度。
柱温可介于30℃和60℃之间。
所确定的所述至少一种极性农药或代谢物的保留时间可为与柱的空隙体积相对应的保留时间的至少两倍。
使用测量峰面积的相同色谱系统来执行该方法至少10次的方法可重复性可具有小于约20％的RSD，其中该样品是极性农药或代谢物参考标准品的溶液。
该样品可包含至少2种极性农药或代谢物，这些极性农药或代谢物基本上被拆分，并且其中基本上被拆分的至少2种极性农药或代谢物可具有大于1的分离度。
检测器可选自UV/VIS检测器、PDA检测器、荧光检测器、质谱仪、折射率检测器、蒸发光散射检测器和电雾式检测器。
本公开提供了优于当前系统和方法的许多优点。例如，当前色谱方法可使用离子对试剂或将衍生化与反相色谱法联用(例如，使用OPA或FMOC试剂)。存在使用多孔石墨化碳、离子色谱法、亲水作用色谱法或混合模式色谱法的方法。然而，这些方法有局限性。它们需要许多不同的单残留方法来覆盖完整的分析范围，需要专用设备或衍生化。一些方法具有稳健性问题，或流动相添加剂所引起的离子抑制问题，或一些化合物的不充分保留问题，或具有限制可用流速并可引起堵塞的操作背压限制问题。另外，这些方法不适用于所有农药，诸如具有极性、高极性或离子性质或它们的组合的那些农药。这些农药通常难以在传统色谱系统上提取、保留和分离。
本公开涉及使用色谱装置和方法以有成本效益且有效的方式确定这些极性农药。本发明方法提供了在单一分析中改善的色谱性能，包括宽泛范围的极性农药和代谢物的充分保留，而无需采取衍生化或专用设备或条件。本发明方法是稳健的，并且易于在常规测试实验室中实施。该方法与现有的常规HPLC和UPLC仪器兼容。本发明方法符合农药分析的大多数监管要求，包括如在标题为“Analytical Quality Control and Method ValidationProcedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed”(用于食品和饲料中的农药残留分析的分析质量控制和方法验证程序)的文件编号SANTE/11945/2015中公布的欧盟委员会标准。
附图说明
通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本发明，在附图中：
图1是根据所述技术的示例性实施方案的用于确定至少一种极性农药或代谢物的方法的流程图。
图2是根据所述技术的示例性实施方案的液相色谱系统的示意图。
图3A至图3I是根据所述技术的示例性实施方案的示出草铵膦(图3A)、草甘膦(图3B)、乙烯利(图3C)、马来酰肼(图3D)、AMPA(图3E)、三乙膦酸铝(图3F)、高氯酸盐(图3G)、氯酸盐(图3H)和膦酸(图3I)的基线分离的色谱图。
图4A至图4I是根据所述技术的示例性实施方案的示出在大批量基质进样期间草铵膦(图4A至图4C)、草甘膦(图4D至图4F)和AMPA(图4G至图4I)的峰形可如何受到影响的色谱图。
图5A至图5M是根据所述技术的示例性实施方案的示出提取溶剂中n-乙酰草铵膦(图5A)、n-乙酰草甘膦(图5B)、草甘膦(图5C)、草铵膦(图5D)、MPPA(图5E)、乙烯利(图5F)、羟基乙烯利(图5G)、马来酰肼(图5H)、三乙膦酸(图5I)、AMPA(图5J)、高氯酸盐(图5K)、氯酸盐(图5L)和膦酸(图5M)在0.05mg/L下的色谱性能的示例的色谱图。
图6是根据所述技术的示例性实施方案的示出洋葱(n＝5)和菠菜(n＝5)中加标到0.01mg/kg的QuPPe提取物所实现的回收率和可重复性的总结的图表。
图7A和图7B是根据所述技术的示例性实施方案的将洋葱中马来酰肼的使用残留(incurred residue)定量到0.072mg/kg的标准添加曲线图。
图8是根据所述技术的示例性实施方案的示出可影响目标分析物的电离效率和基质效应的、已电离的基质的复杂性的雷达全扫描采集。
图9是根据所述技术的示例性实施方案的示出通过此较基质匹配和溶剂校准曲线(特别是示出这两种基质所引起的显著抑制的AMPA曲线的示例)的斜率来确定的基质效应的曲线图。
图10是根据所述技术的示例性实施方案的示出针对AMPA、草铵膦和草甘膦所示的优异批间可重复性(％RSD保留时间≤2.2％且％RSD峰面积＜20％)的色谱图，其中在6个不同TorusDEA柱批次上采集的0.1mg/L标准品被叠加。
图11A至图11M是根据所述技术的示例性实施方案的示出用于洋葱提取物的QuPPE方法的N-乙酰草铵膦(图11A)、N-乙酰草甘膦(图11B)、草铵膦(图11C)、草甘膦(图11D)、MPPA(图11E)、乙烯利(图11F)、羟基乙烯利(图11G)、马来酰肼(图11H)、AMPA(图11I)、三乙膦酸铝(图11J)、高氯酸盐(图11K)、氯酸盐(图11L)和膦酸(图11M)的基线分离的色谱图。
图12A至图12M是根据所述技术的示例性实施方案的示出用于洋葱提取物的改进QuPPE方法的N-乙酰草铵膦(图12A)、N-乙酰草甘膦(图12B)、草铵膦(图12C)、草甘膦(图12D)、MPPA(图12E)、乙烯利(图12F)、羟基乙烯利(图12G)、马来酰肼(图12H)、AMPA(图12I)、三乙膦酸铝(图12J)、高氯酸盐(图12K)、氯酸盐(图12L)和膦酸(图12M)的基线分离的色谱图。
图13A至图13M是根据所述技术的示例性实施方案的示出用于菠菜提取物的QuPPE方法的N-乙酰草铵膦(图13A)、N-乙酰草甘膦(图13B)、草甘膦(图13C)、草铵膦(图13D)、MPPA(图13E)、乙烯利(图13F)、羟基乙烯利(图13G)、马来酰肼(图13H)、三乙膦酸铝(图13I)、AMPA(图13J)、高氯酸盐(图13K)、氯酸盐(图13L)和膦酸(图13M)的基线分离的色谱图。
图14A至图14M是根据所述技术的示例性实施方案的示出用于菠菜提取物的改进QuPPE方法的N-乙酰草铵膦(图14A)、N-乙酰草甘膦(图14B)、草甘膦(图14C)、草铵膦(图14D)、MPPA(图14E)、乙烯利(图14F)、羟基乙烯利(图14G)、马来酰肼(图14H)、三乙膦酸铝(图14I)、AMPA(图14J)、高氯酸盐(图14K)、氯酸盐(图14L)和膦酸(图14M)的基线分离的色谱图。
根据所述技术的示例性实施方案，图15A示出了在0.5kV下使用UniSpray探头时检测葡萄样品中的氯酸盐的色谱图，并且图15B示出了在2.5kV下使用ESI(-)探头时检测葡萄样品中的氯酸盐的色谱图。
具体实施方式
本公开涉及使用色谱法确定样品中的农药，例如极性农药。本公开可提供使用高效液相色谱法来直接分析极性农药，包括阴离子极性农药。
如本文所用，术语“同质异位”是指农药具有相同或基本上相同的多反应监测(MRM)母子离子对。
如本文所用，术语“可重复性”是指在相同条件下在相同系统上对参考标准品溶液的多个测量结果的确定，表示为RSD。
