CN110373152B - 一种高强度的稀土蛋白粘合剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高强度的稀土蛋白粘合剂及其制备方法，由超级正电荷蛋白和阴离子型表面活性剂制成；所述阴离子型表面活性剂具有邻苯二酚结构。本发明以超级正电荷蛋白为主要成分，与具有邻苯二酚结构的阴离子表面活性剂配伍，超级电荷蛋白与阴离子型表面活性通过静电力作用形成复合物后，还可进一步加入金属离子与蛋白进行鳌合，掺杂金属离子经非共价键作用形成络合物，从而增强该粘合剂的粘附性。实验结果证明，本发明中的稀土蛋白粘合剂在不同条件(干样、湿样以及动物表皮)下均能表现出优异的黏合性能。并且，本发明制备工艺简单、无需特殊设备、成本低且绿色环保。与现有技术相比，本发明具有良好的生物相容性以及可降解性。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种高强度的稀土蛋白粘合剂及其制备方法。
背景技术
粘合剂是一种用于在规定条件下，使两个或更多表面粘合在一起的材料。它在高技术和生物医学领域中发挥着重要作用。同样，在自然界中，跨越多个长度尺度的粘连是生存的必要条件。
受自然界的启发，研究人员通过对生物有机体相关的粘合剂及粘合机制的研究，人工合成出各种模拟这种黏附性能的粘合剂。但是这些粘合剂通常需要大量的时间、物力、财力来进行人工合成，而且这些粘合剂还需要聚合反应或者通过紫外照射来实现胶黏，并且容易产生毒副作用，因此这大大限制了现有的粘合剂在医药和工业等领域上的应用。另一方面，我们的日常生活经验表明，常规粘合剂在干燥的环境中表现出较强的黏附作用，但是在水存在条件下粘合效果很容易被破坏。这由于吸附的水分子破坏粘合界面，这一特性广泛影响各个领域，比如水管道泄漏和船体的腐蚀。因此，在粘合剂的科学技术中，亟需一种在干燥和潮湿环境中均具有高黏性特性及良好生物兼容性的粘合材料，以便将所制备粘合剂更好地应用到更广泛的领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高强度的稀土蛋白粘合剂及其制备方法，本发明中的稀土蛋白粘合剂在不同条件下均能表现出优异的粘合性能，同时具有良好的生物相容性和可降解性。
本发明提供一种高强度的稀土蛋白粘合剂，由超级正电荷蛋白和阴离子型表面活性剂制成；
所述阴离子型表面活性剂具有邻苯二酚结构单元。
优选的，所述稀土蛋白粘合剂由超级正电荷蛋白、阴离子型表面活性剂和金属离子制成；
所述金属离子为Fe3+和/或Tb3+。
优选的，所述超级正电荷蛋白按照以下步骤进行表达：
将超级正电荷蛋白K系列载体质粒转化进毕赤酵母(GS115/X-33/KM71)或大肠杆菌表达菌株(BL21/BL21DE3/BLRDE3)，挑取单克隆菌落，用LB培养液进行过夜培养；将过夜活化的表达种子液加入TB培养基，待菌液达到OD600数值为0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷并降温到30度进行过量表达。诱导12小时收集菌体，用裂解缓冲液重悬，加入蛋白酶抑制剂，DNA酶，溶菌酶，用高压破碎机破碎菌体，10000rpm转速以上离心，收集上清液，HPLC纯化，最终得到超级正电荷蛋白。
优选的，所述超级正电荷蛋白的电荷数为72～108。
优选的，所述阴离子表面活性剂为6-(3-(3,4-邻二苯酚)丙酰胺)己基硫酸钠。
优选的，所述超级正电荷蛋白与所述阴离子表面活性剂的摩尔比为(0.5～2)：1。
优选的，所述阴离子型表面活性剂与金属离子的摩尔比为3：(0.5～2)。
优选的，所述稀土蛋白粘合剂的含水量为5～15％。
本发明提供一种高强度的稀土蛋白粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
A)将超级正电荷蛋白和阴离子表面活性剂分别溶于超纯水中，得到超级正电荷蛋白溶液和阴离子表面活性剂溶液；
所述阴离子型表面活性剂具有邻苯二酚结构单元；
