CN110372772A - 一种应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法 - Google Patents

一种应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110372772A
CN110372772A CN201910691782.0A CN201910691782A CN110372772A CN 110372772 A CN110372772 A CN 110372772A CN 201910691782 A CN201910691782 A CN 201910691782A CN 110372772 A CN110372772 A CN 110372772A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solid phase
pipette tips
dispersed solid
microextraction column
phase microextraction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910691782.0A
Other languages
English (en)
Inventor
王倩
安德鲁.李
冯玥
杨佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi Micro Chromatography Biological Science And Technology Co Ltd
Original Assignee
Wuxi Micro Chromatography Biological Science And Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuxi Micro Chromatography Biological Science And Technology Co Ltd filed Critical Wuxi Micro Chromatography Biological Science And Technology Co Ltd
Priority to CN201910691782.0A priority Critical patent/CN110372772A/zh
Publication of CN110372772A publication Critical patent/CN110372772A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)

Abstract

本发明涉及一种应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法，采用枪头式分散固相微萃取柱，内含IMtipsTM金属离子树脂作为湿性填料，通过从枪头式分散固相微萃取柱底端吸入的方式，通过简单的吸打过程，完成His标签融合蛋白的结合、洗涤、洗脱。在吸液过程中，松散的湿性填料随溶液向上翻涌至湍流区，与样品快速混合，利用涡旋混合保证填料与样品具有更大的接触表面积，使得相对于其他亲和纯化柱具有更快的结合或洗脱速度，可高效的完成洗涤、洗脱过程，不仅节省纯化时间还能显著减少溶剂的用量。在与自动移液系统配套使用时，可同时进行数十甚至数百个样品的批量处理，实现在短时间内同时纯化多个样品，属于一种快速、高通量的蛋白纯化过程。

Description

一种应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的 方法
技术领域
本发明涉及固相萃取分离装置，以及利用该固相萃取分离装置对His标签融合蛋白的纯化方法。
背景技术
近年来，重组蛋白的应用有了显著增长，与此同时，用于重组蛋白表达和纯化的技术和产品也得以增长。自从亲和标签融合技术出现以来，多种多样的短肽或蛋白亲和标签极大地方便了外源表达重组蛋白的分离与蛋白质复合体的纯化，已成为蛋白质研究领域不可或缺的工具。它们不仅便于对融合蛋白的检测与纯化，而且可能对目标蛋白的理化性质产生有利的影响，可以提高重组蛋白的产量，增强重组蛋白的可溶性，促进重组蛋白的正确折叠。并且具有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、适用性广泛等优点，为蛋白质的有效纯化提供了一条解决的途径，广泛应用于蛋白质结构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。