如本文所用，术语“分离度”是指两个峰分离得有多好的量度。可通过R＝(Tr2-Tr1)/(0.5×(Tw1+Tw2))来确定分离度，其中Tr是峰1或峰2的保留时间，并且Tw是峰1和峰2的半高峰宽。
如本文所用，术语“约”意指该数值是近似的，并且较小的变化不会显著影响所公开的实施方案的实践。在使用数值限制的情况下，除非上下文另外指明，否则“约”意指该数值可改变±10％并且仍然在所公开的实施方案的范围内。
在一个实施方案中，本公开涉及用于确定极性农药或代谢物的色谱方法100。参见图1，方法100包括在102处获得样品基质中包含至少一种极性农药或代谢物的样品；在104处将样品引入到包括柱的色谱系统，该柱具有包含在柱内部的固定相材料；在106处使用流动相洗脱液使样品流过柱，其中所述至少一种极性农药或代谢物基本上被拆分和/或保留；以及在108处使用检测器来检测所述至少一种极性农药或代谢物。在所述技术的一些实施方案中，方法100包括在110处从样品基质提取所述至少一种极性农药或代谢物，然后在104处将经提取的样品引入到色谱系统
极性农药或代谢物(本文简称为极性农药)可能难以使用色谱法来保留和分离。用于确定极性农药的当前方法存在一些问题。极性农药可在柱的空隙体积处或附近一起洗脱。当被保留时，极性农药仍可能难以拆分为单独的峰。在一些情况下，无法在单一分析中拆分极性农药的一个或多个临界对。即使当从样品基质提取时，已知的农药色谱方法也具有较差的可重复性和较高的背压。当前方法将FMOC衍生化与C18柱联用(即，需要额外步骤)。其他方法将离子对试剂与C18柱联用，但这可引起LC系统污染和离子抑制，从而造成灵敏度降低，并且具有受限分析范围。可使用PGC，但其需要用目标基质进行大量灌注以提供一致结果，因此不适用于分析成批的混合来源，其依靠使用稳定的同位素类似物以使变异性正态化。还可使用IC，但这些柱受限于较大的粒度并且依靠使用一些试剂，这些试剂需要专业设备或会抑制响应，并且在分析范围很广泛时需要相对较长的运行时间。已使用HILIC柱，但这些柱不太稳健并且受到可注入的提取溶剂的限制。总的来说，这些方法使得难以针对极性农药开发方法并保持色谱性能。还已使用混合模式柱，但这些柱不能为所有极性农药提供合适的色谱性能，并且一些柱具有受限的背压。本发明方法解决了这些问题中的一个或多个问题。该方法可在经过或不经过提取的情况下在高压下保留和分离极性农药的一个或多个临界对以便以改进的可重复性同时进行鉴定和定量。
本发明方法与现有的提取方法(诸如QuPPe和水提取方法)兼容。其能够保留和分离宽泛范围的极性农药。例如，该方法可使用小粒度固定相(例如，1.7μm粒度)来产生高效分离，并且可应对在典型UPLC流速下生成的背压。在一些实施方案中，该方法可具有所有极性农药的充分保留，并且能够分离同质异位极性农药，例如AMPA和三乙膦酸铝。该方法可在延长的时间段(400次进样)内保持有效分离，并且与常规HPLC/UPLC系统兼容，使得不需要昂贵的专业设备。其与MS兼容，使得不需要与MS不兼容的溶剂、流动相缓冲液或离子对试剂。该分析可不存在分析物的改性或者不需要衍生化或离子对试剂。
该样品可为包含适用于当前方法的极性农药的任何样品。该样品可从食品、植物、动物或环境来源(例如，土壤、沉积物、水、空气、生物流体或相关来源)生成。该样品可为或可获自水、果汁、酒精饮料、啤酒、干货、谷粒、淀粉、谷类、新鲜肉、冷冻肉、加工肉制品(例如，香肠)、冷切盘、香料、巧克力、宠物食品、乳清粉、冷冻农产品、新鲜农产品、蛋类、维生素、油、脂肪、水果、大麻/大麻素或它们的组合。该样品可通过直接采样(例如采集纯样品)或通过洗涤或冲洗样品源来获得。可通过本发明方法来测试纯样品或洗涤/冲洗样品。
样品基质可包括如在以下类别中提供的以下组分中的一者或多者。食品包括食料，诸如高水含量(例如，水果、蔬菜、草料/饲料农作物、新鲜真菌、饮用水和饮料)；高酸、高水含量(例如，柑橘类水果和果汁、小果/浆果、其他酸性水果)；高糖、低水含量(例如，蜂蜜、果脯)；极高油含量、低水含量(例如，树坚果、油料种子及相关的酱料和油)；高油含量、中等水含量(例如，油性水果及相关产品)；高淀粉和/或蛋白质含量、低水和脂肪含量(例如，干豆类蔬菜/干豆、谷粒和谷物制品)。例如，可使用本公开的装置和方法来分析橙汁、菠菜、洋葱、大麦、苹果汁、番茄汁、啤酒、小麦、蜂蜜和/或扁豆。不符合上述类别的食品(例如，啤酒花、可可豆及其产品咖啡、茶和香料)；肉和海鲜(例如，红肉、禽肉、动物内脏、鱼和甲壳动物)；乳和乳制品(例如，乳、奶酪、酸奶和奶油)及蛋类。样品必须在确定之前提取。这些基质组分各自可以以单独的量包含在样品基质中，包括约或小于约1ppb、2、5、10、20、50、100、200、500、1000ppb、2ppm、5、10、20、50、100、200、500、1000ppm、2ppt、5、10、20、50、90、98、99或100ppt。这些值可以用来定义一个范围，诸如约2ppb至约20ppm。在一个实施方案中，样品基质可包含约1000ppm或大于约1000ppm蛋白质。在另一个实施方案中，样品基质可包含约1000ppm或大于约1000ppm脂肪。
样品基质还可通过离子强度来表征。样品基质的离子强度可为约、大于约或小于约0.1mM、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000或约5000mM。这些值可以用来定义一个范围，诸如约2mM至约50mM。
本公开的装置和方法是稳健且牢靠的。在一些实施方案中，该方法可确定未经过提取或过滤的样品基质中的极性农药。样品基质可具有一种或多种组分或者如本文所述的离子强度。该系统是稳健且牢靠的，部分原因是柱技术及系统和柱在高压下发挥功能的能力。本公开的系统可以耐受可引起更高系统压力的基质组分的存在。
在其他实施方案中，可提取该样品以从样品基质分离极性农药(例如，去除或减少组分)。该方法还可包括提取方法以从该样品纯化和/或浓缩一种或多种极性农药(参见图1的110)。可使用许多提取技术，包括QuPPe(Quick Polar Pesticides Method，极性农药快提方法)及其修改形式以及类似的水提取方法。
该样品可包含至少一种极性农药。该样品还可包含不止一种极性农药。在一些实施方案中，该样品包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种极性农药。这些值也可以定义一个范围，诸如约2至约9种极性农药。对于具有至少两种或更多种极性农药的样品，该方法可基本上使这些极性农药中的至少两种或更多种彼此拆分并保留。