B)将所述阴离子表面活性剂溶液滴加至超级正电荷蛋白溶液中，混合均匀，得到粘合剂溶液；
C)将所述粘合剂溶液离心后冻干0.5～1小时，得到高强度的稀土蛋白粘合剂。
优选的，所述离心的速率为15000～18000rpm；
所述离心的时间为5～20min。
本发明提供了一种高强度的稀土蛋白粘合剂，由超级正电荷蛋白和阴离子型表面活性剂制成；所述阴离子型表面活性剂具有邻苯二酚结构。本发明以超级正电荷蛋白为主要成分，与具有邻苯二酚结构的阴离子表面活性剂配伍，超级电荷蛋白与阴离子型表面活性通过静电力作用形成复合物后，还可进一步加入金属离子与蛋白进行鳌合，掺杂金属离子经非共价键作用形成络合物，从而增强该粘合剂的粘附性。实验结果证明，本发明中的稀土蛋白粘合剂在不同条件(干样、湿样以及动物表皮)下均能表现出优异的黏合性能。并且，本发明制备工艺简单、无需特殊设备、成本低且绿色环保。与现有技术相比，本发明具有良好的生物相容性以及可降解性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中的稀土蛋白粘合剂剪切力测试拉伸装置示意图；
图2为本发明实施例5中所述蛋白粘合剂组成示意图，与正电荷接触的曲线代表蛋白序列骨架；
图3为本发明实施例5和实施例6中的蛋白粘合剂在不同材质的表面的剪切强度；
图4为本发明实施例1～6中的稀土蛋白粘合剂在钢片表面的剪切强度；
图5为本发明实施例6中的稀土蛋白粘合剂在猪皮表面的剪切强度；
图6为本发明实施例5～6中蛋白粘合剂在潮湿环境下的剪切强度。
具体实施方式
本发明提供了一种高强度的稀土蛋白粘合剂，由超级正电荷蛋白和阴离子型表面活性剂制成；
所述阴离子型表面活性剂具有邻苯二酚结构单元。
在本发明中，所述超级正电荷蛋白优选按照以下步骤进行表达：
将超级正电荷蛋白K系列载体质粒转化进毕赤酵母(GS115/X-33/KM71)或大肠杆菌表达菌株(BL21/BL21DE3/BLRDE3)，挑取单克隆菌落，用LB培养液进行过夜培养；将过夜活化的表达种子液加入TB培养基，待菌液达到OD600数值为0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷并降温到30度进行过量表达。诱导12小时收集菌体，用裂解缓冲液重悬，加入蛋白酶抑制剂，DNA酶，溶菌酶，用高压破碎机破碎菌体，10000rpm转速以上离心，收集上清液，HPLC纯化，最终得到超级正电荷蛋白。
在本发明中，所述超级正电荷蛋白的电荷数优选为72～108；所述超级正电荷蛋白为未折叠的超级正电荷蛋白。
在本发明中，所述阴离子表面活性剂具有邻苯二酚结构单元，优选为6-(3-(3,4-邻二苯酚)丙酰胺)己基硫酸钠。
在本发明中，所述稀土蛋白粘合剂中优选还包括金属离子，所述金属离子优选为Fe3+和/或Tb3+。
在本发明中，所述超级正电荷蛋白(以赖氨酸计)与阴离子表面活性剂的摩尔比优选为(0.5～2)：1，更优选为1：1；所述阴离子表面活性剂与金属离子的摩尔比优选为3：(0.5～2)，更优选为3：1。
在本发明中，所述高强度的稀土蛋白粘合剂由上述三种成分的水溶液配制得到，最终得到的高强度的稀土蛋白粘合剂中的水含量优选为5～15％，更优选为8～10％。
本发明还提供了一种高强度的稀土蛋白粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
A)将超级正电荷蛋白和阴离子表面活性剂分别溶于超纯水中，得到超级正电荷蛋白溶液和阴离子表面活性剂溶液；
所述阴离子型表面活性剂具有邻苯二酚结构单元；
B)将所述阴离子表面活性剂溶液滴加至超级正电荷蛋白溶液中，混合均匀，得到粘合剂溶液；
C)将所述粘合剂溶液离心后冻干0.5～1小时，得到高黏附力的稀土蛋白粘合剂。
在本发明中，所述超级正电荷蛋白的种类和制备方法与上文所述的超级正电荷蛋白的种类和方法一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述阴离子表面活性剂优选为6-(3-(3,4-邻二苯酚)丙酰胺)己基硫酸钠，以3,4-二羟基苯基丙酸为起始原料，通过多步保护与脱保护、胺化反应，亲核取代反应，通过柱色谱进行纯化即可。其合成工艺路线为本领域技术人员所熟知的方法，在此不再赘述。