多聚组氨酸标签(His-tag)是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签，广泛用于多种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。His标签一般为5～15个组氨酸，被认为是重组蛋白纯化的首选标签，具有以下优点：(1)位于目标蛋白N端的His标签与细菌的转录翻译机制相互兼容，利于蛋白的表达；(2)His标签几乎不影响目标蛋白的理化性质；(3)His标签很小，不会改变目标蛋白的可溶性；(4)His标签在目标蛋白结晶后对蛋白结构几乎没有影响；(5)采用固定化金属离子亲和层析纯化His标签融合蛋白时，其操作非常简便。基于上述优点，His标签融合蛋白的固定化金属离子亲和层析(immobilized metal-ionaffinity chromatography,IMAC)被作为主要的蛋白纯化方法。
His标签融合蛋白一般采用固定化金属离子亲和层析进行分离纯化。固定化金属离子亲和层析，又称金属螯合层析，是上世纪70年代中期发展起来的一种新型分离技术。这一纯化技术是基于His标签序列中连续的组氨酸与固定化金属离子，如Ni2+、Co2+、Zn2+、Cu2+等之间的亲和力。金属离子通过螯合作用经一个与固相支持物共价结合的反应基团被固定在树脂上。自从His标签出现以来，已利用固定化金属离子亲和层析分离纯化了众多的His标签融合蛋白与多肽。更重要的是，由于His标签具有高度的结合特异性，因而在变性与非变性条件下均可以进行融合蛋白的亲和纯化，使得该标签的应用范围更广。
从重组蛋白的表达优化，到小量诱导纯化，再到中试、大规模生产需要众多繁琐、大量的工作，包括上游蛋白突变体的筛选、功能鉴定，各阶段诱导表达及纯化条件的优化及QA、QC等多个环节。快速、可靠、高效的自动化分离分析技术可将极大地提到效率，降低时间、人员成本。如何在高重现性的条件下，最小的人为干预的情况下，高通量、小规模的蛋白的生产和纯化成为关键，从而避免把时间浪费在反复摸索蛋白样品制备方案上。磁珠法(Magnetic Beads)、离心萃取法(Spin Column)以及重力柱法是常见的实验室蛋白纯化的方法，但这些方法有的通量较低，价格昂贵、不能反复清洗使用等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用枪头式悬浮固相萃取技术(Dispersive SolidPhase Extraction,DSPE)进行His标签融合蛋白纯化的高通量方法，该方法通过将松散的湿性填料与特制枪头式分散移液管相结合，构成枪头式分散固相微萃取柱，通过从枪头式分散固相微萃取柱底端吸入的方式，通过简单的吸打过程，完成His标签融合蛋白的结合、洗涤、洗脱过程，不需要振荡、离心等操作步骤，也不需要其他辅助仪器设备就可完成蛋白的纯化，达到快速纯化目标抗体的目的。
本发明解决上述问题所采用的技术方案为：
一种应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤，
(1)枪头式分散固相微萃取柱规格选择：采用枪头式分散固相微萃取柱，内含IMtipsTM金属离子树脂作为湿性填料；结合缓冲液组成：磷酸钠，氯化钠，咪唑，pH 7±0.5；
(2)样品处理：将大肠杆菌菌液离心，弃去上清液，用结合缓冲液重悬菌体沉淀后，超声破碎菌体，离心后取上清液作为样品溶液；
(3)预处理：取出枪头式分散固相微萃取柱，与移液器紧密结合后，吸入结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中金属离子树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打数次，最后排空弃掉全部的结合缓冲液；
(4)样品吸附：用步骤(3)中预处理后的萃取柱吸入步骤(2)中准备的样品溶液，吸液过程中使微萃取柱中金属离子树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打数次，最后排空；
(5)洗涤：继续吸入结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中金属离子树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打数次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(6)目的蛋白洗脱：一次或分多次吸入含磷酸钠，NaCl，咪唑的洗脱缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中金属离子树脂充分悬浮，然后打出液体，如此反复吸打数次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的蛋白溶液；