本发明方法适用于宽泛范围的极性农药。一种或多种极性农药可选自1，3-二氯丙烯、2-羟乙基膦酸(HEPA)、3-甲基磷酸亚基丙酸(MPPA)、涕灭威、艾氏剂、顺式氯氰菊酯、氨甲基膦酸(AMPA)、双甲脒、杀草强、乙基谷硫磷、甲基谷硫磷、丙硫克百威、高效氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、联苯菊酯、多菌灵、克百威、丁硫克百威、氯酸盐、矮壮素、氯化苦、毒死蜱、甲基毒死蜱、氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、灭蝇胺、丁酰肼、DDT、二嗪磷、敌敌畏、苯醚甲环唑、乐果、敌草快、乙烯利、乙硫磷、乙烯硫脲、ETU、苯氧威、杀螟硫磷、氰戊菊酯、氟虫腈、三乙膦酸铝、精高效氯氟氰菊酯、草铵膦铵盐、草甘膦、己唑醇、春雷霉素、高效氯氟氰菊酯、林丹、马拉硫磷、马来酰肼、代森锰锌、助壮素、甲胺磷、灭多威、甲基溴、N-乙酰AMPA、N-乙酰草铵膦、N-乙酰草甘膦、烟碱、百草枯、对硫磷、甲基对硫磷、高氯酸盐、氯菊酯、膦酸、丙溴磷、丙烯硫脲、PTU、TCP、特丁硫磷、噻虫嗪、氟乐灵、三甲基硫盐以及它们的组合。在一些实施方案中，一种或多种极性农药可选自乙烯利、2-羟乙基膦酸(HEPA)、草铵膦铵盐、N-乙酰草铵膦、3-甲基磷酸亚基丙酸(MPPA)、草甘膦、氨甲基膦酸(AMPA)、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA、三乙膦酸铝、膦酸、马来酰肼、高氯酸盐、氯酸盐、灭蝇胺、杀草强、丁酰肼、乙烯硫脲、丙烯硫脲、矮壮素、助壮素、敌草快、百草枯及其代谢物、以及它们的组合。
在另一个实施方案中，适用极性农药的列表可包括乙烯利、草铵膦铵盐、草甘膦、三乙膦酸铝、膦酸、马来酰肼、高氯酸盐、氯酸盐、灭蝇胺、杀草强、丁酰肼、乙烯硫脲、丙烯硫脲、矮壮素、助壮素、敌草快、百草枯及其代谢物、以及它们的组合。
对于包含至少两种极性农药的样品，这些农药中的至少两种或更多种可为同质异位化合物。在一个实施方案中，该样品中的任何同质异位极性农药可基本上被拆分，例如，具有大于约1的分离度。该样品可包含两组或更多组同质异位化合物。在一个实施方案中，该样品可包含AMPA和三乙膦酸铝两者。在其他实施方案中，本发明方法可扩展到其他极性化合物，诸如与兽医学、海洋生物毒素和代谢组学相关的极性化合物。
本公开的方法可在满足监管和工业要求的水平下确定该样品中测得的所述至少一种极性农药的量。该样品或经提取的样品或经浓缩的样品可包含或可被确定为包含约、大于约或小于约0.1ppb、0.5、1、5、10、50、100、250、500、750、1000、5000、10000、50000、75000和约100000ppb的每种极性农药。这些值可以定义每种农药的范围，诸如约0.5至约100000ppb、或约0.5至约500ppm、或约5至约250ppb。
图2示出了液相色谱系统200。在201处制各样品之后，样品进入色谱系统200。可以使用能够使用稳健方法来获得、保留、分离和检测样品基质中的一种或多种极性农药的任何色谱系统200。色谱系统200可具有自动进样器(未示出)、一个或多个泵(未示出)、进样器(未示出)、柱202和检测器204。系统200可包括不同液相色谱系统，包括I-class、H-class、M-class、H-class bio等。例如，色谱系统可为 HPLC系统、LC、ACQUITY I-Class、 H-Class、 M-Class、 H-Class Bio、ACQUITY ACQUITY ULTRA PERFORMANCE所有这些系统都可从美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(WatersCorporation，Milford，MA，USA)商购获得。
色谱柱可具有允许极性农药在如所公开的色谱系统中的有效分离的任何内径。该内径可为约、大于约或小于约0.05mm、0.075、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2、2.1、3.0、4、4.6、5、6、7、7.8、8、9、10、11、12、13、14或约15mm。这些值可以用来定义一个范围，诸如约0.075至约10mm、约0.3至约7.8mm、约1至约5mm以及约2至约3mm。在一些实施方案中，内径为2.1mm。
类似地，色谱柱可具有允许极性农药在如所公开的色谱系统中的有效分离的任何长度。该长度可为约、大于约或小于约5mm、20、50、75、100、150、200、250或约300mm。这些值可以用来定义一个范围，诸如约50至约150mm。柱长可包括或不包括具有相同或类似化学物质的保护柱。
本发明装置和方法可被构造为应对或适应在典型UPLC流速下生成的高压/背压。该装置可耐受高压，部分原因是固定相材料具有无机/有机杂化颗粒。这些颗粒可包括亚乙基桥，例如亚乙基桥颗粒。固定相材料可在处于或高于1000psi、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000或40000psi的压力下操作。这些值可以用来定义一个范围，诸如约2000至约10000psi。美国专利No.4,017,528、6,528,167、6,686,035、7,175,913和7,919,177(它们各自全文以引用方式并入本文)还公开了有机-无机杂化材料和亚乙基桥(BEH)颗粒。
色谱柱可包括固定相材料，该固定相材料具有允许极性农药在如所公开的色谱系统中的有效分离的平均孔体积。该平均孔体积可为约、大于约或小于约0.01cm3/g、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.75、0.8、0.85、0.9、1、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、1.8、1.85、1.9、1.95、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5或约5cm3/g。这些值可以用来定义一个范围，诸如约0.1至约2.0cm3/g、或约0.3至约1.2cm3/g、或约0.6至约1.0cm3/g
色谱柱可包括固定相材料，该固定相材料具有允许极性农药在如所公开的色谱系统中的有效分离的平均孔径。该平均孔径可为约、大于约或小于约10埃20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、850、900、950、1000、1050、2000、2050或约这些值可以用来定义一个范围，诸如约60至约或约80至约或约90至约
色谱柱可包括固定相材料，该固定相材料具有允许极性农药在如所公开的色谱系统中的有效分离的表面积。表面积的量度可为约、大于约或小于约10m2/g、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680或700m2/g。这些值可以用来定义一个范围，诸如约80至约400m2/g、或约100至约200m2/g。
