CN110381943A - 用于治疗与重复不稳定性相关的疾病的方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了用于治疗由重复DNA不稳定性引起的疾病的方法。本文所述的方法可以抑制重复DNA的进一步扩增，在一些情况下，可以减小该重复DNA的大小(例如，减少重复数量)。
Description
技术领域
本公开内容一般性地涉及用于治疗与重复扩增相关的疾病的方法。
背景技术
基因特异性CAG/CTG三核苷酸重复扩增是由不稳定重复引起的多于40种神经退行性疾病中的至少16种的原因，包括亨廷顿病(HD)和强直性肌营养不良(DM1)。在受影响组织中发生的持续性重复扩增与发病年龄、严重程度和疾病进展相关。在同一个体的组织之间存在显著的重复长度变化，相差>5,000个重复，在心、大脑皮层和纹状体中扩增最多。个体的临床受影响组织中相当大量的扩增进一步将正在进行的体细胞扩增与疾病发作、严重程度和进展相关联。最近的研究表明，对于16种CAG疾病中的至少6种(HD、SCA1、SCA2、SCA3、SCA7和SCA17)，DNA修复蛋白是发病年龄的主要修饰因子(亨廷顿病的遗传修饰因子(GeM-HD)，Consortium,2015,Cell,162:516–526；Bettencourt等,2016,Annals Neurol.,印刷中)，进一步支持正在进行的体细胞扩增与发病年龄之间的相关性。这种关联可能适用于所有16种CAG疾病(每种都表现出体细胞扩增)及与重复不稳定性相关的其他疾病。
因此，用于阻止或逆转体细胞重复扩增的方法可以用于阻止或逆转疾病进展，并且在治疗环境中非常有益。
发明内容
本公开内容提供了用于治疗由重复DNA不稳定性引起的疾病的方法。本公开内容还提供了用于抑制重复DNA进一步扩增的方法，在一些情况下，还提供了用于减小经扩增的重复DNA的大小(例如，减少重复数量)的方法。
在一个方面，提供了抑制细胞中的重复DNA序列扩增的方法。这种方法通常包括使细胞与萘啶-氮杂喹诺酮(NA)接触。
在一些实施方案中，接触是在体内的。在一些实施方案中，接触步骤进行多次。在一些实施方案中，该方法还包括在接触步骤之前，确定重复DNA序列内的重复数量。在一些实施方案中，该方法还包括在接触步骤之后，确定重复DNA序列内的重复数量。
在一些实施方案中，使细胞与一定量的NA接触，NA的量取决于重复DNA序列内的重复数量。在一些实施方案中，NA是经修饰的NA。
在另一个方面，提供了减少个体基因组中的重复DNA序列内的重复数量的方法。这种方法通常包括向个体施用至少一剂量治疗量的萘啶-氮杂喹诺酮(NA)。
在一些实施方案中，将NA直接施用到受影响组织。在一些实施方案中，全身施用NA。在一些实施方案中，通过注射来施用。
在一些实施方案中，施用NA多次。在一些实施方案中，施用多剂量的NA。在一些实施方案中，该方法还包括多次重复施用步骤。
在一些实施方案中，NA的治疗量基于重复数量。在一些实施方案中，NA的治疗量为约0.01μM至约1M。
在一些实施方案中，该方法还包括鉴定具有重复DNA序列的个体。在一些实施方案中，该方法还包括确定来自个体的一个或更多个细胞中的重复数量。在一些实施方案中，该方法还包括监测来自个体的一个或更多个细胞中的重复数量。
在一些实施方案中，NA是经修饰的以增强其体内稳定性。在一些实施方案中，NA通过脂质体或颅内泵递送。
在又一个方面，提供了用于在个体中治疗或预防由重复DNA序列扩增引起的疾病的方法。这种方法通常包括向个体施用至少一剂量治疗量的萘啶-氮杂喹诺酮(NA)。
在一些实施方案中，这种方法还包括鉴定患有由重复DNA不稳定性引起的疾病的个体。由重复DNA序列扩增引起的代表性疾病包括但不限于亨廷顿病(HD)、亨廷顿病样疾病-2(HDL2)、强直性肌营养不良(DM1)、脊髓小脑共济失调1型(SCA1)、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA12、SCA17、脊髓延髓肌萎缩症(SBMA)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)、Fuch角膜内皮营养不良2(FECD2)、精神分裂症、双相障碍(KCNN3)和乳腺癌危险因子AIB1。
在一些实施方案中，在重复DNA序列扩增之前施用NA。在一些实施方案中，施用步骤在重复DNA序列扩增之前发生。在一些实施方案中，在出生前(在子宫内)向个体施用NA。在一些实施方案中，在重复DNA序列扩增之后向个体施用NA。
在一个方面，提供了用于治疗患有由经扩增的重复DNA序列引起的疾病的个体的方法。这种方法通常包括向个体施用至少一剂量治疗量的萘啶-氮杂喹诺酮(NA)。
在另一个方面，提供了减少个体中的重复DNA序列内的重复数量的方法。这种方法通常包括向个体施用至少一剂量治疗量的萘啶-氮杂喹诺酮(NA)。
在另一个方面，提供了抑制个体中重复DNA序列扩增的方法。这种方法通常包括向个体施用至少一剂量治疗量的萘啶-氮杂喹诺酮(NA)。
在一些实施方案中，施用到受影响组织。在一些实施方案中，通过注射来施用。在一些实施方案中，全身施用。
在一些实施方案中，施用治疗量的NA的剂量超过一次。在一些实施方案中，基于重复数量以剂量依赖性方式施用治疗量的NA的剂量。在一些实施方案中，治疗量的NA的剂量为约0.01μM至约1M。在一些实施方案中，本文所述的任何方法还包括多次重复施用步骤。
在一些实施方案中，本文所述的任何方法还包括鉴定患有由重复DNA不稳定性引起的疾病的个体。在一些实施方案中，本文所述的任何方法还包括鉴定具有重复扩增的个体。在一些实施方案中，本文所述的任何方法还包括确定个体细胞中的重复大小。在一些实施方案中，本文所述的任何方法还包括监测个体细胞中的重复大小。
在一些实施方案中，NA是经修饰的以增强其体内稳定性。在一些实施方案中，NA通过脂质体或颅内泵递送。
在一些实施方案中，由三核苷酸重复DNA不稳定性引起的疾病包括亨廷顿病(HD)、亨廷顿病样疾病-2(HDL2)、强直性肌营养不良(DM1)、脊髓小脑共济失调1型(SCA1)、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA12、SCA17、脊髓延髓肌萎缩症(SBMA)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)、Fuch角膜内皮营养不良2(FECD2)、精神分裂症、双相障碍(KCNN3)和乳腺癌危险因子AIB1。
除非另外限定，否则本文所用的所有技术术语和科学术语与本发明方法和组合物所属领域的普通技术人员通常理解的具有相同含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本发明的方法和组合物，但是下文描述了合适的方法和材料。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不旨在限制。本文所述的所有公开文献、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。
附图说明
图1A示出了萘啶-氮杂喹诺酮(NA)的结构。
图1B示出了使用NBD标记NA的化学反应。
图2为实验结果，示出了NA与长CAG脱落结合。图2的A图示出了NA的结构，包含两个杂环(萘啶(红色)和8-氮杂喹诺酮部分(蓝色))。图2的B图示出了NA-(CAG)·(CAG)三单元配合物的示意图。(CAG)n DNA序列(左)可折叠成发夹结构，其涉及错配的A-A对侧翼C-G碱基对(中间)。NA分子可以嵌入DNA螺旋中，其中2-氨基-1,8-二氮杂萘部分(红色)与鸟嘌呤氢键键合，8-氮杂喹诺酮部分(蓝色)与腺嘌呤氢键键合。图2的C图说明了NA与凝胶纯化的DNA片段结合，该片段在两条链中具有重复序列，在两条链上32P标记的CTG序列上游和下游侧接59bp和54bp的非重复DNA，其中重复序列为全双链形式的(CAG)50(CTG)50、(CAG)50(CTG)50上成簇的短脱落，来自(CAG)50(CTG)30的长(CTG)20脱落或来自(CAG)30(CTG)50的长(CTG)20脱落。长脱落挤出成来自(CAG)n(CTG)n的全碱基对骨架的单独脱落，如所述的(Pearson等,2002,Nuc.Acids Res.,30:4534-47)。将DNA与递增浓度的NA(0.15μM、0.75μM、7.5μM和50μM)混合，并在4％聚丙烯酰胺凝胶上解析。所有泳道均来自相同凝胶，为清楚起见将它们分离开。NA-DNA复合物用括号表示，游离DNA用箭头表示。对于线性和(CTG)20脱落DNA，没有NA结合(白色箭头)；在较高的NA浓度下，观察到成簇短脱落DNA减少(灰色箭头)，但是不可能定义明显的带移；对于(CTG)20脱落DNA(黑色箭头)，带移明显。图2的D图示出了NA结合的定量。以每种NA-DNA复合物的迁移距离与游离DNA迁移距离的比率测量线性和三种脱落底物的相对迁移。从孔到每条带的一致中心点测量迁移距离。对S-DNA底物进行密度测定分析。图表示出了三次独立实验的平均值和相应的标准偏差。图2的E图示出了对两条链上32P标记的经凝胶纯化的DNA异源双链片段及来自(CAG)50(CTG)30的长(CTG)20脱落进行热变性，在冰上快速冷却(以增强链内结构形成和抑制链间杂交)并在有或没有7.5μM NA下孵育(左图)。通过碱处理使相同DNA变性，然后在有或没有7.5μM NA下再杂交(右图)。然后将DNA在4％聚丙烯酰胺凝胶上解析。示意性地指出了每种DNA种类。与(CAG)50链(两图中)和异源双链(CAG)50(CTG)30(右图)形成的NA-DNA复合物用括号表示；游离DNA用箭头表示。在任一实验中，NA都不结合(CTG)30发夹片段(白色箭头)。应注意，NA不抑制互补链的再杂交。
图3示出了NA特异性抑制人细胞提取物(HeLa细胞)对长CAG脱落的修复。图4的A图为体外修复测定的示意图。起始DNA和修复产物释放含有重复序列的片段，其在PAGE上解析并通过Southern印迹和密度测定在摩尔水平下评估。在有或没有NA下修复含有长(CAG)20脱落(图3的B组)、长(CTG)20脱落(图3的C组)、单个CAG脱落(图3的D组)或单个GT错配(图3的E组)的不同DNA底物。从(CAG)50(CTG)30、(CAG)30(CTG)50或(CAG)50(CTG)49的杂交体制备脱落的DNA底物。如示意性所示，修复G-T错配重建HindIII限制性位点。图表示出了泳道中修复产物相对于所有含有重复序列的片段的修复效率百分比，值归一化为无NA效率。值代表三至五次独立实验的平均值±标准偏差。NA包涵体抑制长(CAG)20脱落的修复(图3的B图)，但不影响所有其他底物的修复效率(图3的C、D和E图)。
图4为实验结果，示出了HD患者细胞中NA细胞分布、无毒性和对重复不稳定性的影响。图4的A图示出了NA在具有(CAG)850的HT1080细胞模型中的细胞分布。NBD标记的NA(绿色)分布在整个细胞核和细胞质中。细胞核和细胞膜分别用DAPI(蓝色)和Cell Light质膜-RFP(红色)染色。比例尺代表20μm。图4的B图示出了经NA处理72小时的HT1080-(CAG)850细胞的细胞毒性。用WST-1测定评价细胞生存力。值代表三次独立测量值的平均值±SD。图4的C图示出了经或未经50μM NA处理的HT1080-(CAG)850细胞的生长曲线。误差条表示三次实验的SD。图4的D图和E图示出了通过HD重复序列的小池PCR分析重复序列不稳定性(参见表2)。直方图示出了在有或没有NA下生长40天后，具有(CAG)180的人HD原代成纤维细胞GM02191或具有(CAG)43的人HD原代成纤维细胞GM09197中的重复长度分布。重复等位基因的频率分布表示为灰色条。虚线表示峰CAG大小。等位基因长度按跨10个重复的区间进行分组。每组大小多于230个等位基因。通过将跨10个重复序列的区间中分组的等位基因数除以总等位基因数来计算重复序列的百分比。示出了3个独立实验的总结(参见图10和图11)。图4的G图和H图示出了在NA存在或不存在下孵育40天后HD成纤维细胞的平均重复序列大小。*P<0.001，Student's t检验。H图示出了HD成纤维细胞中CASK、HTT(正常等位基因)和Mfd15基因座的重复序列长度(在NA存在或不存在下孵育40天后)(参见图12A和图12C)。在任何这些未扩展的情况下均未观察到长度变化。
图5为实验结果，示出了NA诱导HT1080-(CAG)850细胞中的CAG收缩，不依赖于增殖而是依赖于rCAG转录。图5的A图示出了示意性转录泡，以及示出HT1080-(CAG)850细胞(初始细胞克隆和在有或没有NA下孵育30天后)的小池PCR CAG/CTG重复长度分析的代表性数据。左边的比例示出分子量标记(M)，其转换成具有相同大小的CAG重复片段的重复数。图5的B图为示出了HT1080-(CAG)850细胞中重复长度分布的直方图。不稳定等位基因的频率分布用灰色条表示。稳定等位基因的频率用黑色条表示。为了便于比较，虚线表示未经改变的CAG大小。等位基因长度按跨50个重复的区间进行分组。通过将跨50个重复的区间中的等位基因数除以总等位基因数来计算重复序列的百分比。每组的大小多于50个等位基因。通过卡方检验计算P值(表2)。示出了3次独立实验的总结(参见图10和图11)。图5的C图示出了在有或没有NA下孵育30天后HT1080-(CAG)850细胞中的平均重复大小变化。通过Student's t检验计算P值。D图示出了在经和未经NA处理的非增殖性HT1080-(CAG)850细胞中的重复长度分布，平均重复大小变化如下所示(也参见图15A和图15B)。NA仍有作用，证明其活性不依赖于细胞增殖。图5的E图示出了增殖的HT1080-(CAG)850细胞在有或没有NA下30天后不转录重复序列(图16A)。示出了重复长度分布和平均重复大小变化。NA没有效果，示出了对转录的依赖性。图5的F图示出了NA不阻断在整个扩展的CAG序列上的转录(也参见图10A和图10B)。经或未经NA(50μM)处理的HT1080-(CAG)850细胞中的转基因的RNA转录物水平(CAG方向的转录物)。使用TaqMan基因表达测定进行定量逆转录(RT)-PCR。NA(50μM)不影响含有转录物的CAG-重复序列的转录。数据为三次实验的平均值±SD。图5的G图示出了HT1080-(CAG)850细胞中CASK、ATXN8和Mfd15基因座的重复-序列长度(初始克隆和在有或没有NA下孵育30天后的细胞)。在HT1080-(CAG)850细胞的正常长度基因座的这些重复中没有观察到长度变化(在有或没有NA下孵育30天后)(也参见图12A和图12C)。