(7)中和、透析：向步骤(6)纯化过的蛋白溶液中加入Tris buffer或选择中性溶液进行透析。
上述枪头式分散固相微萃取柱，包括锥形移液管和连接管，所述锥形移液管和连接管为一整体成型件，在锥形移液管的尖头端和连接管的上端分别设置有可脱卸的保护帽体，所述锥形移液管的尖头管口处设置有过滤层，所述过滤层具有能够使液体试样通过的孔或孔隙结构；所述过滤层的上方为填料层，所述填料层为堆积在所述过滤层上方的松散的湿性填料；所述湿性填料上方为湍流室，所述湍流室上部设置有透气挡板；所述液体试样由下而上经所述过滤层过滤将湿性填料在混合室内冲散，裹挟着湿性填料的液体试样再经所述分散环冲入倒锥形的湍流室完成亲和吸附；所述连接管位于移液管的上端，所述连接管作为密封接头，所述连接管具有光滑的内壁。
可选地，上保护帽体与连接管相匹配，下保护帽体与锥形移液管的尖头端相匹配，可根据具体的移液管和连接管的形貌的变化而变化，确保紧密贴合，防止其他物质污染及内部液体蒸发；上下帽体的个数包括但不仅限于8或12个，材质包括但不仅限于PVC、硅胶、橡胶或聚四氟乙烯等材料。
可选地，所述连接管的内径包含但不仅限于6.8mm，可根据各种品牌及型号的手动移液器或自动移液工作站的吸嘴外径大小进行调节，保证连接管与吸嘴紧密结合、不漏液漏气。
可选地，本申请的枪头式分散固相微萃取柱不限于枪头形状，所述锥形移液管不限于尖头形状，可根据样品性质及样品管形状而改变。
可选地，所述移液管的典型规格包括但不仅限于300μL、1mL、5mL，其材质包含但不仅限于聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、PVC、PET，所有可做成枪头形状而不与纯化样品及纯化过程中所使用的溶液发生反应的材料。
可选地，所述过滤层选自多孔玻璃、多孔氧化物、玻璃纤维、多孔高分子或金属网中的一种或几种的混合。其目的是为了保证液体及气体的自由通过，但同时确保装载的填料不泄露，因此其过滤膜的孔径应小于装载的填料孔径，并可根据装载填料的不同而变，其材料将不阻塞纯化样品及纯化过程中所使用溶液的吸打过程。
可选地，所述湿性填料的体积占移液管体积的0.3％～15％，例如典型的填料体积包含但不仅限于当枪头体积为300μL时，填料体积为1-10μL；当枪头体积为1mL时，填料体积为10-100μL。包括但不仅限于以琼脂糖或磁性琼脂为载体；可与His标签融合蛋白结合的镍或钴离子亲和树脂为最常见填料；其它如偶联蛋白A/G、钴离子、谷胱甘肽、链霉亲和素或偶联抗原、抗体等亲和树脂也可用在相应融合蛋白的提纯中；孔径通常大于20μm，且不得小于或等于与之匹配的过滤层的孔径或空隙大小。
可选地，所述填料层上方设置有分散环，所述分散环为能够在湍流室内上下自由浮动，当液体试样或气体从下端吸入时，分散环会随之上下浮动，和填料反复接触，促进填料在湍流室内湍流混合；或所述分散环为设置在锥形移液管内壁的突出环，或所述分散环为带有分配孔的网孔结构，也可以选择不规则形状、表面凹凸不平的结构。采用环状是批量装配时更利于流水线生产。该零件材质包含但不仅限于聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、PVC等。
可选地，所述透气挡板的孔径小于装载的填料孔径，且一般要求具有一定的厚度，确保装载填料不泄露，通气的同时可防止液体流出；其材质不吸附样品中待纯化的目标化和物。
基于上述枪头式分散固相微萃取柱的纯化方法是指在上述枪头式分散固相萃取装置中完成的全部目标化合物的纯化过程，无需再进行离心等其他操作，以300μL枪头式悬浮固相萃取装置为例，包括但不仅限于以下步骤：
A)预处理(活化平衡)：吸打250μL结合缓冲液，重复3次；
B)样品吸附：吸打200μL溶于结合缓冲液中的样品，重复20次；
C)洗涤1：吸打250μL结合缓冲液，重复3次；
D)洗涤2(可选步骤)：吸打250μL结合缓冲液，重复3次；
E)目的蛋白洗脱：吸打100μL洗脱缓冲液，重复5次。
其中每步吸打的次数、体积、速度、力度，静置时间(如有)及缓冲液根据填料类型、样品性质及仪器型号而定。
上述枪头式分散固相萃取装置可配套手动移液器进行小批量纯化操作，也可配套自动移液工作站，比如Hamilton Microlab Nimbus液体处理自动工作站、Integra液体处理自动工作站，实现高通量纯化操作。
与现有技术相比，本发明的优点在于：采用特制的枪头式分散固相微萃取柱，当从底端吸入液体时，松散的湿性填料随溶液向上翻涌至湍流区，与样品快速混合，利用涡旋混合保证填料与样品具有更大的接触表面积，使得相对于其他亲和纯化柱具有更快的速度，更便捷的操作，并且可高效的去除样品中其他杂质，节省样品制备时间的同时能有效的减少溶剂的用量。同时可配套使用Hamilton、Integra等多种自动移液系统，以实现在短时间内同时纯化多个样品(根据自动移液系统的配置可以达到96或384个样品的批量处理)，属于一种快速、高通量的蛋白纯化过程。