色谱柱可包括固定相材料，该固定相材料所包括的颗粒具有允许极性农药在如所公开的色谱系统中的有效分离的平均粒度。该平均粒度的量度可为约、大于约或小于约0.1μm、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5或约15μm。这些值可以用来定义一个范围，诸如约1至约10μm、或约1.5至约5μm、或约1.6至约2.7μm。在一个实施方案中，粒度为1.7μm。
固定相材料可被构造为保留和分离极性农药。固定相材料可包含胺官能团。胺官能团可包括二乙胺、2-吡啶甲基胺、2-乙基吡啶、4-乙基吡啶或它们的组合。固定相还可包括二乙烯基苯(DVB)和N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)官能化的季胺或烷基季胺，诸如可从美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation，Milford，MA，USA)商购获得的Oasis 胺官能团浓度可为约、大于约或小于约0.1μmol/m2、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或约8μmol/m2。这些值可以用来定义一个范围，诸如约0.1至约4.0μmol/m2、或约0.25至约3.0μmol/m2、或约0.5至约2.0μmol/m2、或约1.0至约1.6μmol/m2。
固定相材料还可包括二醇官能团。二醇官能团浓度可为约、大于约或小于约0.1μmol/m2、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.5、7、7.5或约8μmol/m2。这些值可以用来定义一个范围，诸如约3.5至约5.5μmol/m2、或约4至约5μmol/m2。胺官能团与二醇官能团的比率还可为约0.01∶1、0.02∶1、0.03∶1、0.04∶1、0.05∶1、0.06∶1、0.07∶1、0.08∶1、0.09∶1、0.1∶1、0.2∶1、0.3∶1、0.4∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1或约1∶1。这些值也可以用来定义一个范围，诸如约0.1∶1至1∶1。
U.S.2014/0319057、U.S.2015/0133294、U.S.2015/0136700、U.S.2016/0184736和WO2016176461(它们各自全文以引用方式并入本文)还公开了柱、载体和固定相涂层及其特征和性能。
重新参见图2，该装置和方法还可使用柱202上游的保护柱206。保护柱206可具有与柱202相同的填充材料，可具有与柱202不同的填充材料，可具有C18键合相，可具有不同的填充材料尺寸，或它们的组合。
在一个实施方案中，本公开涉及使用具有亚乙基桥(BEH)杂化固定相颗粒的柱(诸如可从美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation，Milford，MA，USA)商购获得的 DEA柱)来直接分析阴离子极性农药。
可使用流动相洗脱液(或流动相)和流动相梯度，它们可被构造为保留、分离和洗脱极性农药。流动相可包括具有缓冲液的有机溶剂和水溶剂。在一个实施方案中，流动相可包括乙腈、水性缓冲液或它们的组合。流动相可包括例如流动相A(50mM甲酸铵，pH 2.9)和流动相B(乙腈)。流动相可包括例如流动相A(50mM甲酸铵，pH 2.9)和流动相B(乙腈和0.9％甲酸)。色谱系统可包括流动相，该流动相具有允许极性农药在如所公开的色谱系统中的有效分离的流速。流动相流速可为约、大于约或小于约0.01mL/min、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、1、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、1.8、1.85、1.9、1.95、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5或4mL/min。这些值可以用来定义一个范围，诸如约0.2至约1.0、或约1.0至约1.5mL/min。这些范围可与具体柱内径(诸如至多约4.6mm)相关联。可基于柱直径和粒度来适当地缩放流速。
该方法可包括具有包含缓冲液的有机溶剂和水溶剂的流动相，并且其中可使用梯度洗脱来洗脱待确定的一种或多种极性农药。在使用双溶剂体系的一个实施方案中，洗脱可包括含有含水溶剂的第一溶剂和含有有机溶剂的第二溶剂的梯度。本领域的技术人员应当理解，还可使用利用多种溶剂的类似梯度。表1中提供了示例性梯度。
表1：示例性梯度条件
时间(Min) 第一溶剂(％) 第二溶剂(％)
0 1 100
1-3 0 100
4-6 30-50 50-70
7-9 100 0
11-13 100 0
11.1-13.1 0 100
18-22 0 100
柱温还可被配置为保留和分离极性农药。柱温可为约、大于约或小于约1℃、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或约200℃。这些值可以用来定义一个范围，诸如约30至约60℃、或约20至约40℃。
流动相中包含的缓冲液可包括甲酸盐、乙酸盐、碳酸盐或它们的组合。缓冲液的浓度可为约、大于约或小于约1mM、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000mM缓冲液。这些值可以用来定义一个范围，诸如约10至约400mM、或约50至约100mM。
色谱柱可包括流动相，该流动相具有允许极性农药在如所公开的色谱系统中的有效分离的pH。流动相的pH可为约、大于约或小于约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5或约14 pH单位。这些值可以用来定义一个范围，诸如约1至约7 pH单位、或约2至约2.9 pH单位。
本公开的装置和方法可保留和分离一种或多种极性农药。与用于一种或多种极性农药的现有技术相比，这些极性农药的保留得到改善。由该方法确定的一种或多种所述极性农药的保留时间可为与柱的空隙体积相对应的保留时间的至少约1.5倍。在其他实施方案中，保留时间可为约或大于约与柱的空隙体积相对应的保留时间的1.5倍、2、2.5、3、3.5、4、4.5或约5.0倍。这些值可以用来定义一个范围，诸如约2至约3倍、或约3至约4倍。一种或多种所述极性农药的绝对保留时间可为约或长于约0.5分钟、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或约10分钟。这些值可以用来定义一个范围，诸如约5至约10分钟。