图6为实验结果，示出了NA诱导R6/2小鼠纹状体的CAG收缩。图6的A图为CAG长度的分析，并示出了经一次(小鼠i)、两次(小鼠ii和iii)或四次(小鼠iv、v、vi)NA注射的六只代表性R6/2小鼠纹状体的CAG重复长度的分布。将溶解在盐水中的NA注射到左纹状体(蓝色)中，仅向右纹状体(红色)注射盐水(参见图24)。NA不影响整个CAG转基因的转录(图15B)。图25A至图25H示出了所有经4次处理的小鼠。图6的B图示出了通过收缩和扩增不稳定指数反映的一次、两次或四次NA注射的效果，，如所计算的(Lee等,2010,BMC Syst.Biol.,4:29)(参见图27)。图6的C图示出了通过收缩和扩增的相对组成反映的一次、两次或四次NA注射的效果，如所计算的(参见图27)。图6的D图为CAG长度分析，示出了在四周内将NA注射到左侧纹状体中之后的一只代表性R6/2小鼠(小鼠vi)的纹状体、额叶皮层、小脑和尾部中CAG重复长度的分布。在NA之前(红色)和之后(绿色)从纹状体、额叶皮质和小脑(左侧(蓝色))和从尾部((红色)右侧)分离DNA。应注意，在经NA处理的纹状体的一半中的CAG重复短于尾部的遗传长度(基于尾部的CAG长度估计祖等位基因长度，因为该长度自出生后在小鼠的生命期内不变化，ePAL＝159)。在括号内显示重复大小变化，第一个数字表示在没有NA下相对于体细胞扩增的NA诱导收缩的主峰，第二个数字表示相对于遗传等位基因的收缩。这些括号不考虑纹状体中双峰分布的第二模式的大小变化(参见图25A至图25H)。图6的E图示出了D图中所示的各种组织的不稳定指数，其中红色和蓝色菱形分别代表经盐水处理/右侧和经NA处理/左侧的纹状体的值(参见图25A至图25H和图27B)。图6的F图示出了来自经四次注射的R6/2小鼠纹状体两侧的Mapkap1和Fgd4基因座的重复-序列长度(参见图12A和图12C)。在这些正常长度的重复中均没有观察到长度变化。
图7示出了经NA结合的CAG脱落的高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。将1pmol的具有长(CAG)20脱落的经凝胶纯化的DNA异源双链体(来自(CAG)50·(CTG)30，两条链上经32P标记)与递增浓度的NA(0.75μM、7.5μM、50μM、100μM、250μM、500μM、1000μM和1500μM)混合并在4％聚丙烯酰胺凝胶(左图)或8％聚丙烯酰胺凝胶(右图)上解析。NA-DNA复合物用括号表示，游离DNA用箭头表示。测量相对迁移率变化(Rm)(图表区)，作为每种NA-DNA复合物的迁移距离与游离DNA的迁移距离之比。用标尺测量从孔至每条带的一致中心点的迁移距离。直方图表示三次独立实验的平均值和相应的标准偏差。先前在其他DNA结合配体观察到，NA与(CAG)50(CTG)30结合引起带加宽(Nielsen等,1988,Biochem.,27:67-73；Barcelo等,1991,Biochem.,30:4863-73；Carlsson等,1995,Nuc.Acids Res.,23:2413-20；Fox等,1988,Nuc.Acids Res.,16:2489-507)。
图8示出了NA与其中一条链上没有重复(左图)或(CAG)n重复的DNA底物的结合，在共同链上进行32P标记。3、5、11或15个CAG重复的脱落从完全碱基配对的主链上挤出成单个脱落(参见上图，DNA序列和结构)。将1pmol的每种底物与递增浓度的NA(15μM和50μM)混合，并在4％聚丙烯酰胺凝胶上解析。所有泳道均来自相同的凝胶，为清楚起见将它们分开。NA-DNA复合物用括号表示，游离DNA用箭头表示。对于线性基底，没有NA结合(白色箭头)；在更高浓度的NA下，观察到短脱落DNA(3和5个重复)的小幅下降(灰色箭头)，但是不可能定义清晰的移位带；对于(CAG)11和(CAG)15脱落DNA(黑色箭头)，带移是明显的。测量相对迁移率变化(图表)，作为每种NA-DNA复合物的迁移距离与游离DNA迁移距离之比。测量从孔至每条带的一致中心点的迁移距离。直方图表示三次独立实验的平均值和相应的标准偏差。通过Student's t检验计算P值。
图9示出了NA不影响复制效率或复制叉进展，无论是否存在CAG/CTG序列或复制方向。在不使有或使有NA(7.5μM或15μM)处理下，含有SV40复制起点的三个环状质粒和经扩增的(CAG)79(CTG)79重复序列(pDM79EF和pDM79HF)或无重复序列(pKN16)在体外被人HeLa细胞提取物复制并添加重组SV40T-Ag。SV40-ori的位置决定了复制方向以及哪条链用作前导或滞后链模板。pDM79HF使用CAG链作为滞后链模板，而pDM79EF使用CTG链作为滞后链模板(凝胶板顶部的示意图)。纯化复制产物并用BamHI线性化。同样部分的反应材料也用BamHI和DpnI消化；DpnI消化未经复制和经部分复制的材料，如示意图所示(上图)。如前所述，在1％琼脂糖凝胶上对消化产物电泳以完全解析经复制和未经复制的材料(Panigrahi等,2002,J.Biol.Chem.,277:13926-34；Cleary等,2002,Nat.Genet.,31(1):37-46；下图)。用DpnI消化等量未经复制的质粒DNA并用溴化乙锭染色，以示出未经复制的质粒DNA的完全消化(下图)。I图，经溴化乙锭染色，II图，自动标记：标记物(泳道1)；DpnI未消化的质粒DNA(泳道2)；DpnI消化的未经复制的质粒DNA(泳道3-4)；经复制的质粒DNA，DpnI抗性(泳道5)。在所有三个测试模板(图III、IV和V)中，在有或没有NA下在复制之间没有观察到DpnI抗性材料的差异。
图10示出了NA对来自3次独立实验的具有(CAG)180扩增的HD成纤维细胞中重复不稳定性的影响的独立分析。在整个HD重复序列上的小池PCR用于评估重复不稳定性。直方图示出了在使有或不使用NA的情况下孵育40天后HD原代成纤维细胞中的重复长度分布。重复等位基因的频率分布表示为灰色条。虚线表示峰CAG大小。
图11示出了NA对来自3次独立实验的具有(CAG)43扩增的HD成纤维细胞中重复不稳定性的影响。在整个HD重复序列上的小池PCR用于评估重复不稳定性。直方图示出了在使有或不使用NA的情况下孵育40天后HD原代成纤维细胞中的重复长度分布。重复等位基因的频率分布表示为灰色条。虚线表示峰CAG大小。
图12为示出对HD原代成纤维细胞(图12中的A图)和HT1080-(CAG)850细胞(图12中的B图)中CASK的未扩增CAG/CTG重复长度进行超灵敏小池PCR的代表性数据。即使在spPCR高度敏感的突变检测能力下，在经NA处理的和未经处理的细胞中也未观察到长度变化。一些反应没有示出任何产物，这是小池PCR中使用的低基因组DNA模板稀释液的典型特征。在经或未经NA处理40天的HD患者成纤维细胞(图12的C图)中和在用NA或盐水四次注射的HDR6/2小鼠纹状体(图12的D图)中的TBP等位基因的非扩增CAG序列的重复长度变化性。通过Agilent BioAnalyzer分析重复长度。
图13示出了证明NA不是一般诱变剂的数据。为了评估NA处理是否作为CAG脱落以外的序列的一般诱变剂，利用单分子实时环状共有序列(SMRT-CCS)的高读取准确度和深度。对HPRT1基因(广泛用作诱导遗传变异的全局效应的替代指标)进行单分子测序。单分子测序可以检测频率低于0.5％的突变，没有假阳性。图13的A图为用于突变检测的HPRT1测序的示意图。简而言之，在相同条件下培养细胞，不同之处仅在于添加NA(50μM)或盐水，分离DNA，对HPRT1外显子2和3进行PCR扩增和测序。图13的B图为示出经NA处理和经盐水处理的样品之间的序列变化的比较图。我们选择比较来自经NA或盐水处理的雄性HD患者衍生细胞的个体X染色体连接的HPRT1等位基因(外显子2和3，2897个核苷酸)的单分子序列读取。以这种方式，每次读取代表单个单元。图表示出了用PacBio单分子长读取测序的经NA处理和经盐水处理的细胞的三个实验重复之间的相对突变率的序列变化的分布。比较多至2,402个体HPRT1等位基因未显示任何序列差异。尽管存在最小的序列变化，但在经NA和经盐水处理的细胞之间没有显著差异(p＝0.1083，双样品Kolmogorov-Smirnov检验)。C图示出SMRT长读取测序对于该应用是理想的，因为它可以在单个连续读取中对扩增子的整个长度进行测序，使用多次通过读取以产生高质量的共有序列。因此，单个重复之间不存在序列差异是NA不作为一般诱变剂的证据。
图14示出了NA对HT1080-(CAG)850的重复不稳定性的影响的独立分析，产生rCAG转录物。直方图示出了HT1080-(CAG)850细胞的重复长度分布。在三次独立实验中，在未经处理和经NA处理的细胞中通过小池PCR分析重复长度。不稳定等位基因的频率分布用灰色柱表示。稳定等位基因的频率用黑色柱表示。在每次实验中经NA处理的细胞中CAG长度序列的减少是明显的。为了便于比较，虚线表示起始未变化的CAG大小。通过卡方检验计算P值。
图15示出了NA对(CAG)850细胞的作用与增殖无关。测试NA对以与图4相同的间隔保持接触抑制的非增殖细胞的影响。图15的A图示出了接触抑制和血清饥饿停滞增殖，如在含BrdU的培养基中24小时之后通过BrdU阳性细胞占比测量的。图15的B图示出了直方图，其示出了在接触抑制下HT1080-(CAG)850细胞中的重复长度分布。在三次独立实验中，在未经处理和经NA处理的细胞中通过小池PCR分析重复长度。不稳定等位基因的频率分布用灰色柱表示。稳定等位基因的频率用黑色柱表示。NA的作用与细胞增殖无关。NA诱导接触抑制细胞中扩增重复向收缩转变(P<0.05)。为了便于比较，虚线表示未变化的CAG大小。通过卡方检验计算P值。
图16示出了NA不影响HTT的转录。图16的A图示出了HT1080-(CAG)850和HT1080-非转录(CAG)850细胞中转基因表达的RT-PCR分析。结果表明，在HT1080非转录细胞中不转录CAG重复序列，并且它整合为单一拷贝。链特异性RT-PCR(1周)。AttB-PhiC31系统已被广泛用于单一拷贝整合。图16的B图是通过定量实时逆转录酶(qRT)-PCR确定的，并归一化为U6RNA，表示为经NA处理与经PBS处理的R6/2纹状体之比。数据表示为三次试验的平均值±SD。
在R-环中没有观察到NA诱导的RNA组分替代，人们可能期望NA竞争性地结合远离R-环的RNA(图17E)。NA不能竞争与RNA重复结合可能是由于其与这些RNA的低结合。NA与一个重复长度的RNA(r(CAG)9)相互作用的研究(Li等,2016,Chem.Asian J.,11:1971-1981)。应注意，NA对RNA(CAG)9与DNA(CAG)9的亲和力相差数倍。此外，NA与d(CAG)9和r(CAG)9的结合化学计量是完全不同的。根据d(CAG)9(固定量为497RU)和r(CAG)9(524RU)的表面等离子体共振(SPR)测定，NA与d(CAG)9结合产生SPR强度的显著变化(140RU)，而对于r(CAG)9仅观察到不大的变化(8RU)。与r(CAG)9相比，电喷雾电离飞行时间质谱法清楚地表明NA对d(CAG)9的亲和力高得多。由于NA与d(CAG)9和r(CAG)9结合的化学计量模糊，因此在科学上难以准确测量NA与d(CAG)9和r(CAG)9结合的结合常数。此外，所有这些实验都是在体外进行的，其中缓冲溶液中只有核酸和NA。似乎合理的是在细胞中NA与r(CAG)9的结合没有显著效果。NA与RNA重复的强结合的缺失与其不能从R环竞争RNA一致(图17E)。
图17为实验结果，其示出了NA不影响转录、R-环形成、RNA酶加工或R-环生物物理稳定性。图17的A图为在经或未经NA(50μM)处理的HT1080-(CAG)850细胞中转基因的RNA转录物水平(CAG方向上的转录物)的图。使用TaqMan基因表达测定进行定量逆转录(RT)-PCR。NA(50μM)不影响含有转录物的CAG-重复序列的转录。数据为三次实验的平均值±SD。图17的B图为R-环形成和加工的示意图。箭头确认其中NA可破坏转录、R-环形成、RNA酶A/H消化、R-环生物物理稳定性或R-环加工的步骤，如分别在图17的A、D、C和E图中测试的。图17的C图示出了携带(CAG)79(CTG)79重复的质粒，其是在有或没有NA(120μM)下用T3或T7RNA聚合酶在任一链上体外转录的。然后用RNA酶A(标记为“A”)处理反应产物，以切割所有单链RNA，并在1％琼脂糖凝胶上解析。用RNA酶H(标记为“H”)进行对照处理(消除RNA:DNA杂交体)以显示无RNA的超螺旋DNA。转录期间存在NA(50μM)不影响R-环形成。图17的D图示出了使用T3或T7RNA聚合酶转录产物进行含有(CAG)79(CTG)79重复的扩增序列的超螺旋质粒的体外转录，并在有或没有NA(120μM)下用RNA酶A(标记为“A”)处理或用RNA酶A和RNA酶H(标记为“H”)处理。然后将反应产物在1％琼脂糖凝胶上解析。NA(50μM)不影响RNA酶A对ssRNA的切割，NA也不影响RNA酶H对RNA:DNA杂交体的加工。图17的E图示出了用T3和T7RNA聚合酶在两条链的整个重复上体外转录具有(CAG)79(CTG)79的超螺旋DNA(泳道1)以产生双R环。然后用RNA酶A或H(标记为“A”或“H”)处理双R环，并与NA(50μM)一起孵育。然后将反应产物在1％琼脂糖凝胶上解析。用RNA酶A和RNA酶H处理(标记为“H”)(泳道5)和用单独超螺旋质粒处理(泳道6)的双R-环的对照反应不被NA(500μM，未示出)改变。超螺旋质粒在二聚体或单体形式中的位置用“SC”表示。顶部“SC”表示连接的二聚体，底部“SC”表示单体。在C、D和E图中，NA仅包括在转录反应(C图)中，仅在RNA酶A/H反应中，仅在RNA酶A/H清除后。NA不抑制转录、R-环形成、通过RNA酶A/H的R-环消化或破坏R-环的RNA。