附图说明
图1为本发明实施例枪头式分散固相微萃取柱的结构示意图；
图2为本发明实施例1中IMtipsTM纯化过程示意，其吸打次数可根据不同样品及体积进行调整；
图3通过SDS-PAGE检测重组his标签蛋白纯化前的表达效果；
图4通过SDS-PAGE检测重组his标签蛋白纯化后的表达效果；
图3-4中，序号1-7分别代表平行表达的7组β-葡萄糖醛酸酶样品，图中序号8为市售β-葡萄糖醛酸酶纯品；
图1中1锥形移液管、2连接管、3过滤层、4填料层(湿性填料)、5分散环、6透气挡板、a流室。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
如图1所示，本实施例采用的枪头式分散固相微萃取柱，包括作为一个整体的锥形移液管1和连接管2，锥形移液管1的尖头管口处设置有过滤层3，过滤层3具有能够使液体试样通过的孔或孔隙结构；过滤层3的上方为填料层4，填料层4为堆积在所述过滤层3上方的松散的湿性填料；填料层上方的可设置分散环5，分散环5可以在管体内上下自由移动，当液体或气体从下端吸入时，分散环5会随之在湍流室a内上下移动，和填料反复接触，促进填料在萃取柱内湍流混合；对某些易分散树脂，枪头式分散固相微萃取柱可不配有分散环；湍流室上部设置有透气挡板6；液体试样由下而上经过滤层3将湿性填料4冲散，裹挟着湿性填料的液体试样和分散环5相互作用，冲入倒锥形的湍流室a完成亲和吸附；连接管2位于移液管1的上端，连接管2作为密封接头，连接管2内壁可以和吸嘴紧密接触。
头式分散固相微萃取柱可配合手动移液管：包含但不仅限于艾本德、吉尔森、大龙、瑞宁等300μL、1mL、5mL规格手动移液器。也可配套自动移液工作站：包含但不仅限于Integra或Hamilton等自动移液工作站，枪头上端内径可根据自动移液工作站的接头进行改变，使之紧密结合不漏液漏气，与移液工作站搭配时，更同时对多个萃取柱操作，完成高通量纯化作业。
实施例1：利用钴树脂为填料的1mL枪头式分散固相微萃取柱(IMtipsTM)对大肠杆菌菌液中重组his标签蛋白的手动纯化
(1)枪头式分散固相微萃取柱选择：本实验应用标准1mL IMtipsTM钴树脂枪头式分散固相微萃取柱，内含25μL cobalt-IMAC slurry树脂；结合缓冲液组成：20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，20～40mM咪唑，pH 7.4。
注：树脂也可以采用其它类似的钴树脂或镍树脂，根据树脂不同，下列的各步骤的溶液组成及体积需根据树脂的厂家要求进行微调。以下各步骤选择体积根据待提纯蛋白量0.5-1mg而定，根据重组蛋白表达效率，可微调各步骤的所选体积。一般而言，每1μL树脂可以提纯40μg标签蛋白。以25μL cobalt-IMAC slurry树脂为例，可以提取1mg的标签蛋白。
(2)样品处理：将大肠杆菌菌液离心，弃去上清，用结合缓冲液重悬菌体沉淀(0.5mL–2.5mL)后，超声破碎菌体，离心后取上清液作为样品溶液用于步骤(4)；
(3)预处理：取1mL IMtipsTM钴树脂枪头式分散固相微萃取柱，除去上下保护帽体，与手动移液器紧密结合后，吸入800μL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(4)样品吸附：用步骤(3)中预处理后的萃取柱吸入步骤(2)中准备的样品，一次吸入体积800μL，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打5-10次，最后排空；
(5)洗涤1：继续吸入800μL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(6)洗涤2：继续吸入800μL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉结合缓冲液；(选择性进行)
(7)目的蛋白洗脱1：吸入200μL含20mM磷酸钠，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 7.4洗脱缓冲液(注：如果只用一次洗脱，则需要350-500μL)，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的蛋白溶液；