用于分离极性农药的本公开的装置和方法是稳健且可重复的。在一个实施方案中，使用相同色谱系统执行本公开的方法至少10次并测量峰保留时间的方法可重复性具有约或小于约0.2％、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或约5％的RSD。该样品可为一种或多种极性农药参考标准品的溶液。这些值可以用来定义一个范围，诸如约0.5至约3％。本公开的方法可重复约或大于约10次、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或约5000次。这些值可以用来定义一个范围，诸如约10至约2000次、约10至约1000次、约50至约500次、或约200至约400次。该可重复性还可伴随约或小于约10％、9、8、7、6、5、4、3、2或约1％的背压升高一起发生。这些值可以用来定义一个范围，诸如约1％至约5％。在一些实施方案中，可能不存在可观察的背压升高。
本公开的装置和方法可分离和拆分一种或多种极性农药。基本上被拆分的极性农药(即，至少一对或多对峰)可具有约或大于约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或约2的分离度。在一些实施方案中，可在样品中鉴定出极性农药的至少一个临界对，并且所述一个或多个对可基本上被拆分。还可定义该方法的线性度或直线拟合度。应用于所测量的一种或多种所述极性农药的校准曲线图的直线拟合度具有相关系数值，其在至少1个数量级的浓度范围内或在至少2个数量级的浓度范围内可为约或大于约0.9。相关系数也可为约或大于约0.95、0.96、0.97、0.98、0.99、0.999、0.9999或约0.99999，并且可在1、2、3、4或5个数量级的范围内、或它们的任何组合。这些值可以用来定义一个范围，诸如2至4个数量级范围内的约0.98至约0.999。
重新参见图2，色谱系统检测器204可以是可用于确定极性农药的任何检测器。检测器204可用于定性地确定和/或定量地确定极性农药，数据分析208可由连接到检测器204的计算机或设备进行。检测器204可选自UV/VIS检测器、PDA检测器、荧光检测器、质谱仪、折射率检测器、蒸发光散射检测器和电雾式检测器。可使用各种质谱仪。例如，质谱仪可选自单四极杆、串联或三重四级杆、QTOF、QTrap、静电场轨道阱(Orbitrap)和线性离子阱。在一些实施方案中，质谱仪可为ACQUITY SQ检测器、TQ检测器、SQ Detector 2TM、 TQD、 TQ-S micro、 TQ-S、 TQ-XS、 G2-XS TOF、 G2-XS QTOF、 G2-Si MS、MALDI G2-Si MS、 IMS QTOF、 G2-Si HDMS、MALDI G2-Si HDMS，所有这些质谱仪都可从美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation，Milford，MA，USA)商购获得。质谱仪可为配备有用于多个设备进行集成操作的接口的四级杆。质谱仪还可被配置用于扫描(质荷此扫描)、SIR(选择离子检测)、MRM(多反应监测)、MSe(高和低碎裂能量)和/或它们的组合，例如雷达(扫描和SIR一起或者全扫描和MRM同时运行)，诸如利用可从美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation，Milford，MA，USA)商购获得的ACQUITY
在一些实施方案中，可执行本公开的方法而没有其他方法的附加要求，诸如无需提取、衍生化、离子对试剂或专用设备。例如，该方法可排除提取步骤、衍生化步骤、专用设备(诸如具有化学或膜抑制器的离子色谱系统)的使用、或它们的组合。
本公开还涉及套件。该套件可包括色谱系统，如本文所述，该色谱系统包括柱和检测器。该柱可具有包含在内部的固定相材料。该套件还可具有用于获得样品基质中包含至少一种极性农药的样品的说明书。该套件还可具有用于将样品引入到色谱系统的说明书。该套件还可具有用于使用流动相洗脱液使样品流过柱的说明书，其中所述至少一种极性农药基本上被拆分和/或保留。该套件还可具有用于使用检测器来检测经拆分和保留的至少一种极性农药的说明书。
在一些实施方案中，该套件还可包括用于从如本文所提供的样品基质提取一种提取样品的说明书。类似地，该套件还可包括用于排除提取步骤、衍生化步骤、离子对试剂、专用设备(诸如具有化学或膜抑制器的离子色谱系统)的使用、离子对试剂、或它们的组合的说明书。
该方法可包括极性农药标准品的使用。该套件可包括极性农药标准品。这些标准品可用于建立单点校准，可用于建立一个或多个阈值校准品以确定样品是否具有小于或大于一个或多个标准品的量，或可用于建立多点校准曲线。一种或多种所述极性农药标准品可为同位素标记的标准品。该方法可采用第一已知量的第一校准品和第二已知量的第二校准品(以及附加校准品，直到并包括第六已知量的第六校准品等)，其中第一已知量和第二已知量不同，并且第一校准品、第二校准品和目标极性农药各自可通过质谱法在样品中加以区分，以定量样品中的目标极性农药。校准品和/或目标极性农药可例如基于同位素取代和/或化学官能团取代加以区分。U.S.20140158881(其全文以引用方式并入本文)还公开了同位素标记的标准品及其确定目标分析物(例如，极性农药)的用途。最后，该方法和套件还可在样品基质或基本上等同的样品基质中使用并包括加标标准品。
在一个实施方案中，该套件可包括标准品和/或同位素标记的标准品。该套件可为能力测验套件。该套件还可包括用于下载该方法的报告模板的说明书。
包括出版物、专利和专利申请在内的所有引用参考文献的公开内容全文明确地以引用方式并入本文中。
当量、浓度或其他值或参数以范围、优选范围或上限优选值和下限优选值的列表给出时，应该理解为具体公开了由任何范围上限或优选值以及任何范围下限或优选值的任何对所形成的所有范围，而不管范围是否单独公开。在本文中列举数值范围的情况下，除非另有说明，否则范围旨在包括其端点以及该范围内的所有整数和分数。当限定范围时，本发明的范围不旨在限于所述的具体值。
在下面的示例中进一步限定了本发明。应该理解，这些示例虽然指出了本发明的优选实施方案，但仅作为说明给出。
实施例
实施例1
使用本公开的方法来确定橙汁中的极性农药。测试以下极性农药：草甘膦、AMPA、草铵膦、高氯酸盐、乙烯利、三乙膦酸铝、马来酰肼、膦酸和氯酸盐。表2中示出了这些极性农药各自的MS条件。使用QuPPe提取方法来提取橙汁样品。使用10mL 1％甲酸的MeOH溶液来酸化样品的10mL份量。将该混合物摇动10分钟，并且在4000rpm下离心5分钟。然后使用0.45微米过滤器来过滤该混合物。使用约250ppb的每种农药对经过滤的样品提取物进行加标，然后将其引入到色谱系统。
表2：实施例1MS条件