图18示出了NA对R-环形成、加工和不稳定性的影响。图18的A图示出了用T3和T7RNA聚合酶在两条链的重复序列上体外转录具有(CAG)79·(CTG)79的超螺旋DNA(泳道1)以产生双R环。然后用RNA酶A或H(标记为“A”或“H”)处理双R环，并与50μM NA一起孵育。然后将反应产物在1％琼脂糖凝胶上解析。在更高的NA浓度下，R-环涂片减少(泳道4)。用RNA酶A和RNA酶H处理(标记为“H”)(泳道5)和用单独超螺旋质粒处理(泳道6)的双R-环的对照反应不被更高浓度的NA改变。超螺旋质粒在二聚体或单体形式中的位置用“SC”表示。图18的B图为R-环形成、加工和分析的示意图。如所述的，在有或没有NA(50μM)下，通过末端分化(视黄酸)人神经元样细胞提取物(SH-SY5Y)处理预形成的双R-环，通过STRIP测定的DNA重复长度被评估为扩增、收缩或稳定。图18的C图为示出了STRIP分析的代表性实例的图。在大肠杆菌细胞中分离、加工和转化转录产物，之前显示稳定维持(CAG)79(CTG)79长度。用限制酶消化从单个细菌菌落中分离质粒以释放含有重复序列的片段，在4％聚丙烯酰胺凝胶上解析并针对不稳定性进行评分。
图19示出了NA可以诱导扩增的CAG序列收缩的潜在机制。图19的A图示出了在具有CTG DNA模板链的杂交体中用r(CAG)n转录诱导的R-环形成取代CAG链，使其可以被NA结合。NA可以结合不同的量，产生更短或更长的发夹。在R-环处形成或在RNA去除后在再退火的DNA链上形成的链内DNA重复结构可以通过不清楚的机制进行处理以重复扩增和收缩。脱落的CAG和脱落的CTG重复分别主要在无规卷曲和发夹构象中。处理R环后的重复不稳定性已经显示通过从R环形成脱落的DNA以及随后的异常修复而发生((Panigrahi等,2010,PNASUSA,107:12593-9)。在rCAG-dCTG R-环形成期间，NA可以结合在取代的dCAG链上形成的链内发夹并且可能进一步延伸这些发夹，如图2的D图所示。图19的B图示出了，类似地，NA可以结合在去除RNA后由DNA链的非寄生再退火形成的CAG脱落(图19的B图)。这些NA结合结构可能扩增期间将加工转变为收缩。脱落的CAG/CTG重复的加工是复杂的，并且已经表明涉及未知核酸酶的多个核酸内切酶切口(参见图19的B图中的箭头)(Hou等,2009,NatureStruct.&Mol.Biol.,16:869-75；Pluciennik等,2013,PNAS USA,110:12277-82)。NA还可以结合单链(CAG)10重复的缺口，其可以在去除CTG脱落期间出现。NA阻断(CAG)20脱落的修复与人和其他DNA聚合酶不能沿NA结合(CAG)10模板延伸引物一致。这些结果表明NA对转录增强的重复不稳定性的影响可能由NA扰动R-环加工引起。
图20示出了在室温下在含有10mM Hepes-KOH pH 7.5、110mM KCl、1mM EDTA和1mMDTT的缓冲液中允许MutSβ结合含有(CAG)20的单一脱落的放射标记的脱落DNA(30分钟)。如前所述，在该反应中添加ATP(+/-Mg+)破坏MutSβ与DNA的结合。NA的添加对MutSβ与该底物的结合或解离没有影响。
图21示出了超螺旋DNA、线性DNA和转录诱导的R-环的FAN1切割。将含有(CAG)79(CTG)79重复序列的超螺旋质粒用BamHI线性化，然后在37℃下用200nM FAN1孵育15分钟(左图，前两条泳道)。用200nM FAN1直接处理相同的超螺旋质粒(左图，第二两条泳道)。用T3RNA聚合酶在整个CTG链上体外转录相同的质粒(中图)。然后用RNA酶A处理转录反应产物，以切割所有单链RNA，或用RNA酶A和RNA酶H以消除RNA:DNA杂交体。通过用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，v/v/v)萃取和乙醇沉淀来纯化这些反应，并在37℃下用200nM FAN1孵育15分钟(右图)。所有反应产物在1x TBE缓冲液中在80V下运行3小时在1％琼脂糖凝胶上进行分析。随后用溴化乙锭(0.5mg/ml)对凝胶进行染色，以允许在紫外(UV)光下观察总核酸。FAN1切割超螺旋和线性DNA(左图)，以及转录诱导的含DNA的R环，释放超螺旋依赖性RNA部分(右图)。超螺旋质粒在单体或多聚体形式中的位置用“SC”表示。“OC”表示开放式环形。“LN”表示线性化质粒。
图22示出了通过在瓣-DNA(flap-DNA)底物中存在CAG发夹改变FAN1切割，并且该活性受到结合CAG发夹的NA的抑制。瓣-DNA底物(参见图22的D至F图中的序列)示意性地示于上图中：不具有重复序列的5'-瓣DNA(图22的A图)，瓣中具有(CAG)20重复的5'-瓣DNA(图22的B图)，在双链区域中具有(CAG)20重复的5'-瓣DNA(图22的C图)。所有DNA结构均在瓣链的5'末端进行32P放射性标记。将1pmol的每种底物用递增浓度的NA(7.5μM、15μM、50μM)一起孵育，然后用200nM FAN1处理。在天然8％聚丙烯酰胺凝胶上在200V下分析核酸酶反应1小时。通过光密度分析对消化产物的量定量。所有泳道均来自相同的凝胶，为清楚起见将它们分开。直方图表示三次独立实验的平均值和相应的标准偏差。为了绘制FAN1消化位点，在8％变性凝胶上分离反应产物，以及Maxam-Gilbert测序反应。切割位点用箭头表示(从白色到黑色表示增加的消化功效)。不同的消化片段用字母(a、b、c)表示。“s”表示起始底物；“s+NA”表示由于NA与CAG脱落结合而移位的底物。切割位点由相对于DNA末端的核苷酸位置、连接点或重复单元数表示。图22的D至F图：针对三种底物绘制切割位点；图22的D图对应于图22的A图；图22的E图对应于图22的B图；图22的F图对应于图22的C图。
图23示出了NA与RPA结合竞争并阻断沿CAG模板的polδ的增强进展。图23的A图示出了RPA(250nM)与含有(CAG)20脱落的DNA底物的结合(泳道2)，在两条链上32P标记(在上方示意性表示)。在添加RPA之前，用NA(50μM)在室温下将底物孵育10分钟。NA与RPA竞争结合(CAG)20底物(泳道3)。通过光密度分析对与RPA结合的DNA的百分比进行定量。直方图表示三次独立实验的平均值和相应的标准偏差。图23的B图示出了如前所述进行聚合酶延伸测定。用0.1μM32P标记的引物将0.1μM(CAG)10模板寡核苷酸退火，并在室温下用或不用NA(50μM)孵育30分钟。向反应中添加250nM RPA和/或20nM Polδ，并在37℃下孵育15分钟。将反应产物在6％测序凝胶上分离，再进行Maxam-Gilbert测序反应(泳道1)。引物仅在泳道2中。单独的Polδ不能通过CAG序列合成(泳道3)，但其活性通过添加RPA(泳道4)而增强。NA阻断polδ沿CAG模板的增强进展(泳道5和6)，该结果与NA针对CAG序列的RPA竞争性结合一致。图23的C图示出了通过聚合酶不能在整个NA结合的CAG模板上合成来实现NA诱导的收缩的可能机制的示意图。
图24示出了R6/2HD小鼠的NA和盐水注射方案。
图25示出了4次注射处理的10只小鼠中的8只小鼠的纹状体、皮质、小脑和尾部的CAG重复长度分析和不稳定性指数(小鼠vi至xii)(图25的A至H图)。其他两只小鼠(小鼠iv和v)的CAG扫描示于图6A。
图26示出了组织学研究，小鼠纹状体，使用盐水、盐水中的NA或无注射，然后进行H&E染色。
图27示出了经NA处理的纹状体中的大多数(如果不是全部)等位基因都发生了重复序列收缩，表明NA已经影响了大多数细胞。图27的A图示出了使用已建立的方法从CAG重复大小的基因扫描迹线定量体细胞“不稳定性指数”。该计算使用相对高度阈值校正背景并有效地归一化数据，产生“不稳定性指数”，其表示从细胞群中每个细胞的主要等位基因的平均CAG长度变化：更大的指数反映更大的扩增，更低的指数反映更低的扩增。用NA和不用NA处理的纹状体的分析示出随着随后1、2和4次施用NA注射而逐渐降低的不稳定性指数(图6B，25A至25H图)。图B示出了用NA处理4次的所有10只小鼠的不稳定性指数。用NA处理4次的纹状体的重复大小分布与模拟处理的纹状体显著不同(Mann-Whitney，p＝0.00035)。如上所述，相对峰高校正允许量化收缩和扩增指数以及收缩/扩增峰的相对组成，两者都表明随后用NA处理的收缩增加。NA的作用局限于注射部位，因为来自具有纹状体内注射的相同小鼠的大脑皮层和小脑中的CAG序列在左、右侧显示出相同的CAG长度异质性模式(图6C至6D，25A至25H图)。
图28示出了用于确认NBD标记的NA的结构的NMR数据。
发明详述
特异性靶向遗传上不稳定的致病重复DNA序列的小分子，或由于这些序列而形成的结构，可以具有控制其遗传不稳定性的潜力，因为持续的体细胞重复扩增可以导致疾病发作和进展。设计用于治疗应用的配体必须在突变等位基因的高特异性下结合其靶标，并且阻止扩增或诱导收缩而几乎没有总体毒性。本公开内容描述了设计用于特异性结合脱落CAG/CTG重复结构的小分子(Nakatani等,2005,Nat.Chem.Biol.,1:39-43；Hagihara等,2006,Nuc.Acids Symp.Ser.(Oxf.),50:147-8；和Hagihara等,2011,Chembiochem.,12:1686-9)，改变经扩增的重复序列的不稳定性，从而导致重复收缩。本公开内容描述了特异性减少重复扩增的第一潜在疗法。具体地，本文中报道了NA可以阻止扩增，其可以减缓或阻止疾病发作、进展或严重程度，以及诱导扩增重复的收缩，甚至可能低于遗传长度。
本公开内容描述了用于在个体中减少三核苷酸重复DNA序列内三核苷酸重复序列数量的方法。本公开内容还描述了可以用于在个体中抑制三核苷酸重复DNA序列的扩增或进一步扩增的方法。本文所述的方法可以用于治疗患有由三核苷酸重复DNA不稳定性引起的疾病的个体。如本文所用，治疗由三核苷酸重复DNA不稳定性引起的疾病可以是指阻止或停止扩增的进展，因此阻止或停止与三核苷酸重复DNA序列的扩增相关的症状。同样，如本文所用，治疗由三核苷酸重复DNA不稳定性引起的疾病可以是指疾病的逆转进展。例如，如果三核苷酸重复DNA序列中的三核苷酸重复数量可以减少到阈值数或低于阈值数，则可以停止或预防与疾病相关的症状，或者鉴于早期干预，甚至可以在某种程度上逆转(例如，在细胞和组织显著变性之前)。
本文所述的方法包括向个体施用至少一剂量治疗量的萘啶-氮杂喹诺酮(NA)。NA由2-氨基-1,8-二氮杂萘部分和8-氮杂喹诺酮部分组成(参见例如图1A)。两分子NA嵌入DNA螺旋中，2-氨基-1,8-二氮杂萘部分可以用于与鸟嘌呤氢键结合，8-氮杂喹诺酮部分可以用于与腺嘌呤氢键结合，导致两个胞嘧啶被挤出或推出螺旋。不受任何特定理论的束缚，本文呈现的结果表明NA在突变体重复的转录期间在有丝分裂后细胞中起作用，对扩增突变体等位基因是特异性的，并且通过调节CAG脱落的修复来介导。
由三核苷酸重复不稳定性引起的疾病在本领域中是已知的，并且目前已知有数十种。可以用本文所述的NA治疗的三核苷酸重复不稳定性疾病包括与CAG/CTG三核苷酸重复相关的疾病。这种疾病包括但不限于亨廷顿病(HD)、亨廷顿病样疾病-2(HDL2)、强直性肌营养不良(DM1)、脊髓小脑共济失调1型(SCA1)、SCA2、SCA3、SCA4、SCA6、SCA7、SCA8、SCA12、SCA17、脊髓延髓肌萎缩症(SBMA)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)、Fuch角膜内皮营养不良2(FECD2)、精神分裂症、双相障碍(KCNN3)和乳腺癌危险因子AIB1(也被称为NCOA3、SRC-3、ACTR、pCIP、RAC3和TRAM1)。患有由三核苷酸重复DNA不稳定性引起的疾病的个体通常使用遗传分析(例如，PCR扩增、测序、限制性消化分析、限制性片段长度多态性)来鉴定以确定重复的大小(例如，三核苷酸重复数量)和/或经扩增的区域的存在(例如，扩增)。
NA可以与可药用载体一起配制用于以治疗(或有效)量向个体递送。具体的制剂和治疗量取决于多种因素，包括施用途径；NA的剂量和给药间隔；待治疗个体的性别、年龄和体重；痛苦的严重程度以及个人医生的判断。
确定给定组织(骨骼肌、心脏、大脑区域等)中体细胞扩增的发育时间可以以预防体细胞扩增开始和/或更容易引起长度收缩至更接近未受影响长度的方式增强施用NA的能力。
如本文所用，“可药用载体”旨在包括与施用相容的任何和所有赋形剂、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。使用这些介质和试剂用于可药用载体是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与化合物不相容，否则考虑使用它们。
用于递送化合物的可药用载体是本领域熟知的。参见，例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,University of the Sciences in Philadelphia,Ed.,21st Edition,2005,Lippincott Williams&Wilkins；and The PharmacologicalBasis of Therapeutics,Goodman and Gilman,Eds.,12th Ed.,2001,McGraw-Hill Co.。在特定制剂中使用的可药用载体的类型可以取决于各种因素，例如，化合物的物理和化学性质，给药途径和制造方法。可药用载体是本领域可获得的，包括在各种药典中列出的那些。参见，例如U.S.Pharmacopeia(USP)，Japanese Pharmacopoeia(JP)，EuropeanPharmacopoeia(EP)和British pharmacopeia(BP)；美国食品和药物管理局(FDA)药物评估和研究中心(CDER)出版物(例如，非活性成分指南(1996))；和Ash和Ash，Eds。(2002)Handbook of Pharmaceutical Additives，Synapse Information Resources，Inc.，Endicott，NY。
包含如本文所述的NA的药物组合物通常配制成与其预期的施用途径相容。合适的施用途径包括例如经口、经直肠、局部、经鼻、经肺、经眼经肠和肠胃外施用。肠胃外施用途径包括静脉内、肌内和皮下施用，以及腹膜内、动脉内、关节内、心内、脑池内、皮内、病灶内、眼内、胸膜内、鞘内、子宫内和脑室内施用。