在本发明中，所述超级正电荷蛋白溶液的摩尔浓度优选为200～300μmol/L，更优选为220～250μmol/L；所述阴离子表面活性剂溶液的摩尔浓度优选为10～20μmol/L。
在本发明中，将所述阴离子表面活性剂溶液滴加至超级正电荷蛋白溶液中，混合均匀后，优选加入铁盐和/或铽盐，得到粘合剂溶液。
所述铁盐优选为FeCl3；所述铽盐优选为TbCl3。
在本发明中，所述超级正电荷蛋白、阴离子表面活性剂和金属离子的用量与上文中所述的超级正电荷蛋白、阴离子表面活性剂和金属离子的用量一致，在此不再赘述。
得到粘合剂溶液后，本发明将所述粘合剂溶液进行高速离心，然后直接冻干，得到高强度的稀土蛋白粘合剂。
在本发明中，所述离心的速率优选为15000～18000rpm，更优选为16000～17000rpm，最优选为16800rpm；所述离心的时间优选为5～20min，更优选为10～15min。
所述冻干的时间优选为0.5～1小时。
本发明中的稀土蛋白粘合剂不仅能够应用在普通的干燥表面，还能够应用在潮湿的环境和表面，同样具有高强的粘合力，而且，因本发明中的稀土蛋白粘合剂还具有良好的生物相容性，其还可作为医用材料，应用于伤口止血和愈合。
具体的，本发明中的稀土蛋白粘合剂可应用在钢片表面、聚乙烯表面、聚氯乙烯表面以及动物表皮。
本发明提供了一种高强度的稀土蛋白粘合剂，由超级正电荷蛋白和阴离子型表面活性剂制成；所述阴离子型表面活性剂具有邻苯二酚结构。本发明以超级正电荷蛋白为主要成分，与具有邻苯二酚结构的阴离子表面活性剂配伍，超级电荷蛋白与阴离子型表面活性通过静电力作用形成复合物后，同时，加入金属离子与蛋白进行鳌合，掺杂金属离子经非共价键作用形成络合物，从而增强该粘合剂的粘附性。实验结果证明，本发明中的稀土蛋白粘合剂在不同条件(干样、湿样以及动物表皮)下均能表现出优异的黏合性能。并且，本发明制备工艺简单、无需特殊设备、成本低且绿色环保。与现有技术相比，本发明具有良好的生物相容性以及可降解性。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种高强度的稀土蛋白粘合剂及其制备方法进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例中，超级电荷K系列蛋白中的“K”表示正电荷。
实施例1
将超级正电荷蛋白K系列载体质粒转化进大肠杆菌表达菌株BL21DE3，挑取单克隆菌落，用LB培养液进行过夜培养；将过夜活化的表达种子液加入TB培养基，待菌液达到OD600数值为0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷并降温到30度进行过量表达。诱导12小时收集菌体，用裂解缓冲液重悬，加入蛋白酶抑制剂，DNA酶，溶菌酶，用高压破碎机破碎菌体，10000rpm转速以上离心，收集上清液，HPLC纯化，最终得到超级正电荷蛋白，每个蛋白分子所带正电荷个数为72。
按照摩尔比1:1称取上述超级电荷K系列蛋白及相应的表面活性剂，分别溶于超纯水中，得到10μmol/L的表面活性剂水溶液和220μmol/L的超级电荷K系列蛋白水溶液，将表面活性剂溶液滴加到超级电荷K系列蛋白水溶液中，混合均匀后加入FeCl3即可相应混合物水溶液，Fe3+与表面活性剂的摩尔比为1:3。
将混合物水溶液以16800rpm的速率离心10min，离心后，倾倒上层清液，将下层沉淀冻干0.5小时即可得到含水量为10％的稀土蛋白黏合剂，记为K72-NDP-Fe。
实施例2
按照实施例1中的方法制备得到稀土蛋白粘合剂，记为K72-NDP-Tb，不同的是，本实施例使用TbCl3代替实施例1中的FeCl3。
实施例3
按照实施例1中的方法制备得到稀土蛋白粘合剂，记为K108-NDP-Fe不同的是，本实施例中的超级电荷K系列蛋白的正电荷个数为108。