色谱系统包括可从美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(WatersCorporation，Milford，MA，USA)商购获得的系统。柱是可从美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation，Milford，MA，USA)商购获得的 DEA柱，3×100mm，130埃，1.7微米颗粒。LC系统是 I class(FTN)。检测器是可从美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation，Milford，MA，USA)商购获得的 TQ-XS检测器。
流动相包括溶剂A：50mM甲酸铵，pH 2.9，和溶剂B：ACN和溶剂。进样体积为10微升。柱温为40℃。样品温度为10℃。所使用的流动相梯度列于表3中：
表3：实施例1梯度条件
时间(Min) A(％) B(％)
0 0 100
2 0 100
5 40 60
8 100 0
12 100 0
12.1 0 100
20 0 100
已证实色谱系统在与现有提取方案耦合时能有效确定极性农药。这些极性农药表现出在二十分钟运行时间内对这些极性农药的改善的保留和色谱性能。所有极性农药的保留大于柱的空隙体积的约2倍。两种所述极性农药即AMPA和三乙膦酸铝具有同质异位MRM母子离子对，这需要提供这些峰的实质拆分的色谱分离。如图3A至图3I所示，实现了这些化合物的基线分离。
还通过加标有极性农药的橙汁提取物的重复分析，研究了柱的稳健性。极性农药的保留时间和相关联的峰面积显示出在400次进样之后可重复(RSD分别＜0.2％和＜15％)，而没有可观察的背压升高。
还使用其他柱执行了分析。表4中示出了柱比较的结果。本公开的装置和方法显示出与所测试的其他柱相比有明显改善，特别是在可重复性方面；比Acclaim和Shodex柱两者更一致的保留时间以及比Acclaim更好的响应精确度，这两种柱的测试时间段要长得多。
表4：柱比较
实施例2
描述了用于分析经提取的食品基质中的极性农药的初始条件和分析方法。
柱平衡：在安装柱之前，可对LC系统进行酸洗以去除金属离子。当最初收到柱时，可将柱置于50％乙腈/50％(LCMS级水)中冲洗50个柱体积。例如，对于3.0mm×150mm柱，1个柱体积等于1.06mL。在0.45mL/min的流速下，需要2.35min才能填满一个柱体积。平衡可包括在进行第一次进样之前20个柱体积的初始流动相条件。
LC条件可与实施例1中所用的相同。表5中提供了示例性梯度。
表5：实施例2梯度条件
LC条件可与实施例1中所用的相同。梯度可如表5中所提供。该样品可包括各种极性农药，包括草甘膦、AMPA、草铵膦、高氯酸盐、乙烯利、三乙膦酸铝、马来酰肼、膦酸和氯酸盐。
参见图4A至图4I，在大批量基质进样期间草甘膦、草铵膦和AMPA的峰形可受到影响。这可能是由于LC系统和柱中的金属离子污染，该金属离子污染可导致峰拖尾。在一些实施方案中，可使用洗涤步骤来确保或恢复峰形。例如，可使用柠檬酸溶液来有效恢复初始峰形。可在约100个或更多个样品的每一次批运行之后和/或在观察到不可接受的峰拖尾之后运行洗涤程序。该程序可包括：
使用柠檬酸溶液(例如，0.5-10mM，5mM)洗涤柱至少约10或15分钟。该洗涤流可被转移到废料。使用流动相B冲洗柱至少约20或30分钟以洗掉所有剩余的柠檬酸。柠檬酸的存在可抑制信号。在进行另一次进样之前使用至少约20或30个柱体积的初始流动相条件来重新平衡柱。注入溶剂标准品以检查峰形和峰强度。如果峰形仍受影响，则可尝试0.2mL/min流速下的附加冲洗。在一些实施方案中，可使用50∶50流动相A∶流动相B来冲洗柱。
当观察到灵敏度的明显损失时，可尝试用有机溶剂进行过夜洗涤。如果仍然观察到损失，则可用酸溶液洗涤入口。例如，可进行以下步骤。使MS从LC系统断开连接。从LC去除柱并且将管线引导到废料。将溶剂管线和样品管理器清洗附件放入30％磷酸的水溶液中。将清洗阀和柱塞杆清洗附件放入不含添加剂的90∶10水∶MeOH的洗涤溶液中。不要将柱塞杆清洗管线放入酸洗溶液中。不要将溶剂管线放入酸中超过90分钟。可执行持续约一小时的一系列进样，然后用水或普通流动相冲洗以从该系统中清除酸。例如，3min持续时间的20次进样在管线A1 B1上运行并伴以酸洗。3min持续时间的20次进样在A2 B2上运行并伴以酸洗。LC系统的清洗是熟知的，并且清洗LC系统的一个示例可见于标题为“ControllingContamination in LC/MC Systems：Best Practices”(控制LC/MC系统中的污染：最佳做法)的文件中题为“Cleaning to Eliminate Contamination”(通过清洗消除污染)的部分，美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation，Milford，MA，USA)，文件编号715001307，可在http：//www.waters.com/webassets/cms/support/docs/ 715001307rg.pdf处找到。
可将所有溶剂管线(A1 A2 B1 B2)和样品管理器清洗附件放入无添加剂的LC-MS级水中。可进行以下步骤：在A2 B2上灌注该系统5min，灌注柱塞杆清洗附件，灌注样品管理器清洗附件(30s和20个循环)。在A1 B1上灌注该系统5min，灌注柱塞杆清洗附件，灌注样品管理器清洗附件(30s和20个循环)。执行在A1 B1上运行的3min持续时间的充分进样，以使pH水平恢复到水pH或7.0。执行在A2 B2上运行的3min持续时间的充分进样，以使pH水平恢复到水pH或7.0。按照第3部分中所示的方法溶剂来灌注柱塞杆清洗附件和样品管理器清洗附件。表6中提供了示例性清洗梯度。
表6：实施例2清洗梯度条件
时间(min) 流速ml/min ％A ％B
0.00 0.3 95 5
0.50 0.3 95 5
2.00 0.3 5 95
2.50 0.3 5 95
3.00 0.3 95 5
可使用质谱仪检测器，诸如可从美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(WatersCorporation，Milford，MA，USA)商购获得的 TQ-XS检测器。
可在表7中所列的条件下初次优化 TQ-XS检测器。
表7：实施例2 MS仪器设置
这些值可各自独立地改变约1％、2、3、4、5、6、7、8、9或10％以优化检测器。可使用相对较高的锥孔气流量来防止系统污染。通过增加锥孔气流量，可显著减少基线噪声。一个可能的缺点是某种化合物的相对较高的浓度可表现出轻微的强度损失。
这些初始条件和分析方法可用于经提取的食品基质中的极性农药的初始分析。
实施例3
从零售店购买标记为有机的洋葱和菠菜的样品，将其均质化，并且使用EURL极性农药快速提取方法提取。
表8：实施例3，液相色谱系统
LC系统 ACQUITY UPLC I-Class
色谱柱 Torus DEA 2.1×100mm
流动相A 50mM甲酸铵pH 2.9
流动相B 0.9％甲酸的乙腈溶液