举例来说，对于静脉内注射，可以使用生理学上相容的缓冲液将NA配制成水溶液，缓冲液包括例如用于调节制剂pH的磷酸盐、组氨酸或柠檬酸盐，和张力剂，例如，氯化钠或葡萄糖。对于经口施用，NA可以配制成液体或固体剂型，并且还配制成速释或控释/持续释放制剂。用于个体经口摄取的合适形式包括片剂、丸剂、硬壳和软壳胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液、混悬剂和乳剂。可以使用赋形剂获得固体经口剂型，赋形剂可以包括填充剂、崩解剂、粘合剂(干和湿)、溶解阻滞剂、润滑剂、助流剂、抗粘合剂、阳离子交换树脂、润湿剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂和调味剂。这些赋形剂的实例包括纤维素衍生物、柠檬酸、磷酸二钙、明胶、碳酸镁、十二烷基硫酸镁/钠、甘露醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸盐、二氧化硅、苯甲酸钠、山梨糖醇、淀粉、硬脂酸或其盐、糖(例如右旋糖、蔗糖、乳糖)、滑石粉、黄蓍胶粘液、植物油(氢化的)和蜡。
NA可以局部施用，例如通过皮肤贴剂、半固体或液体制剂，例如凝胶剂、(微)乳剂、软膏剂、溶液剂、(纳米/微米)混悬剂或泡沫剂。例如，使用渗透增强剂可以调节NA渗透到皮肤和下面受影响组织中；适当选择和组合亲脂性、亲水性和两亲性赋形剂，包括水、有机溶剂、蜡、油、合成和天然聚合物、表面活性剂、乳化剂；通过pH调节；和/或使用络合剂。
可以向患有由三核苷酸重复DNA不稳定性引起的疾病的个体施用治疗量的NA。通常，NA的治疗量或剂量是指导致阻滞体细胞扩增或者三核苷酸重复DNA序列的遗传大小减少(例如，三核苷酸重复数量减少)的NA的量，并且最终，减轻或改善一种或多种症状而不引起任何不良反应。在一些情况下，治疗量与存在的重复数量相关。NA的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准制药方法来确定，例如通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果的剂量比是治疗指数，其可表示为LD50/ED50比。
治疗量的NA可以以单一剂量(即，一次性剂量)施用，或者治疗量的NA可以以多于一剂量(即，多次)施用或甚至以缓慢连续的方式施用，例如，使用泵或贴剂。如本文所用，治疗量的NA是指约0.01μM至约1M(例如，约0.05μM至约0.75M；约0.1μM至约0.5M；约0.5μM至约0.1M；约1μM至约50mM；约50μM至约1mM；或约100μM至约0.5mM)NA。在一些实施方案中，如本文所述的组合物中NA的浓度可以为约1％至约50％(例如，约5％至约40％；约10％至约30％；约15％至约25％；或约20％)。在一些情况下，NA可以以剂量依赖性方式施用，这取决于人遗传的三核苷酸重复的数量，或给定组织中体细胞扩增的速率。应理解，根据疾病、症状的严重程度和三核苷酸重复的数量，可以每周一次，每月一次，一年一次，或根据需要更频繁或更少施用治疗量的NA(例如，以一个或多个剂量)(例如，长期使用颅内泵)。
还应理解，鉴于在几种三核苷酸重复疾病中表现出组织特异性扩增，治疗量的NA可能对于同一个体内的不同组织而不同。例如，在HD中，表现出最大扩增(例如，最大扩增、最快速扩增或其组合)的主要组织包括纹状体、大脑皮质、基底神经节、中型多刺神经元和雄性生殖细胞；在I型强直性肌营养不良中，表现出扩增的主要体细胞组织包括脑、心脏和大脑皮层。对于DM1，参见，例如，Lopez Castel等(2011,Hum.Mol.Genet.,20:1-15)和Seriola等(2011,Hum.Mol.Genet.,20:176-85)；对于亨廷顿病，参见例如De Rooij等(1995,Hum.Genet.,95:270-4)和Telenius等(1994,Nat.Genet.,6:409-14)；对于DRPLA，参见例如Aoki等(1996,Clin.Genet.,50:199-201)；对于脊髓延髓肌萎缩症(SBMA)，参见例如Tanaka等(1996,J.Neurol.Sci.,135:43-50)；对于SCA1和SCA3，参见例如Cancel等(1998,Hum.Mutat.,11:23-7)；对于SCA7，参见例如Yoon等(2016,Brain,139(Pt 3):e20)，参见Cleary&Pearson(2003,Cytogenet.Genome Res.,100:25-55)，Abeliovich等(1993,Am.J.Hum.Genet.,52:1175-81)，Wohrle等(1995,Hum.Mol.Genet.,4:1147-53)，Peterlin等(1996,Pflugers Arch.,431(6Suppl 2):R199-200)，Anvret等(1993,Hum.Mol.Genet.,2:1397-400)，Thornton等(1994,Ann.Neurol.,35:104-7)和Ishii等(1996,Hum.Genet.,98:138-40).
本文所述的方法还可以包括监测已经接受NA的个体的步骤。例如，使用本领域的常规方法(例如，PCR扩增、测序、限制性消化分析、限制性片段长度多态性)，可以在来自个体的细胞中监测三核苷酸重复的大小。监测步骤可以以所需频率发生；例如，可以以与施用NA相同的频率(例如，在施用NA之前或之后)监测个体或来自个体的一个或多个组织的细胞，或者可以以另一个期望的频率监测(例如，每周、每月或每年)。在一些情况下，监测步骤的结果可以确定或帮助确定需要治疗的组织、治疗量和/或向个体(或者组织)递送治疗量的适当频率。
应理解，NA可以以多种方式进行修饰，以在体内增加其稳定性、组织选择性、摄取或其组合。在一些情况下，NA可以通过例如脂质体、颅内泵、肌内扩散、血脑屏障“关键”或在向受影响细胞/组织施用和递送期间稳定和/或提供对NA的保护的其他制剂。
根据本发明，可以使用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学、生物化学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分说明。在以下实施例中将进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的方法和物质组合物的范围。
实施例
实施例1 NA-CAG/CAG复合物的表征
以前的NA-CAG表征使用UV-熔融、电喷雾电离飞行时间质谱(ESI-TOF MS)、等温滴定量热法(ITC)、表面等离子体共振(SPR)测定、圆二色(CD)光谱术、SPR成像测定和核磁共振(NMR)光谱术(Hagihara等,2006,Nuc.Acids Symp.Ser.(Oxf.),50:147-8；Nakatani等2005,Nat.Chem.Biol.,1:39-43；Hagihara等,2011,Chem.Bio.Chem.,12:1686-9)。这些研究揭示了扭曲的链内发夹的独特NA-(CAG)(CAG)结构。NA的萘啶和氮杂喹诺酮部分分别表现出与鸟嘌呤和腺嘌呤的互补氢键，导致两个胞嘧啶碱基从CAG发夹上脱落(图2A和图2B)。估计每个NA分子/CAG-CAG的亲和力为Ka 0.5×106M-1或Kd 0.56×106M(Hagihara等,2006,Nuc.Acids Symp.Ser.(Oxf.),50:147-8)。在50μM NA下，NA将(CAG)10发夹的熔化温度从47.1(±0.7)℃增加到78.8(±0.1)℃，超过(CAG)10发夹的熔化温度(54.4(±0.3)℃)。通过ESI-TOF MS证实，通过多次NA(至少6个NA分子)与重复结合，诱导d(CAG)10的大结构变化(通过CD光谱术和SPR成像测定显示的)。对于具有(CAG)10-30的分离的短寡核苷酸的更长重复增加的NA结合(Nakatani等,2005,Nat.Chem.Biol.,1:39-43)。通过NMR光谱术确定NA-CAG/CAG结合结构，将该结构保藏在蛋白质数据库(PDB)中并指定登录号1X26。这些特征解释了NA对CAG发夹的显著选择性；序列和发夹特异性都可能靶向CAG/CTG扩增等位基因。
实施例2-NA合成和标记
溶剂和原料由标准供应商购买并且无需进一步纯化即可使用。在具有F254指示剂的涂覆有0.2mm二氧化硅60的板上进行分析型薄层色谱术(TLC)。在Wako凝胶C-200硅胶上进行快速柱色谱术。高效液相色谱术(HPLC)通过Gilson 811C Dynamic Mixer系统进行，其中UV检测器设定在254nm，使用Cosmosil 5C18-MS-II柱(150×20mm)，0.1％HOAc/H2O(溶剂A)和MeCN(溶剂B)的双溶剂系统。除非另有说明，否则核磁共振(NMR)光谱在Bruker AvanceIII 700光谱仪上在21±3℃下记录。化学位移(δ)以百万分率(ppm)报告。赫兹报道了偶合常数(J)。在CD3OD-d4中，1H NMR化学位移参考3.31ppm处的残留溶剂峰。对于CD3OD，13C NMR化学位移参考3.31ppm处的中心溶剂峰。在Thermo LTQ Orbitrap XL质谱仪上记录ESI质谱。
4-氨基-N-(3-((3-((7-甲基-1,8-萘啶-2-基)氨基)-3-氧代丙基)(3-氧代-3-(((7-氧代7,8-二氢-1,8-萘啶-2-基)甲基)氨基)丙基)氨基)丙基)丁酰胺(NA-接头)
将NA(40mg，0.09mmol)和叔丁基-(4-氧代-4-((3-氧代丙基)氨基)丁基)氨基甲酸酯(34mg，0.13mmol)在甲醇(2mL)中搅拌。添加乙酸以将混合物的pH调节至约6。然后，向混合物中添加三乙酰氧基硼氢化钠(31mg，0.13mmol)。将混合物在室温下搅拌12小时。将溶剂蒸发至干燥，残余物通过用氯仿：甲醇＝50：1洗脱的硅胶柱色谱术纯化，以得到Boc-NA-接头(15mg，25％)，浅黄色固体。向在氯仿(1mL)中的Boc-NA-接头(15mg，0.02mmol)溶液中添加含有4M HCl(0.5mL)的乙酸乙酯，将反应混合物在室温下搅拌0.5小时。将溶剂蒸发至干燥。残余物通过HPLC进一步纯化，以得到NA-接头(11mg，86％)，白色固体。1H NMR(CD3OD,700MHz):δ＝8.20(d,J＝8.6Hz,1H),8.06(dd,J＝8.4,2.4Hz,2H),7.76-7.60(m,2H),7.33(d,J＝8.2Hz,1H),7.02(d,J＝7.7Hz,1H),6.43(d,J＝9.5Hz,1H),4.42(s,2H),3.26(t,J＝6.9Hz,2H),3.01(t,J＝7.3Hz,2H),2.92(t,J＝6.0Hz,2H),2.87(t,J＝6.0Hz,2H),2.70(t,J＝6.0Hz,2H),2.69(s,3H),2.63(t,J＝7.1Hz,2H),2.56(t,J＝6.0Hz,2H),2.37(t,J＝6.9Hz,2H),1.93(t,J＝7.3Hz,2H),1.76(t,J＝7.1Hz,2H).13C NMR(CD3OD,175MHz):δ＝175.4,174.1,173.2,172.9,164.4,162.8,159.8,153.7,153.6,148.3,139.5,138.8,137.3,136.6,121.5,120.9,118.3,115.8,114.1,113.1,51.3,50.4,49.4,44.3,39.0,37.2,34.5,33.7,32.4,26.3,23.6,23.0.HRMS(ESI)m/z:[C31H39N9O4+Na]+的计算值,624.3024；实测值：624.3010。
N-(4-((3-((3-((7-甲基-1,8-萘啶-2-基)氨基)-3-氧代丙基)(3-氧代-3-(((7-氧代7,8-二氢-1,8-萘啶-2-基)甲基)氨基)丙基)氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁基)-6-((7-硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑-4-基)氨基)己酰胺(NA-NBD)
将NA-接头(15mg，0.02mmol)和NBD-X、SE(琥珀酰亚胺基6-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)己酸酯)(12mg，0.03mmol)在二甲基甲酰胺(3mL)中搅拌。然后，向混合物中添加三乙胺(5mg，0.05mmol)。将混合物在室温下搅拌6小时。将蒸发溶剂至干燥，残余物通过用氯仿:甲醇＝20:1洗脱的硅胶柱层析纯化，以得到粗产物。通过HPLC进一步纯化粗产物，以得到NA-NBD(13mg，59％)，白色固体。1H NMR(CD3OD,700MHz):δ＝8.41(d,J＝8.6Hz,1H),8.18(bs,1H),8.04(q,J＝8.3Hz,2H),7.73(d,J＝8.2Hz,1H),7.66(d,J＝9.5Hz,1H),7.29(d,J＝8.2Hz,1H),7.02(d,J＝8.2Hz,1H),6.44(d,J＝9.5Hz,1H),6.22(d,J＝9.0Hz,1H),4.43(s,2H),3.44(s,2H),3.26(t,J＝6.9Hz,2H),3.14(t,J＝7.1Hz,2H),3.09-2.97(4H),2.77(s,4H),2.66(s,3H),2.64(t,J＝6.3Hz,2H),2.18(t,J＝7.5Hz,4H),1.83(t,J＝7.1Hz,2H),1.76-1.70(4H),1.65(t,J＝7.5Hz,2H),1.47-1.37(2H).13C NMR(CD3OD,175MHz):δ＝174.6,174.2,174.1,173.5,172.3,164.4,162.8,159.8,153.7,153.6,148.3,145.1,144.4,144.0,139.5,138.7,137.2,136.6,121.4,121.0,118.3,115.8,114.2,113.1,98.1,51.2,50.0,49.3,44.3,43.1,38.5,38.3,36.9,35.4,33.5,33.0,32.6,27.5,26.1,25.8,25.4,25.1,23.6.HRMS(ESI)m/z[C43H51N13O8+Na]+的计算值，900.3883；实测值：900.3875。
这些反应示于图1B中，带NBD标记的NA的结构通过NMR证实(图28)。
实施例3-细胞培养