实施例4
按照实施例3中的方法制备得到稀土蛋白粘合剂，记为K108-NDP-Tb不同的是，本实施例使用TbCl3代替实施例1中的FeCl3。
实施例5
按照实施例1中的方法制备得到稀土蛋白粘合剂，记为K72-NDP，不同的是，本实施例中不添加FeCl3。
实施例6
按照实施例3中的方法制备得到稀土蛋白粘合剂，记为K108-NDP，不同的是，本实施例中不添加FeCl3。
将上述实施例制得的稀土蛋白粘合剂分别在干燥、潮湿环境，以及不同粘合表面进行剪切力测试，测试装置如图1所示。结果如图3～6所示。
图3为本发明实施例5和实施例6中的蛋白粘合剂在不同材质的表面的剪切强度。由图3可以看出，本发明中的蛋白粘合剂在钢片粘合性能最好，实施例6中带108个正电荷的蛋白粘合剂在聚氯乙烯表面的粘合性能更好，实施例5中带72个正电荷的蛋白粘合剂在聚乙烯表面的粘合性能更好。但其随着表面材质不同，整体的粘合性能变化趋势与市售的502胶水变化趋势一致。
图4为本发明实施例1～6中的稀土蛋白粘合剂在钢片表面的剪切强度，由图4可以看出，本发明中通过金属离子鳌合增强的实施例1和2中的稀土蛋白粘合剂其粘附性能已与市售502胶水达到的相同或相似的水平，甚至实施例3中的稀土蛋白粘合剂的剪切强度超过了市售502胶水，说明本发明中的稀土蛋白粘合剂具有优异的粘合性能。
图5为本发明实施例6中的蛋白粘合剂在猪皮表面的剪切强度，由图5可以看出，该蛋白粘合剂在动物表皮上具有一定的粘合能力。
图6为本发明实施例5～6中蛋白粘合剂在潮湿环境下的剪切强度，由图6可以看出，本发明中的蛋白粘合剂在潮湿环境下具有较强的粘合性能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种高强度的蛋白粘合剂，由超级正电荷蛋白和阴离子型表面活性剂制成；
所述阴离子型表面活性剂为6-(3-(3,4-邻二苯酚)丙酰胺)己基硫酸钠；
所述超级正电荷蛋白按照以下步骤进行表达：
将超级正电荷蛋白K系列载体质粒转化进毕赤酵母或大肠杆菌表达菌株，挑取单克隆菌落，用LB培养液进行过夜培养；将过夜活化的表达种子液加入TB培养基，待菌液达到OD600数值为0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷并降温到30度进行过量表达；诱导12小时收集菌体，用裂解缓冲液重悬，加入蛋白酶抑制剂，DNA酶，溶菌酶，用高压破碎机破碎菌体，10000rpm转速以上离心，收集上清液，HPLC纯化，最终得到超级正电荷蛋白；
所述超级正电荷蛋白的电荷数为72～108；
所述超级正电荷蛋白与所述阴离子表面活性剂的摩尔比为(0.5～2)：1。
2.根据权利要求1所述的蛋白粘合剂，其特征在于，所述蛋白粘合剂由超级正电荷蛋白、阴离子型表面活性剂和金属离子制成；
所述金属离子为Fe3+和/或Tb3+。
3.根据权利要求2所述的蛋白粘合剂，其特征在于，所述阴离子型表面活性剂与金属离子的摩尔比为3：(0.5～2)。
4.根据权利要求1或2所述的蛋白粘合剂，其特征在于，所述蛋白粘合剂的含水量为5～15％。
5.如权利要求1所述的高强度的蛋白粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
A)将超级正电荷蛋白和阴离子表面活性剂分别溶于超纯水中，得到超级正电荷蛋白溶液和阴离子表面活性剂溶液；
所述阴离子型表面活性剂具有邻苯二酚结构单元；
B)将所述阴离子表面活性剂溶液滴加至超级正电荷蛋白溶液中，混合均匀，得到粘合剂溶液；
C)将所述粘合剂溶液离心后冻干0.5～1小时，得到高强度的蛋白粘合剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述离心的速率为15000～18000rpm；
所述离心的时间为5～20min。
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