强洗 10∶90乙腈∶水
弱洗 90∶10乙腈∶水
柱温 50℃
样品温度 10℃
进样体积 10μL
流速 0.5mL/min
运行时间 20分钟
表9：实施例3 MS仪器设置
所使用的流动相梯度列于表10中。梯度保持为320μL。
表10：实施例3流动相梯度
时间(Min) 第一溶剂(％) 第二溶剂(％) 曲线
0 10 90
4.5 60 40 2
8.5 60 40 6
20 10 90 1
MS的采集是每种化合物具有至少2个母子离子对的MRM。图5A至图5M中报告了主要母子离子对，这些图示出了提取溶剂中十三种分析物在0.05mg/L下的色谱性能的示例。
将菠菜和洋葱这两种食品样品加标到0.01mg/kg，并且根据QuPPE方法提取。为每种样品制备了五个重复样。图6中总结了所实现的回收率和可重复性，其中示出了优异的方法性能。由于在这些样品中检测到使用残留(即，洋葱中的马来酰肼和菠菜中的膦酸)，已省略回收率。对于其余11种分析物，针对基质匹配校准曲线计算的回收率落在80和125％以内。两种基质中的所有13种分析物的可重复性(报告为％RSD)小于20％。在溶剂和基质匹配校准曲线中确定了13种分析物的线性度。在所有分析物的0.0005至0.2mg/L范围内在溶剂中展现出优异的性能，其中残留＜20％。在菠菜和洋葱基质两者中观察到类似的性能(残留＜22％)
然而，由于这些样品中存在使用残留，因此在TargetLynx XS中生成标准添加校准曲线以便在不存在同位素标记的内标物的情况下可靠地定量马来酰肼和膦酸残留。图7A和图7B中示出了一个示例，其中马来酰肼的使用残留被定量为洋葱中的0.072mg/kg。
还使用所有外部校准曲线评估了基质效应，在图8和图9中报告。通过比较所有曲线的斜率得出，＞100％的值表示因基质干扰而引起的离子增强并且＜100％表示因基质干扰而引起的离子抑制。在MRM的同时采集雷达扫描(全MS扫描)提供了有关基质和本底离子的附加信息，如图8所示。表11总结了洋葱和菠菜中的所有分析物的增强(＞50％)和抑制(＜50％)。
表11
洋葱(％) 菠菜(％)
N-乙酰草铵膦 101 233
N-乙酰草甘膦 105 370
草铵膦 96 99
草甘膦 109 104
MPPA 339 488
乙烯利 131 287
马来酰肼 14 9
三乙膦酸铝 100 107
AMPA 10 47
高氯酸盐 59 494
氯酸盐 278 245
羟基乙烯利 131 156
膦酸 149 151
评估了六个批次的Torus DEA柱以确定该方法在各批次间的可重复性，重点放在AMPA、草甘膦和草铵膦上。对所有六个柱进行重复进样(n＝6)。图10中总结了代表性结果，其中每个柱的一次进样被叠加。六个批次中的所有进样在保留时间(＜0.12分钟差异)和峰面积(％RSD＜20％)方面都实现了优异的可靠性。
结论。通过在先前LC-MS/MS方法上扩展，使用Torus DEA柱的初始工作已证实了食品中的阴离子极性农药的可靠性分析的优异性能。主要有益效果包括(i)单次进样就能改善对广泛范围的阴离子农药的色谱性能；(ii)对所有分析物保持了系统灵敏度，LOD＜0.001mg/kg；(iii)在没有同位素标记的内标物的情况下可重复的定量分析，在洋葱和菠菜中在0.01mg/kg下实现％RSD＜22％；(iv)Torus DEA柱的6个批次间的优异可重复性，其中AMPA、草铵膦和草甘膦的保留时间在批内＜0.05分钟并且在批间＜0.12分钟；以及(v)在不存在同位素标记的内标物的情况下使用标准添加校准准确地定量了分析物的使用残留。
实施例4
使用本公开的方法来确定洋葱和菠菜中的极性农药。测试以下极性农药：草甘膦、AMPA、草铵膦、高氯酸盐、乙烯利、三乙膦酸铝、马来酰肼、膦酸、氯酸盐、N-乙酰草甘膦、N-乙酰草铵膦、羟基乙烯利、MPPA。将洋葱和菠菜的样品以各种水平加标，并且置于室温下2小时。然后使用QuPPe和改进的QuPPe提取方法来提取该样品。对于QuPPe提取方法而言，使用5mL 1％甲酸的MeOH溶液来酸化样品的5g份量。对于改进的QuPPe提取方法而言，使用5mL的乙腈来酸化样品的5g份量。对于QuPPe和改进的QuPPe提取方法而言，将所得的混合物涡旋2分钟，并在6000rpm下离心5分钟。然后使用0.25微米过滤器过滤该混合物，之后将其引入到色谱系统。除了上面指出的提取溶剂的差异之外，QuPPe和改进的QuPPE提取方法相同。
表12中示出了MS条件，其中定量痕量以粗体指示。毛细管电压为2.4kV，源温度为150℃，脱溶剂温度为600℃，锥孔气流量为300L/h，雾化器为7巴，并且阈值ESI负离子为40。
表12：实施例4 MS条件(定量痕量以粗体指示)
表13：实施例4流动相梯度
时间(Min) 第一溶剂(％) 第二溶剂(％) 曲线
0 10 90
4.5 60 40 2
8.5 60 40 6
20 10 90 1
色谱系统包括可从美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(WatersCorporation，Milford，MA，USA)商购获得的系统。柱是可从美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation，Milford，MA，USA)商购获得的 DEA柱，2.1×100mm，130埃，1.7微米颗粒。LC系统是 I class(FTN)。检测器是可从美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation，Milford，MA，USA)商购获得的 TQ-XS检测器。溶剂A是50mM甲酸铵pH 2.9(0.9％甲酸)，并且溶剂B是MeCN+0.9％甲酸。柱温为50℃，并且样品温度为10℃。进样体积为10μL，并且流速为0.5mL/min。
分别在图11A至图11M和图12A至图12M中示出了洋葱提取物的10ppb样品前处理后加标(post spike)时QuPPE和改进的QuPPE的色谱图。
在表14中在两个浓度水平下可以看出洋葱提取物的可重复性，n＝5。从表14中可以看出，马来酰肼使用残留和AMPA具有基质抑制。
表14：实施例4洋葱提取物的可重复性
分别在图13A至图13M和图14A至图14M中示出了菠菜提取物的10ppb样品前处理后加标(post spike)时QuPPE和改进的QuPPE的色谱图。
在表15中在两个浓度水平下可以看出菠菜提取物的可重复性，n＝5。从表15中可以看出，膦酸使用残留。
表15：实施例4菠菜提取物的可重复性