先前描述了HT1080-(CAG)850细胞模型的构建(Sathasivam等,1997,Hum.Genet.,99:692-5)。简而言之，HT1080(ATCC)人纤维肉瘤细胞用含有800-850(CTG)(CAG)重复序列的质粒(LC15-R)和编码PhiC31整合酶的质粒共转染(Nakatani等,2005,Nat.Chem.Biol.,1:39-43)。用Nucleofector(Lonza，Basel，Switzerland)进行转染，并用嘌呤霉素选择经稳定转染的克隆。通过转染从pLC16修饰(通过在重复序列的下游添加SV40多腺苷酸化信号而不是LC15-R)的质粒建立了HT1080非转录(CAG)850细胞模型。通过转染从pLC16修饰通过在重复序列的下游插入另外的SV40多腺苷酸化信号(除了位于重复序列上游的原始多腺苷酸化信号之外)修饰质粒来建立HT1080非转录(CAG)850细胞模型，以使CAG/CTG重复被转录终止子元件侧装接。AttB-PhiC31系统已广泛用于单拷贝整合。如所预期的，该AttB-PhiC31介导的整合导致证实的转基因单整合，其仅在诱导时被转录(图16A)。具有180个CAG重复的扩增等位基因和23个重复的未扩增等位基因的HT1080模型细胞和HD原代成纤维细胞系GM09197(Coriell Biorepository)(Sathasivam等,1997,Hum.Genet.,99:6692-5)、具有43个CAG重复的扩增等位基因和19个重复的未扩增等位基因的HD原代成纤维细胞系GM02191(Coreill Biorepository)在5％CO2、37℃下在补充10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养。在连续或不连续暴露于50-μM NA下处理细胞30天(HT1080细胞)或40天(成纤维细胞)。对于非增殖细胞的实验，使HT1080细胞生长至汇合，然后处理相同时间。根据制造商说明书(Roche，Basel，Switzerland)进行WST-1测定。测试所有细胞系不含支原体。每个实验进行三次生物学重复。
如先前进行的，在接触抑制和血清饥饿下通过生长抑制增殖。通过在增殖或接触抑制(和血清饥饿)的HT1080-(CAG)850细胞中用BrdU孵育24小时后，通过计数BrdU阳性细胞在活细胞中评估增殖停滞的程度。在增殖细胞中BrdU阳性细胞的百分比为92.6％，在接触抑制细胞中为8.17％。尽管一小部分HT1080-(CAG)850细胞即使在接触抑制和血清饥饿下仍然增殖，但该比例非常小。基于计算在30天(研究期间)(增殖，1.926^30＝348653546.6；接触抑制，1.0817^30＝10.55)后从单细胞衍生了多少细胞，增殖在接触抑制细胞中的影响可以忽略。
实施例4-显微镜
将HT1080-(CAG)850细胞与50-μM NBD标记的NA和Cell Light Plasma Membrane-RFP，BacMam 2.0(Life Technologies，Carlsbad，CA)一起孵育48小时，然后在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤2次，每次10分钟。用含有DAPI(Vector Laboratories，Burlingame，CA)的Vectashield硬固定培养基固定细胞。使用Olympus FV1000D共聚焦激光扫描显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)获得荧光图像。
实施例5-重复序列长度分析
使用Gentra Puregene Cell试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从HT1080-(CAG)850克隆和HD原代成纤维细胞中提取基因组DNA。如前所述，通过小池PCR(sp-PCR)然后进行Southern印迹测量(CTG)(CAG)重复序列的大小(Sathasivam等,1997,Hum.Genet.,99:692-5)。对于HT1080模型，使用1.4-1.7基因组当量的输入进行小池PCR(spPCR)。模型中的重复序列大小差异至多为3000个碱基对，因此，保守地即使在本文所述的优化PCR条件下，也可能偏向于扩增较短的等位基因。对于HD原代成纤维细胞，如前所述进行sp-PCR和Southern印迹，稍作修改(Tome等,2013,PLoS Genet.,9:e1003280)。简而言之，使用表1中列出的PCR引物，并将印迹与DIG标记的(CAG)7锁定核酸探针杂交(Nakamori等2009,Neuromuscul.Disord.,19:759-62)。对于三次实验中的每一次分析至少50个等位基因(对于总研究超过150个等位基因)。表2中总结了重复序列分析，从每个实验的每个重复的完整的小池PCR数据集编译的。对于图4D、4E、10、11、5B、5D、5E、14和15B的直方图，通过在整个具有一定长度的一定大小的重复产物的CAG重复序列上确定>50个单个小池PCR反应的比例计算“重复群体的％”，Y轴。在有或没有NA的情况下将细胞克隆生长30或40天(参见，例如Sathasivam等,1997,Hum.Genet.,99:692-5)。具体地，重复长度分布的直方图来自至少两种不同的细胞克隆。长度分布如下确定：小池PCR，然后用Southern印迹分析CAG/CTG重复长度。将来自成纤维细胞克隆的DNA稀释，平均每个PCR管产生一个可扩增的扩增重复等位基因。通过24个PCR循环扩增重复序列。通过电泳解析扩增产物，通过用CAG重复寡核苷酸的Southern印迹探测进行检测，并相对于DNA大小标记物确定重复序列长度。左图的比例尺显示分子量标记物(M)转换成相同大小的CAG重复片段的重复数。为了便于比较，虚线表示未变化的CAG大小。不稳定等位基因的分布用灰色条表示(左纵轴)。稳定等位基因的频率由黑色条表示(右纵轴)。等位基因长度沿X轴以跨50个重复的区间分组。对于统计分析，进行χ2-检验以比较先前报道的每组实验中经扩增、未变化和经收缩的等位基因的频率(Nakamori等,2011,Mol.Ther.,19:2222-7)。通过使用引物(列于表1中)和其他地方描述的扩增条件对HTT、CASK、ATXN8、Mfd15、TDP和小鼠Mapkap1、Fgd4和tdp基因座的三核苷酸和二核苷酸道长度进行PCR扩增(参见，例如Kremer等,1995,Am.J.Hum.Genet.,57:343-50；Brook等,1992,Cell,69:385；Koob等,1999,21:379-84；Dietmaier等,1997,Cancer Res.,57:4749-56；Kabbarah等,2003,Mol.Carcinogen.,38:155-9)。通过PCR(在高分辨率凝胶中电泳)和Agilent BioAnalyzer分别在未扩增的CAG等位基因和TBP等位基因中研究重复序列长度变化。在补充有EnhanceIT聚合物的6％聚丙烯酰胺凝胶(Elchrom Scientific，Switzerland)上分离PCR产物，用GelRed(Biotium Inc.，Hayward，CA)染色，并在Typhoon荧光成像仪(GELife Sciences，Piscataway，NJ)上扫描。表2总结了重复分析，从每个实验的每个重复的完整小池PCR数据集编译的。
表1引物
本研究中PCR分析使用的引物序列示于图4、5、6和图10-17、25A-H中。
实施例6-mRNA定量
在添加或不添加NA后72小时使用RNeasy Plus Micro试剂盒(Qiagen)从HT1080-(CAG)850细胞收获RNA。用随机六聚体引发总RNA并用Superscript III(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)逆转录，然后用RNA酶H处理。在ABI PRISM 7900HT序列检测系统(Life Technologies)上使用TaqMan基因表达测定或PrimeTime qPCR测定进行定量逆转录(RT)-PCR，引物序列示于表1中。转基因衍生mRNA的水平归一化为18S rRNA。使用配对t检验对结果进行统计学分析。CAG重复序列方向的转基因mRNA的引物序列为5'-AGA GAA TAGGAA CTT CGG AAT AGG-3'(SEQ ID NO:21)和5'-CCA TGT TCA TGC CTT CTT CTT T-3'(SEQID NO:22)。探针序列为5'-ACA GCA CAA TAA CCA GCA CGT TGC-3'(SEQ ID NO:23)。
实施例7-NA-DNA结合
如前所述制备带移测定的结构(Pearson等,1997,Hum.Mol.Genet.,6:1117-23；Pearson等,2002,Nuc.Acids Res.,30:4534-47；Axford等,2013,PLos Genet.,9:e1003866)，略有变化。通过HindIII消化使含有人DM1基因组(CTG)n(CAG)n重复序列(n＝30或50)的质粒线性化。如Pearson等所述，通过碱变性/复性形成50个重复的同源双链脱落结构(S-DNA)(1996,Biochem.,35:5041-53；1998,Nuc.Acids Res.,26(3):816-23)。如前所述制备具有长(CAG)20或(CTG)20脱落的异源双链体SI-DNA(Pearsons等,2002,Nuc.AcidsRes.,30:4534-47；Axford等,2013,PLos Genet.,9:e1003866)。简而言之，将(CAG)50和(CTG)30重复的DNA或(CAG)30和(CTG)50重复的DNA以等摩尔量混合，然后通过碱性变性/复性进行异源双链化。通过EcoRI消化释放含有重复的片段，在4％聚丙烯酰胺凝胶上电泳解析并凝胶纯化。通过填充反应在两条链上用[α-32P]dNTP放射性标记经纯化的片段。使用切伦科夫计数确定每种结构的放射性，将相同放射性浓度的每种结构与递增浓度的NA在室温下用1X低渗缓冲液孵育30分钟。通过在4％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上在1×TBE缓冲液中在恒定的200V下电泳2.5小时解析结合产物。每个NA分子/CAG-CAG的亲和力估计为Ka 1.8×106M-1或Kd 0.56×10-6M(Nakatani等,2005,Nat.Chem.Biol.,1:39-43)。
实施例8-复制测定
对于体外复制，如前所述设计模板(Panigrahi等,2002,J.Biol.Chem.,277:13926-34；Cleary等,2002,Nat.Genet.,31(1):37-46)。简而言之，将含有EcoRI/HindIII(CTG)79(CAG)79片段的基因组克隆亚克隆到pBluescript KSII中。将SV40-ori作为平端的XbaI片段克隆到pBluescript KSII的HindIII或EcoRI位点，分别位于CAG重复的双向复制103和98bp 5'和3'的SV40起点。这些包含重复的模板(pDM79EF和pDM79HF)及另一具有SV40-ori、无重复的底物(pKN16)在体外通过添加[α-32P]dCTP和T-抗原的HeLa细胞提取物进行复制，如Panigrahi等详细描述的(2002,J.Biol.Chem.,277:13926-34)and Cleary等(2002,Nat.Genet.,31(1):37-46)。在使用或不使用NA(7.5μM和15μM)下进行复制反应。纯化放射性复制产物，用BamHI线性化，并用DpnI处理(详见图9)。取出等量的未复制pKN16质粒DNA并用DpnI处理以显示未复制质粒DNA的完全消化。通过在15cm 1％琼脂糖凝胶上电泳解析等量的反应产物。凝胶在TBE缓冲液中以4V/cm运行16小时，进行干燥并暴露于Kodak膜。
实施例9-修复测定
为了确定NA与脱落DNA结构的结合如何影响修复，制备了一系列圆形脱落异源双链体底物，其具有过量重复，缺口位于脱落的5'或3'处(图3)。如详细所述的，通过杂交具有不同重复长度的互补线性化链的单链环状质粒制备底物，导致缺口位于线性化位点(Panigrahi等,2005,Nat.Struct.&Mol.Biol.,12:654-62；Panigrahi等,2010,PNAS USA,107:12593-8)。除了单个脱落之外，底物是相同的，不同之处仅在于过量重复的数量或缺口位置。在所有底物中，从(CTG)n(CAG)n的完全碱基配对的主链在独特点处挤出脱落，其中n可以等于30、47、48或50个重复。如先前所述，制备G-T错配底物(Panigrahi等,2005,Nat.Struct.&Mol.Biol.,12:654-62；Panigrahi等,2010,PNAS USA,107:12593-8)。通过HeLa提取物体外处理所有这些底物，然后评估修复。通过Southern印迹分析修复产物，探测含有重复序列的片段，并与起始材料比较，这允许在摩尔水平上定量评估修复效率。每个修复测定进行三至五次独立实验。
实施例10-R-环形成和加工
先前已详细描述了带有具有会聚的T3和T7RNA聚合酶启动子的扩增(CAG)79(CTG)79重复序列的质粒(Panigrahi等,2002,J.Biol.Chem.,277:13926-34)。如前所述进行转录反应(Reddy等,2014,Nuc.Acids Res.,42:10473-87)。简而言之，在有或没有NA 120μM的情况下，将在1x转录缓冲液(Roche)和1x牛血清白蛋白(NEB)中的500ng模板DNA与20U适当的RNA聚合酶(T7、T3或T7+T3(Roche))混合1小时。纯化样品，然后在存在或不存在NA(120μM)的情况下，在室温下用1g RNA酶A(Roche)单独或用1g RNA酶A(Roche)和1U大肠杆菌(E.coli)RNA酶H(Roche)处理30分钟。所有体外转录反应产物在1x TBE缓冲液中在80V下运行3小时在1％琼脂糖凝胶上进行分析。随后用溴化乙锭(0.5mg/ml)对凝胶进行染色，以允许在紫外(UV)光下观察总核酸。
将由体外转录和RNA酶A处理制备的R环模板与NA一起孵育，然后通过HeLa或SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的提取物处理，其中后者通过视黄酸终末分化，如前所述(Panigrahi等,2005,Nat.Struct.&Mol.Biol.,12:654-62)。这些细胞提取物是功能性的，处理由CAG/CTG重复序列形成的滑链DNA，并且能够诱导复制介导的CAG/CTG扩增和收缩。随后提取核酸材料。根据制造商说明书，在转化成细菌以通过分析单个产物(STRIP)分析三核苷酸重复的稳定性之前，使用QIAquick酶清洁试剂盒进一步纯化样品。先前已详细描述了STRIP测定(Panigrahi等,2002,J.Biol.Chem.,277:13926-34；Cleary等,2002,Nat.Genetics,31:37-46)。简而言之，将人细胞提取物处理的产物转化到大肠杆菌XL1-MutS(Agilent)中。挑取各自代表一种处理模板的单个细菌菌落并培养有限的生长期(最多6小时，4至6代)。通过在4％聚丙烯酰胺凝胶上分析含有重复序列的片段，分析MiniprepDNA的重复长度变化。通过相对于起始长度材料和一组已知尺寸标记物在4％聚丙烯酰胺凝胶上电泳测定含有重复序列的片段的大小来确定重复序列长度变化的量值。
用人细胞提取物处理未经转录的DNA模板(不从T3或T7启动子转录)并经过STRIP处理用作细胞提取物处理对照，以评估起始材料中存在的长度异质性的基础水平(制备期间细菌的不稳定性)，以及完全配对的DNA重复序列暴露于HeLa提取物可能引起的任何不稳定性。正如已公开的，DNA模板预计会出现一定程度的长度异质性，这是由于79个重复单元的起始长度不稳定，这是由于通过人细胞提取物、起始质粒中存在的重复长度异质性以及STRIP过程中的细菌培养带来的内源DNA损伤处理(可能包括单链断裂、氧化损伤、核苷酸错配等)。该起始模板中的序列长度异质性用作序列长度不稳定性的背景水平，任何潜在的R环处理不稳定性必高于该背景水平。仅报告显著大于背景的值。来自通过人细胞提取物的R环处理产物的不稳定性分析。(A)加工后总不稳定产物的百分比。基于电泳迁移，将产物表征为稳定(具有79个重复序列)或不稳定(具有少于或大于79个重复序列)并绘图。数据来源于三次独立的体外转录和人细胞提取物处理反应，其中～150个菌落(每个重复约50个菌落)代表对于每个R-环构型分析150个单独的细胞提取物处理产物。使用χ2测试在三次实验中将各个实验相互比较以确保实验之间没有显著差异，然后汇集每个实验条件的数据。如所述的，使用χ2测试将R环处理产物与DNA对照产物进行比较(Reddy等,2014,Nuc.AcidsRes.,42:10473-87)。通过处理的收缩和扩增的百分比。将不稳定产物进一步分为收缩(少于79个重复)和扩增(大于79个重复)并绘图。使用χ2测试比较R-环处理产物和DNA对照产物的收缩和扩增的分布。R环处理不稳定产物的分布。如前所述，对于每种不稳定处理产物，通过电泳迁移位置估计了相对于已知大小的标记物的大小并作图(Panigrahi等,2002,J.Biol.Chem.,277:13926-34)。
实施例11-MutSβ结合测定
如前所述，从表达his标记的hMSH2和hMSH3的杆状病毒感染的Sf9细胞中纯化MutSβ(Panigrahi等,2010,PNAS USA,107:12593-8)。在室温下进行结合反应。制备具有长(CAG)20的异源双链体SI-DNA，并如上所述进行末端标记。如所示的，在含有10mM HEPES-KOH pH7.5,110mM KCl、1mM EDTA和1mM DTT的缓冲液中将蛋白质与DNA一起孵育30分钟，所述缓冲液有或没有ATP。将反应物加载到含有非变性负载染料(20mM Tris-HCl，pH 7.4,4％甘油、溴酚蓝)的4％天然聚丙烯酰胺凝胶上，其中。将凝胶在1X TBE缓冲液中运行2小时。
实施例12-FAN1核酸酶测定
使用如先前所述的针对PALB2的双亲和纯化策略从杆状病毒感染的Sf9细胞中纯化FAN1核酸酶(Buisson等,2010,Nat.Struct.Mol.Biol.,17(10):1247-54)。简而言之，FAN1在N-末端被GST-标签标记，在C-末端被FLAG/His10-标记。在GST-下拉之后，通过与PreScission蛋白酶一起孵育并在Talon珠(GE Healthcare)上亲和纯化来除去GST标签。
将1pmol的32P标记的凝胶纯化的含有5'-瓣且无重复序列或在瓣或双链区中的(CAG)20脱落的DNA结构(参见图22D至22F中的序列)在室温下用增加浓度的NA处理或不处理10分钟，并在37℃下用200nM FAN1孵育30分钟。如前所述，在1X核酸酶缓冲液中，在10μl反应体积中进行反应(Liu等,2010,Science,329:693-6)。通过添加20mM EDTA终止核酸酶反应，通过用乙醇/氯仿/异戊醇(25:24:1，v/v/v)萃取纯化，然后用乙醇沉淀。将反应产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上在200V下运行1小时。为了鉴定FAN1消化位点，进行32P标记的寡核苷酸的Maxam-Gilbert测序(G>A和T反应)。将消化片段在8％测序凝胶上在2500V和82W下分离75分钟。
实施例13-聚合酶延伸测定
从大肠杆菌克隆中分离人DNA聚合酶β(Polβ)，并通过离子交换和亲和层析法(Chimerx，目录#1077，批号2203007)纯化。使用Bradford测定法确定蛋白质浓度。
使用重组杆状病毒载体在昆虫细胞中制备重组人聚合酶δ(Polδ)，并通过免疫亲和柱层析法纯化，如所述的(Zhou等,2012,PLoS ONE,7(6):e39156)。使用Bradford测定法确定蛋白质浓度。
重组RPA复合物的纯化在BL21(DE3)细胞中表达，并如Binz等中所述进行纯化(2006,Methods Enzymol.,409:11-38)。
如前所述，使用含(CAG)10重复序列的寡核苷酸进行Polδ延伸测定(Mason等,2010,Biochem.,49:5919-28)。先前描述了寡核苷酸的序列和引物条件(Hagihara等,2011,Chem.Bio.Chem.,12:1686-9)。简而言之，将0.1μM引物和0.1μM寡聚物在95℃变性3分钟，在室温下退火30分钟，并在室温下与NA一起孵育30分钟。添加RPA和/或Polδ并通过在10μl反应体积中添加0.1mM dNTP开始反应，并在37℃下孵育15分钟。通过添加20mM EDTA终止反应，通过用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，v/v/v)萃取纯化，然后用乙醇沉淀。将沉淀物重新悬浮于甲酰胺缓冲液中，在95℃变性10分钟，并在6％测序凝胶上在2000V和90W下运行40分钟。
实施例14-立体定向注射到R6/2小鼠中
根据大阪大学动物福利指南进行小鼠处理和实验操作。单一药物施加涉及六次单独立体定向注射，三次注射药物或盐水分别进入左或右纹状体的三个不同纹状体区域(图24中概述)。在无菌条件下，用50mg/kg戊巴比妥钠麻醉6周龄R6/2小鼠，并用5μl生理盐水(右侧)或溶于盐水中的500μMNA(左侧)立体定位注射到三个不同部位纹状体。小鼠每两周接受一次或两次注射，或连续4周每周注射一次。立体定向注射被输送到纹状体内的三个部位，坐标如下：(前-后(AP)＝0.0mm，内侧-外侧(ML)＝前囟1.5mm，背腹(DV)＝硬脑膜表面下方2.5mm；AP＝1.0mm，ML＝1.5mm，DV＝2.5mm；和AP＝0.5mm，ML＝1.5mm，DV＝2.5mm)，使用10μl Hamilton微量注射器，速率为0.5μL/min。参见图24概述的给药方案。每只小鼠都有一个内部对照，因为右侧纹状体中用生理盐水和左侧纹状体中用NA立体定位注射到大脑的两侧。因此，对NA处理的对照为每只小鼠纹状体的对侧。评估右侧和左侧纹状体在HD CAG转基因和内源性长CAG序列处的重复序列长度。对于处理四次的小鼠，收获NA施用之前和之后尾部以及左右前额皮质和左右小脑的DNA。
实施例15-基因扫描分析
在第一次注射后4周，如前所述，从小鼠脑组织中分离DNA(Nakamori等2009,Neuromuscul.Disord.,19:759-62)。如前所述，进行PCR(Tome等,2013,PLoS Genet.,9:e1003280)，并在ABI310基因分析仪上使用GENESCAN3.1软件(Life Technologies)测定PCR产物的大小。
实施例16-不稳定指数计算
如前所述，进行不稳定性指数计算的程序(Lee等,2010,BMC Syst.Biol.,4:29)，在图27A中示出并概述。
实施例17-通过SMRT-CCS测序的HPRT1序列分析
从三次独立NA处理的HD原代成纤维细胞系GM09197和从三次独立的未经处理的对照细胞中提取DNA。使用高保真Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen，Cat#11304)扩增HPRT1外显子2和3，引物示于表1中。在PacBio RSII仪器上使用单分子实时(SMRT)测序分析扩增产物(参见见图13A)。
具体地，对于在经NA和盐水处理的集落中的雄性HD患者来源细胞的三个重复，在Pacific Biosciences(PacBio)RSII上(其中P6-C4v2化学，360分钟影片，每个复制/处理组合一个SMRT细胞)对跨越HPRT1外显子2和3的～2.8kb PCR产物进行测序。来自原始细胞集落的单个分子由来自相应SMRT细胞的单个长读取表示。基于测序聚合酶在SMRTbell插入物周围产生的“通过”次数，PacBio的SMRTbell构建体允许单个分子在单个长读取中进行一次或多次测序。每个SMRT细胞平均测序99,023个不同的读取。得到的长读取含有平均约7次通过插入序列。每个SMRT细胞的平均插入片段长度为2,873bp。使用PacBio的“读取插入”管道(SMRT分析2.3.0)，为每个长读取(测序聚合酶在SMRTbell插入物周围产生的“通过”次数)创建了高质量的共有序列，并且用不完整的PCR分子(<2.5kbp)或用错误检测到的PacBio衔接子(导致共有序列过长)(>3kbp)消除了共有序列(图13C)。基于这些过滤器，产生每个重复/处理对的平均1,343个共有序列，多至2,402个序列。用BLASR(SMRT分析2.3.0；参数：affineAlign-affineOpen 8-affineExtend 0-bestn 1-maxMatch 30-sdpTupleSize 13–m5)将共有序列与相应的人参照区域进行比对人类参考(GRCh38、chrX:134、473、062-134、475、958)，并且在序列和具有全长比对(2.5至3kbp)的序列参照(错配、插入和缺失)之间鉴定所有单碱基对差异。共有序列的平均比对同一性为99.698％+/-0.3321％SD，范围为94.7679％至100％。为了估计每个重复/处理组合的突变率，计算特定变体发生的次数，在每个位置上人参照(GRCh38)的特定位置处的高质量PacBio共有读取除以比对的高质量读取的总数。对于每个重复，计算经NA和盐水处理的细胞之间的相对突变率，经NA处理的细胞的突变率减去经盐水处理的细胞的突变率，并且基于绝对相对突变率>0.5％，鉴定过量突变率。在所有三个重复中鉴定的15,277个变体中，在149个(1.0％)经NA处理的序列和101个(0.7％)经盐水处理的序列中存在极端突变率。在人参照评估的2,897个位置中，在经处理的序列中的113个不同位点(3.9％)和在对照序列中的84个位点(2.9％)鉴定出极端相对突变率。对于具有极端相对突变率的变体，NA-和盐水-序列之间的突变率没有显著差异(p＝0.1083，双样品Kolmogorov-Smirnov测试)(图13B)。
实施例18-结果
之前设计了CAG特异性DNA结合化合物，萘啶-氮杂喹诺酮(NA)(Nakatani等,2005,Nat.Chem.Biol.,1:39-43；Hagihara等,2006,Nuc.Acids Symp.Ser.(Oxf.),50:147-8；Hagihara等,2011,Chembiochem.,12:1686-9)。详细表征显示NA结合扭曲的链内CAG发夹，其中NA的萘啶和氮杂喹诺酮部分分别表现出与鸟嘌呤和腺嘌呤的互补氢键结合，导致两个胞嘧啶碱基从CAG发夹上脱落(图2A和2B)。NA以高亲和力结合并将(CAG)10发夹的解链温度提高>30℃(Hagihara等,2011,Chembiochem.,12:1686-9)。NA还优选结合较长CAG发夹，其中最大的结合是(CAG)30，然后结合(CAG)20和(CAG)10(Nakatani等,2005,Nat.Chem.Biol.,1:39-43)。NA对于较长CAG发夹结构的这种显著选择性与突变重复基因座处的脱落DNA的存在相结合(Axford等,2013,PLos Genet.,9:e1003866)可允许靶向扩增等位基因。