如以上实施例中所示，使用优化的方法条件改善了Torus DEA解决方案的色谱法(峰形)和稳健性，这些优化的方法条件包括(i)向溶剂BMeCN添加0.9％甲酸(生成了更好的峰形)；(ii)10∶90初始条件(分离Fos Al和AMPA)；(iii)曲线类型2(改善了AMPA峰形)；以及(iv)60∶40最终条件(更稳定的洗脱)。使用QuPPE和改进的QuPPE提取溶剂时洋葱和菠菜提取物的可接受线性度。样品前处理前加标(pre-spike)提取溶剂和洋葱提取物的可接受准确度和精确度。菠菜提取物表现出精确的结果，但少数情况不准确。使用QuPPE溶剂获得了最有前景的结果。从以上实施例中可以看出，AMPA在洋葱基质中受到明显抑制。
实施例5
本发明技术的方法可与各种检测器(例如，质谱仪)、探头和柱一起使用。该实施例示出了可如何使用QuPPE提取方法来分离七种化合物(草铵膦、草甘膦、乙烯利、AMPA、三乙膦酸铝、氯酸盐和膦酸)，特别是从水果样品(例如，葡萄样品)分离氯酸盐和高氯酸盐，
用于分离的系统包括配有Xevo TQ-S micro检测器的 I-Class(FL)。柱是TORUS DEA 2.1×50mm，1.7μm。流动相是：流动相A：pH为2.9的LCMS级50mM甲酸铵(甲酸)；和流动相B：LCMS级乙腈0.9％甲酸。流速为0.50mL/min。进样后梯度延迟为320μl，并且进样体积为18μl(安装了20μl样品环)。表15中示出了该梯度。XEVO TQ-X Micro在150℃的源温度和0.5kV的引脚电压下操作。脱溶剂温度为600℃，并且锥孔气流量为150L/h。脱溶剂气流量为1000L/h。该数据在ESI(-)和US(-)中收集。
表15：实施例5流动相梯度
时间(Min) 溶剂A(％) 溶剂B(％) 曲线
0 10 90 初始
2.00 80 20 4
4.25 80 20 6
7.80 10 90 1
以与上述实施例类似的方式用100ppb的氯酸盐和高氯酸盐加标葡萄样品。图15A示出了在0.5kV下使用UniSpray探头时检测葡萄样品中的氯酸盐的色谱图，并且图15B示出了在2.5kV下使用ESI(-)探头时检测葡萄样品中的氯酸盐的色谱图。UniSpray探头的使用使得峰高方面改善了10.5倍并且峰面积方面改善了十倍。对于葡萄样品中的高氯酸盐而言，也可见类似的改善。
虽然本公开已经参考其示例性实施方案具体示出和描述，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。

Claims (18)

1.一种用于确定至少一种极性农药或代谢物的色谱方法，所述方法包括：
(i)获得样品基质中包含至少一种极性农药或代谢物的样品；
(ii)将所述样品引入到包括柱的色谱系统，所述柱具有包含在所述柱内部的固定相材料，
(iii)使用流动相洗脱液使所述样品流过所述柱，其中所述至少一种极性农药或代谢物基本上被拆分和保留，以及
(iv)使用检测器来检测所述至少一种极性农药或代谢物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包含至少2种极性农药或代谢物，并且所述至少2种极性农药或代谢物基本上被拆分和保留。
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括从所述样品基质提取所述至少一种极性农药或代谢物，然后将所述经提取的样品引入到所述色谱系统。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种极性农药或代谢物选自乙烯利、草铵膦铵盐、草甘膦、三乙膦酸铝、膦酸、马来酰肼、高氯酸盐、氯酸盐、灭蝇胺、杀草强、丁酰肼、乙烯硫脲、丙烯硫脲、矮壮素、助壮素、敌草快、百草枯，以及它们的代谢物和它们的组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定相材料包括无机/有机杂化颗粒，并且被构造为在处于1,000psi或高于1,000psi的压力下操作。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定相材料包含胺官能团。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定相材料包含二乙基胺官能团、2-吡啶甲基胺官能团、2-乙基吡啶官能团或4-乙基吡啶官能团。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定相材料包含二醇官能团。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定相材料包含第一胺官能团和第二二醇官能团，其中胺官能团与二醇官能团的比率介于约0.01∶1和1∶1之间。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相洗脱液包括乙腈、缓冲液或它们的组合。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相洗脱液具有介于0.2mL/min和1.0mL/min之间的流速。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相洗脱液包括包含缓冲液的有机溶剂和含水溶剂或它们的组合，并且其中可使用梯度洗脱来洗脱所述至少一种极性农药或代谢物，所述洗脱包括含有含水溶剂的第一溶剂和含有有机溶剂的第二溶剂的梯度。
13.根据权利要求1所述的方法，其中柱温介于30℃和60℃之间。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所确定的所述至少一种极性农药或代谢物的保留时间是与所述柱的空隙体积相对应的保留时间的至少两倍。
15.根据权利要求1所述的方法，其中使用测量峰面积的相同色谱系统来执行根据权利要求1所述的方法至少10次的方法可重复性具有小于约20％的RSD，其中所述样品是极性农药或代谢物参考标准品的溶液。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包含至少2种极性农药或代谢物，所述至少2种极性农药或代谢物基本上被拆分，并且其中基本上被拆分的所述至少2种极性农药或代谢物具有大于1的分离度。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测器选自UV/VIS检测器、PDA检测器、荧光检测器、质谱仪、折射率检测器、蒸发光散射检测器和电雾式检测器。
18.一种套件，所述套件包括
(i)色谱系统，所述色谱系统包括
(a)柱，所述柱具有包含在所述柱内部的固定相材料，和
(b)检测器，和
(ii)说明书，所述说明书用于
(a)获得样品基质中包含至少一种极性农药或代谢物的样品；
(b)将所述样品引入到所述色谱系统；
(c)使用流动相洗脱液使所述样品流过所述柱，其中所述至少一种极性农药或代谢物基本上被拆分和保留，以及
(d)使用检测器来检测所述至少一种极性农药或代谢物。
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