为了确定NA是否能够与具有和不具有脱落的疾病相关(CAG)(CTG)双链体结合，使用脱落DNA进行带移分析，这是重复不稳定的诱变中间体模型(Pearson等,2002,Nuc.AcidsRes.,30:4534-47)。这些体外结构的详细生物物理表征显示它们反映了最近在DM1患者组织的突变DM1基因座处鉴定的脱落DNA(Axford等,2013,PLos Genet.,9:e1003866)。NA不与含有(CAG)50(CTG)50重复序列的全双链DNA片段结合，并且高浓度的NA不诱导全双链体重复序列的结构改变(图2C至2D)。相同的(CAG)50(CTG)50分子可以被诱导成为具有聚集的短脱落物，称为S-DNA，其包含异质分子混合物，每个分子含有2至62个短脱落物，大多数每个为1至5个重复单元，沿着重复序列从两条链的不同位置挤出(Pearson等,1998,Nuc.AcidsRes.,26:816-23；Panigrahi等,2010,PNAS USA,107:12593-9)。S-DNA可以在有限的程度上结合NA，但是它们的短脱落物和电泳异质性可能不允许检测单移物种。在(CAG)50(CTG)30的脱落中具有超过20个CAG重复序列的脱落异源双链体被NA广泛结合(图2C至2D，也参见图7)。NA结合导致先前在其他DNA结合配体上观察到的条带增宽(Neilsen等,1988,Biochem.,27:67-73；Carlsson等,1995,Nuc.Acids Res.,23:2413-20；Barcelo等,1991,Biochem.,30:4863-73；Fox等,1988,Nuc.Acids Res.,16:2489-507；Fox&Woolley,1990,Biochem.Pharmacol.,39:941-8)。在NA存在下脱落DNA的逐渐缓慢迁移与NA与发夹中的其他(CAG)(CAG)对结合一致(图7；Nakatani等,2005,Nat.Chem.Biol.,1:39-43)。相反，具有长脱落CTG重复序列的异源双链(CAG)30(CTG)50不受NA的束缚(图2C-2D，图2C的多个图谱均来自单个凝胶，为清楚起见分开)。因此，NA结合CAG但不结合CTG脱落。结合对CAG脱落的DNA结构具有定量特异性(图2D)。在NA存在下纯化的脱落(CAG)50(CTG)30变性为分离的(CAG)50和(CTG)30单链(没有复性)也显示NA对单链(CAG)50链特异性结合(图2E，左图)。在NA存在下单个(CAG)50和(CTG)30单链的复性显示NA不阻断互补链杂交的能力，但确实特异性结合脱落CAG链而不是CTG链(图2E，右图)。分离的单链(CAG)50序列的电泳移位程度大于异源双链(CAG)50(CTG)30，其仅有20个过量CAG重复序列的脱落物，而一旦呈现单链，完整的50个CAG重复序列被强制进入所有50个重复序列的长发夹(图2，比较E图)，这可以结合更多的NA分子。CTG发夹链不受NA的限制(图2C至2E)。与较短的CAG脱落相比，结合明显更好(图8)。基于这些结果和建立的NA结合模式，先前估计了2个NA分子与1个CAG-CAG的比率，其中(CAG)20的脱落将结合20个NA分子。总之，这些发现支持NA对于疾病相关的序列长度的长CAG重复序列脱落物的结构特异性，但是不支持NA将从扩增的完全双链体分子诱导脱落物挤出的论点。
NA阻断脱落DNA的处理，表明它可能改变重复序列不稳定性。NA特异性地抑制具有长(CAG)20脱落的脱落DNA的修复，但不抑制(CTG)20脱落(图3A至3C)，这与其对CAG发夹的设计特异性一致(图2)。NA阻断了(CAG)20脱落的修复，这与人和其他DNA聚合酶无法沿NA结合(CAG)10-(CAG)20模板延伸引物一致。长(CAG)20脱落的修复与错配修复(MMR)无关，表明NA的作用不需要MMR的参与。相比之下，单个重复脱落，太小而无法结合NA，需要错配修复MutS beta(MSH2-MSH3)复合物。评估NA对修复单个额外CAG重复脱落(其太小而不与NA结合)的影响。单个重复CAG或CTG脱落的修复不受NA的影响，表明该过程中的MutSβ功能不受NA的影响(图3D)。
为了探索NA对CAG/CTG脱落异源双链体的特异性，评估了NA对最常见的碱基-碱基错配修复的影响，即G-T错配。这种错配的修复取决于错配修复MutS beta复合物(MSH2-MSH6)。NA对G-T修复没有影响，进一步表明NA不阻断MMR并且不可能导致已知在MMR遗传缺失中发生的全基因组突变(图3E)。因此，NA对阻止长CAG脱落修复的偏好可以预测调节重复序列不稳定性的能力。
为了解决NA的潜在治疗用途的问题，确定NA是细胞可渗透的并且可以进入细胞核而不引起急性细胞毒性或减缓对人细胞的增殖(图2E至2G)或DNA复制(图8)。
使用诱导重复序列收缩的NA治疗HD患者细胞。NA是细胞可渗透的并且可以进入细胞核而不引起急性细胞毒性或减缓人细胞的增殖(图4A至4C)或改变DNA复制(图9)。在继承了(CAG)40至(CAG)50的常见突变的HD个体中已经引起体细胞扩增的脑细胞中小片段长度>200个重复。在来自HD患者的原代成纤维细胞中的亨廷顿氏病基因座处NA诱导重复群体向(CAG)180(CTG)180小片段收缩的显著转变。NA增加了扩增HD重复序列的收缩次数(图4D；P＝7.25E-06，图10，重复序列分析总结在表2中，每次重复实验时从完整的小池PCR数据集编制)，导致重复的显著损失(图4F；P＝0.0003)。NA还减少了扩增HD重复序列的扩增数量(图4D；P＝4.339E-05，图10，表2)。HD患者成纤维细胞也用43CAG重复的扩增等位基因(这是大多数患者常见的突变)治疗。大量经NA治疗的细胞引起扩增重复序列的收缩，收缩低至20个重复，低于35单位的HD疾病阈值(图4E和4G；P＝3.28E-03，图11，表2)。NA还减少了扩增次数(图4E；P＝8.32E-05，图4E；图11，表2)。因此，NA可以诱导对遗传和体细胞扩增的等位基因共有的扩增小片段长度的收缩。相反，NA不会影响未扩增的HD重复序列或其他已知在压力条件下容易出现不稳定的微卫星重复序列(图4H和图12)，表明NA对扩增的CAG/CTG重复序列具有特异性，并且不会有害地影响其他重复序列。作为NA对脱落DNA结构的特异性的其他控制，在经NA治疗的HD患者细胞中，在TBP基因的非常长但非遗传不稳定的CAG小片段处评估NA的作用。TBP的正常重复范围为25-41，而>49个重复的延伸导致完全渗透性疾病(SCA17)，42-48的延伸导致外显率降低。在HD患者细胞中，非突变TBP基因长度为38和34个重复，高于和低于34/35个重复的HD疾病CAG长度阈值。重要地，如果TBP重复序列活跃地发生不稳定事件，导致形成与NA结合的脱落DNA结构，那么NA只会产生影响。使用建立的spPCR方法，NA不改变TBP重复的长度分布(图12C，表2)。因此，NA对TBP基因的大而非突变重复长度没有影响(图12C，表2)，但确实影响(CAG)43-180的突变HD小片段(图4D在4G)，这支持NA对于主动发生不稳定性的重复序列的特异性，可能涉及脱落DNA。NA不能影响非扩增的重复序列片段可能是由于短片段形成脱落DNA的能力差，这与在非扩增基因座处缺乏这些结构一致。此外，HPRT1基因(外显子2至3)的多达2,402个等位基因的序列分析(通常用作突变诱导的替代)未显示经NA处理的细胞的序列变化(图13，参见图B)，以争论反对NA是一般诱变剂。该发现与NA不能影响碱基错配修复一致(图3E)。总之，这些结果表明NA对于通常遗传的扩增重复长度和在引起体细胞扩增的脑细胞中频繁出现的长度是特异性的，NA的作用对于活跃不稳定的片段是特异性的并且不会有害地影响其他重复或序列的。
在人细胞中NA诱导重复群体向(CAG)850(CTG)850小片段(表达r(CAG)850)收缩的显著转变(Nakamori等,2011,Human Mol.Genet.,20:580-8)(图5A和5B，及图14；P＝4.78E-05，重复分析总结在表2中)。NA显著缩短了重复小片段的平均大小，其中重复单元丢失的程度高达790个重复(图4C；P＝6.44E-03)。NA的作用不依赖于细胞增殖和DNA复制(图5D，图15)，这与NA缺乏对细胞增殖(图4C)或复制进展(图9)的作用一致。NA的作用取决于重复序列的转录(图5E，图16A至16C)，但NA不改变扩增重复序列的转录(图5F)。NA不影响非扩增的CAG/CTG小片段或其他微卫星重复序列(图5G和图12)。总之，这些结果表明NA有效地不依赖于增殖而依赖于重复序列的转录。
转录诱导的R环可以导致CAG/CTG不稳定性。上文观察到的NA对重复不稳定性的转录依赖性(图5E)可能表明NA可能影响转录、R-环形成、R-环的生物物理稳定性和/或R-环加工成不稳定性。测试了这些替代物，发现NA没有改变细胞中扩增重复的转录水平(图5F，图16A-16C)，也没有影响体外转录(图17B)。NA(120μM)不影响R-环形成(图17B)，也不影响预形成的R-环的RNA酶A或RNA酶H加工(图17C)。在与用于细胞中相似的(50μM)或更高(500μM)的NA浓度下，仍然可检测到R-环，表明NA不影响R-环的生物物理稳定性(图17D)。然而，NA通过神经元样人SH-SY5Y细胞的提取物改变了CAG/CTG R-环的加工，显著增加了收缩产物而不是扩增产物的数量(图18C，p＝0.002)。来自这些模型系统的结果表明NA导致R-环优先加工以重复序列收缩。
NA增强扩增重复序列收缩的合理机制是通过转录诱导的R环产生的脱落DNA的异常修复——这一途径得到了本文提供的数据以及其他报道支持(Nakamori等,2011,HumanMol.Genet.,20:580-8；Lin等,2010,PNAS USA,107:692-7；Reddy等,2014,Nuc.AcidsRes.,42:10473-87)。如图19所示，在CTG链的转录过程中以产生CAG转录物，如在HTT基因处发生的，存在在移位的CAG DNA链上形成脱落DNA的倾向，NA可以结合在移位的dCAG链上形成的链内发夹，并且可能进一步将它们延伸到更长发夹(图19A)。这些NA结合的脱落DNA将逃脱修复并导致收缩。当通过内核溶解切口保留或去除脱落时(Hou等,2009,NatureStruct.Mol.Biol.,16:869-75；Pluciennik等,2013,PNAS USA,110,12277-82)(参见图19B中的箭头)，将阻断NA结合(CAG)n模板上的DNA修复合成(Hagihara等,2006,Nuc.AcidsSymp.Ser.(Oxf.),50:147-8；Hagihara等,2011,Chembiochem.,12:1686-9)，从而有利于收缩而不是扩增。该模型与在缺乏DNA复制时NA以转录依赖性方式诱导重复收缩是一致的，其中NA通过扰乱重复结构的修复发挥其作用(图3至图5)。
有许多途径可以产生重复不稳定性，并且NA可以通过各种方式起作用(DNA复制、转录、表观遗传变化、DNA损伤等)，所有这些都涉及脱落DNA。NA对CAG不稳定性的影响与增殖/复制无关(图5D)并且依赖于通过重复的转录(图5E)，再结合CAG不稳定性对转录的依赖性，通过R-环加工形成脱落DNA，脱落DNA可能参与不稳定性，NA对CAG发夹的特异性(图2)和NA阻断CAG收缩中间体修复的能力(图3B)都支持这一提出的模型。
NA可能通过阻断DNA修复蛋白与脱落DNA的相互作用来起作用吗？虽然大的脱落修复所需的蛋白质尚不清楚，但为了测试这一假设，我们评估了NA对四种候选蛋白MutSbeta、FAN1和RPA-polδ的影响。许多小鼠模型证明错配修复MutS beta复合物与功能性ATP酶一起驱动CAG/CTG扩增。虽然NA阻断了20个过量重复的大的CAG脱落物的修复，这个过程独立于MutS beta，我们和其他人已经表明MutS beta可能参与脱落DNA的形成，随后导致扩展。预期涉及与DNA结合的MutS beta的过程可能受NA影响。在此，发现MutS beta可以结合长CAG脱落重复序列，这是一种可以被ATP解离的复合物(图20)，类似于之前的报道。NA不阻断MutSβ与CAG脱落的结合或阻断ATP介导的该复合物的解离(图20)。由于NA不会阻断MutSbeta结合脱落物，并且由于NA不允许从含有变性重复序列的DNA中形成脱落物(图2E)，因此不支持NA单独使用或通过MutS beta增强在阻断脱落DNA形成中的作用。如果涉及NA在重复不稳定时的作用，MutSβ可能作用于上游，可能在转录期间形成脱落DNA，如所建议的。
最初在脑中鉴定的FAN1/KIAA1018/MTMR15是DNA修复核酸酶，优先选择DNA结构。FAN1最近被确定为几项针对HD和其他五种CAG疾病(SCA1、SCA2、SCA3、SCA7和SCA17)的发病年龄改良剂的研究中的首位。虽然FAN1调节发病年龄的方式尚不清楚，但可以推测通过调节体细胞重复不稳定性来做到这一点。测试了FAN1对重复DNA的作用，其中没有先例。如前所述，FAN1可以切割超螺旋和线性DNA(图21，左图)，并可以切割转录诱导的含R-环的DNA——从而释放出与超螺旋相关的RNA部分(图21，右图)。脱落DNA可能是由于从R环中丢失RNA后未对准的DNA退火引起的。将FAN1切割定位于三个不同的脱落DNA连接处：没有重复序列的对照连接处；在瓣上具有CAG发夹的连接处；在连接处以外的双相区域中有CAG发夹的连接处(图22，上图；表1)。与其他研究一样，FAN1切割5'单链瓣和瓣以外的双链体。对于对照底物，两个位点的切割大致相等(图22A和图22D)。然而，对于CAG-底物，在双链和发夹区域处的切割减少(图22B至22C和图22E至22F，变性凝胶，参见箭头)。这表明CAG发夹的存在可能影响FAN1活性。在反应中包含增加量的NA显著降低了CAG双链底物上的核酸酶活性，特别是影响CAG发夹附近和内部的切割(图22C和图22F)。本文中证明的滑动CAG底物的FAN1切割可能被NA改变，已被表明改变CAG不稳定性的药物(图3、图5和图6)，这些支持NA可以改变DNA结构特异性核酸酶(FAN1)作用的可能性。FAN1可以调节HD发病年龄的方式是未来研究的重点。
复制蛋白A(RPA)是许多DNA修复过程中的关键参与者，通过结合和稳定单链区域抑制异常DNA结构(如发夹)的形成。据报道，RPA通过熔化结构化模板来增强通过困难DNA模板的DNA聚合酶进展。评估NA对RPA与脱落DNA结合的影响，并且通过聚合酶δ(polδ，涉及CAG重复不稳定性的聚合酶)增强进展并且在修复能力上在脑中活化。NA竞争性地阻断了RPA与脱落CAG重复的相互作用(图23A)。Polδ无法通过CAG小片段合成，并且这通过添加RPA来拯救，可能是通过其融化阻碍发夹的能力(图23B，泳道2至4)。NA阻断了沿着CAG模板的polδ增强的进展(图23A，泳道5至6)，该结果与NA针对CAG小片段的RPA的竞争性结合一致(图23A)。这些结果支持NA通过聚合酶不能通过NA结合的CAG模板合成而诱导CAG收缩的机制(图23C)。该结果支持NA可以引起收缩的过程(参见图19的下图)。总之，我们的FAN1、polδ和RPA结果提供了原理验证，支持NA可能通过破坏修复蛋白对CAG脱落的相互作用或活性而起作用的概念。限定NA可以改变以诱导CAG收缩的确切参与者和步骤将被确定。
在神经组织中NA是否体内有效，显示出猖獗的CAG扩增并且易于变性？在小鼠和患者中，最大的CAG扩增和大多数变性发生在纹状体中(Lopez Castel等,2010,NatureReviews,Mol.Cell.Biol.,11:165-170；Kennedy等,2003,Human Mol.Genet.,12:3359-67；Goula等,2009,PLoS Genet.,5:e1000749；Larson等,2015,Neurobiol.Dis.,76:98-111；Kovalenko等,2012,PLoS One,7:e44273)，中型多刺神经元是最脆弱的并且引起最大的CAG扩增(Kovalenko等,2012,PLoS One,7:e44273)。因此，测试了NA对亨廷顿氏病R6/2转基因小鼠(每个遗传约150至160个CAG重复，重点是纹状体)中扩增(CTG)150不稳定性的影响(Goula等,2009,PLoS Genet.,5:e1000749；Larson等,2015,Neurobiol.Dis.,76:98-111)，其中每只小鼠在左侧纹状体上注射NA+盐水或仅在右侧注射盐水，作为内部对照，跨越4周(图24)。早在几周时，CAG扩增在这些小鼠的纹状体中是明显的，随着小鼠年龄的增长而持续(Goula等,2009,PLoS Genet.,5:e1000749；Larson等,2015,Neurobiol.Dis.,76:98-111)。在一个模型中，CAG重复序列已被量化，以每个细胞每月约3.5个CAG单位的速率获得广泛分布的额外重复序列的大小(Lee等,2011,PLoS One,6:e23647；Mollersen等,2010,PLoS Genet.,6:e1001242)。在6周龄R6/2小鼠中重复纹状体内注射NA(溶于盐水)导致扩增重复序列的看似收缩，相对于在相同小鼠的对侧纹状体仅注射盐水的(图6A，比较经NA处理的纹状体部分蓝色扫描与经盐水处理的纹状体部分红色扫描，在四周内注射一次、两次或四次，然后获得DNA(图24))。NA的作用局限于注射部位，因此只注射NA(蓝色扫描)，而不是注射盐水的纹状体区域(红色扫描)，显示重复序列收缩，从而允许盐水注射相同小鼠脑的一半作为内部对照。在没有任何治疗的情况下，对于给定的小鼠，纹状体的左半部和右半部之间的CAG长度分布是难以区分的。NA(在盐水中)处理的一半具有比仅用盐水处理的另一半更短的CAG小片段，这支持了NA诱导CAG长度差异的解释(图6A)。
在4周的时间内通过额外NA施用诱导持续的收缩(这对于总共13只小鼠是高度可重复的(1只1次注射，2只2次注射2次，10只4次注射)，参见图25A至5H，NA注射不改变脑形态，图26)。无论小鼠之间遗传重复长度差异如何，NA的影响在小鼠之间是一致的。HD患者脑中存在重复序列大小的双峰分布。在大多数CAG小鼠模型的纹状体中，这种较大扩增的第二个峰是明显的，并且发现其由最脆弱的HD细胞、中等刺状神经元组成和具有更高水平的扩增CAG转录物。感兴趣，NA对双峰重复序列分布的较大扩增具有更大的影响(图6D)。纹状体中这部分较大尺寸的扩增可能是由涉及大脱落的突变事件引起的，大到足以被NA结合。在HD个体中的不稳定性分析表明，在每个突变事件中获得或丢失的CAG单位的数量主要是一个重复单位的变化，但可能包括5-15个重复单位(可以与NA结合的大小)的变化。应注意，从DM1患者的多种组织(包括脑)中分离的DM1基因座处的脱落DNA呈现出脱落大小的双峰分布，具有约30和<10个重复的峰，其中前者可以被NA结合。
经NA处理的纹状体中的大多数(如果不是全部)等位基因发生重复收缩，表明NA影响了大多数细胞(图6A，图25A至图25H)。使用已建立的方法，体细胞“不稳定性指数”被量化：更大的指数反映更大的扩增，更低的指数反映更低的扩增或更大的收缩(图27)。随着后续处理，收缩相对于扩增的峰的数量(图6B)或收缩相对于扩增的峰的相对组成(％)(图6C)更大。用NA处理4次的纹状体的重复大小分布与经模拟处理的纹状体显著不同(Mann-Whitney，p＝0.00034，或配对t测试，p-0.000019)。NA的作用局限于注射部位，因为在纹状体内注射的相同小鼠的大脑皮质和小脑中的CAG小片段在左右两侧显示出相同的CAG长度异质性模式(图6C和图6D，图25A至图25H)。
NA导致的收缩，而不仅仅是阻止扩增，这一事实支持了如下事实：经NA处理的纹状体中的峰重复长度短于同一小鼠尾部的遗传片段长度，这在小鼠的整个生命过程中不会改变(图5D和图25)。重要地，对于给定小鼠，相对于尾部的遗传长度，经NA处理的纹状体的一半中的重复大小分布向收缩移动，而经盐水处理的纹状体的一半继续引起扩增(图6B至6E，图25A至25H，参见主峰的δ，其中盐水-相对于经NA处理相对于尾CAG长度相差4至7个CAG单位)。这表明向纹状体注射NA引起扩增CAG小片段收缩，并且可以抵消该组织中的扩增偏差(显示约5.75CAG单位/月的自发扩增率)，该发现与在细胞中观察到NA诱导的收缩一致(图3和图5)。NA在体内的作用对于扩增重复序列是特异性的，对非扩增的重复序列没有影响(图6E和12D)。NA的作用可能涉及基因组维持而不是DNA复制，因为6周龄的经处理的小鼠已经通过了出生后的“脑生长突增”，其中复制在小鼠出生后6-17天达到峰值。它可能涉及转录，因为CAG-RNA水平在具有最大扩增的纹状体细胞中最大，并且NA不改变在整个重复序列上的转录(图16C)。这与NA诱导不依赖于细胞增殖的收缩一致(图5E)。因此，NA可以在组织的大多数细胞中诱导扩增的CAG重复序列收缩，在HD个体中这显示出选择性神经元易损性。
在NA处理的四周时间内在具有约150个CAG重复的小鼠中的这些发现表明神经元全体每周损失约0.5次重复的收缩。将此推断为受HD影响的人，在体细胞CAG扩增快速发作之前应用药物(如NA)可以有效阻断扩增并诱导遗传性扩展等位基因收缩成较短的长度，其中跨越一年的治疗可以使重复收缩5至25个重复。对于高于平均水平的60至70个重复的HD等位基因，这可能是显著的并且改变疾病发作和进展。
来自使用多个模型系统的不同方法的数据导致了和谐的解释。例如，各种细胞模型中NA增强的收缩与体内收缩增加一致，并且在复制叉上没有NA的作用和独立于复制但需要转录都与在转录发生的细胞或纹状体中缺乏增殖要求一致。此外，NA影响R-环加工成收缩与NA影响细胞系和纹状体中的不稳定性一致，该细胞系和纹状体经历转录产生rCAG-dCTG R-环，置换CAG DNA链并允许其被NA结合。此外，NA结合并抑制长而不短的CAG脱落的修复与NA优先影响纹状体中较大的重复序列大小(其经历较大的盐性扩增)一致。
先前使用CAG/CTG不稳定性细胞模型的研究表明，外源添加的化合物可以调节重复不稳定性水平(Yang等,2003,Am.J.Hum.Genet.,73:1092-105；Gomes-Pereira等,2006,Mutat.Res.,598:15-34)。然而，有效化合物是缺乏对扩增重复序列特异性的DNA损伤剂(乙基甲磺酸盐、溴化乙锭、丝裂霉素C和DNA聚合酶抑制剂)，因此会在整个基因组中诱导有害突变。在单独的方案中，(CAG)6反义寡核苷酸能够降低(CTG)800的不稳定性，但不会诱导扩增重复序列的收缩(Nakamori等,2011,Mol.Ther.,19:2222-7)。
据报道，未知过程的线粒体定向化合物XJB-5-131轻度抑制CAG扩增，而不是诱导收缩；这种化合物也抑制了收缩。针对在弗里德赖希共济失调患者中扩增的双链GAA重复序列的序列特异性聚酰胺阻断GAA三链结构形成并抑制FRDA细胞中的GAA重复扩增，但不诱导收缩。CRISPR/Cas9处理HD细胞以靶向突变等位基因，缺失约44kb DNA跨越启动子区、转录起始位点和突变HTT等位基因的CAG扩增，导致单倍体功能不全与功能性非突变等位基因。小分子方法可以克服酶介导的路径的一些体内障碍(递送、特异性等)。
与这些先前的方法相反，我们的结果表明NA是一种结合由CAG重复组成的滑链DNA结构的DNA配体，可以改变重复不稳定性的动态，有利于收缩而不是进一步扩增。NA可能通过抑制脱落DNA的异常修复循环而起作用，可能是通过扰乱DNA修复蛋白与脱落DNA的相互作用。证明对攻击有害重复r(CUG)RNA-蛋白质相互作用或CAG/CTG转录有效的其他核酸结合化合物(Bernat等,2015,Neuron,87:28-46)也可能影响重复不稳定性。NA的特性-其序列和结构特异性，其对包含脱落DNA的扩增重复的优先作用，其在受影响大脑区域诱导体内收缩的能力-使其成为显示其潜力的一流实例，小分子DNA结合化合物通过诱导收缩和抑制致病扩增重复的扩增来影响CAG重复不稳定性。一旦针对治疗进行了优化，将这种小分子施用人脑可以有效地针对根本原因并解决由扩增突变引起的所有下游效应。
表2小池PCR的结果
数据总结自HD患者成纤维细胞(GM09197；(CAG)180和GM02191，(CAG)43)和HT1080-(CAG)850的分析，示于图5、6和图10和11、14和15中。
a使用±25个重复的截止点来确定扩增和收缩。
b使用λ2检验计算P值，以比较HT1080-(CAG)850细胞群中扩增的、未变化的和收缩的等位基因的比例。
c对于所有等位基因(扩增+未变化+收缩)，重复大小的平均变化表示为重复数量。注意，重复大小的平均变化偏向于收缩，因为小池PCT优先扩增较短的等位基因。
d使用±10个重复的截止点来确定扩增和收缩。
e使用λ2检验计算P值，以比较HD成纤维细胞群体中扩增的、峰重复的和收缩的等位基因的比例。
f通过Student's t检验计算P值。
应理解，虽然本文已经结合许多不同方面描述了方法和物质的组成，但是各个方面的前述描述旨在说明而不是限制方法和物质的组成的范围。其他方面、优点和变化方案在以下权利要求书的范围内。
公开了可以用于，可以与其一起使用，可以用于制备或者是所公开的方法和组合物的产品的方法和组合物。本文公开了这些和其他材料，应理解，公开了这些方法和组合物的组合、子集、相互作用、基团等。即，虽然可能未明确公开对这些组合物和方法的每种不同的个体和集体组合和排列的具体参考，但在本文中具体考虑和描述了每一种。例如，如果公开和讨论了特定的物质组成或特定方法并且讨论了许多组成或方法，则除非特别指出相反的情况，否则特别考虑组成和方法的每种组合和排列。同样地，还特别考虑和公开了这些的任何子集或组合。
Claims (28)
1.一种抑制细胞中的重复DNA序列扩增的方法，包括：
使细胞与萘啶-氮杂喹诺酮(NA)接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触是在体内的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述接触步骤进行多次。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在所述接触步骤之前，确定所述重复DNA序列内的重复数量。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在所述接触步骤之后，确定所述重复DNA序列内的重复数量。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述细胞与一定量的NA接触，NA的量取决于所述重复DNA序列内的重复数量。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述NA是经修饰的NA。
8.一种减少个体基因组中的重复DNA序列内的重复数量的方法，包括：
向个体施用至少一剂治疗量的萘啶-氮杂喹诺酮(NA)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中将所述NA直接施用到受影响的组织。
10.根据权利要求8所述的方法，其中将所述NA全身施用。
11.根据权利要求8或9或10所述的方法，其中通过注射来施用。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中施用所述NA多次。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中施用多剂量NA。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的方法，还包括多次重复施用步骤。
15.根据权利要求8至14中任一项所述的方法，其中NA的所述治疗量基于所述重复数量。
16.根据权利要求8至15中任一项所述的方法，其中NA的所述治疗量为约0.01μM至约1M。
17.根据权利要求8至16中任一项所述的方法，还包括鉴定具有重复DNA序列的个体。
18.根据权利要求8至17中任一项所述的方法，还包括确定来自所述个体的一个或更多个细胞中的所述重复数量。
19.根据权利要求8至18中任一项所述的方法，还包括监测来自所述个体的一个或更多个细胞中的所述重复数量。
20.根据权利要求8至19中任一项所述的方法，其中所述NA是经修饰的以增强其体内稳定性。
21.根据权利要求8至20中任一项所述的方法，其中所述NA通过脂质体或颅内泵递送。
22.一种用于在个体中治疗或预防由重复DNA序列扩增引起的疾病的方法，包括：
向所述个体施用至少一剂治疗量的萘啶-氮杂喹诺酮(NA)。
23.根据权利要求22所述的方法，还包括鉴定患有由重复DNA不稳定性引起的疾病的个体。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述由重复DNA序列的扩增引起的疾病选自亨廷顿病(HD)、亨廷顿病样疾病-2(HDL2)、强直性肌营养不良(DM1)、脊髓小脑共济失调1型(SCA1)、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA12、SCA17、脊髓延髓肌萎缩症(SBMA)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)、Fuch角膜内皮营养不良2(FECD2)、精神分裂症、双相障碍(KCNN3)和乳腺癌危险因子AIB1。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中在所述重复DNA序列扩增之前施用NA。
26.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述施用步骤在所述重复DNA序列扩增之前发生。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中在出生前(子宫内)向个体施用NA。
28.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中在所述重复DNA序列扩增之后向个体施用NA。
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