(8)目的蛋白洗脱2(可选项)：上述微萃取柱中吸入200μL含20mM磷酸钠,0.5 M NaCl,500mM咪唑，pH 7.4的洗脱缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的重组蛋白溶液；
(9)中和、透析：在上述纯化过的蛋白溶液中加入50μL 1M Tris buffer。也可根据下游实验选择合适的中性溶液对步骤(8)获得的蛋白溶液进行透析。
实施例2：利用钴树脂为填料的5mL枪头式分散固相微萃取柱(IMtipsTM)对大肠杆菌菌液中重组his标签蛋白的手动纯化
(1)枪头式分散固相微萃取柱选择：本实验应用标准5mL IMtipsTM钴树脂枪头式分散固相微萃取柱，内含100μL cobalt-IMAC slurry树脂；结合缓冲液组成：20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，20～40mM咪唑，pH 7.4。
(2)样品处理：将大肠杆菌菌液离心，弃去上清，用结合缓冲液重悬菌体沉淀(2mL–10mL)后，超声破碎菌体，离心后取上清液作为样品溶液用于步骤(4)；
(3)预处理：取出5mL IMtipsTM钴树脂枪头式分散固相微萃取柱，除去上下保护帽体，与手动移液器紧密结合后，吸入3mL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉1×结合缓冲液；
(4)样品吸附：用步骤(3)中预处理后的萃取柱吸入步骤(2)中准备的样品，一次吸入体积3mL，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打5-10次，最后排空；
(5)洗涤1：继续吸入3mL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(6)洗涤2：继续吸入3mL pH 7.41×结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉1×结合缓冲液；
(7)目的蛋白洗脱1：最后吸入800μL含20mM磷酸钠，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 7.4洗脱缓冲液(注：如果只用一次洗脱，则需要1.5-2mL)，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的蛋白溶液；
(8)目的蛋白洗脱2(可选项)：上述微萃取柱中吸入800μL含20mM磷酸钠,0.5MNaCl,500mM咪唑，pH 7.4的洗脱缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的重组蛋白溶液；
(9)中和、透析：在上述纯化过的蛋白溶液中加入2mL 1M Tris buffer。也可根据下游实验选择合适的中性溶液对步骤(8)获得的蛋白溶液进行透析。
实施例3：利用钴树脂为填料的300μL枪头式分散固相微萃取柱(IMtipsTM)对大肠杆菌菌液中重组his标签蛋白的手动法纯化
(1)枪头式分散固相微萃取柱选择：本实验应用标准300μL IMtipsTM钴树脂枪头式分散固相微萃取柱，内含5μL cobalt-IMAC slurry树脂；结合缓冲液缓冲液组成：20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，20～40mM咪唑，pH 7.4。
(2)样品处理：将大肠杆菌菌液离心，弃去上清，用结合缓冲液重悬菌体沉淀(0.1mL–0.5mL)后，超声破碎菌体，离心后取上清液作为样品溶液用于步骤(4)；
(3)预处理：取出300μL IMtipsTM钴树脂枪头式分散固相微萃取柱，除去上下保护帽体，与手动移液器紧密结合后，吸入160μL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(4)样品吸附：用步骤(3)中预处理后的萃取柱吸入步骤(2)中准备的样品，一次吸入体积160μL，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打5-10次，最后排空；
(5)洗涤1：继续吸入160μL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(6)洗涤2：继续吸入160μL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(7)目的蛋白洗脱1：吸入40μL含20mM磷酸钠,0.5M NaCl,500mM咪唑，pH 7.4的洗脱缓冲液(注：如果只用一次洗脱，则需要70-100μL)，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的蛋白溶液；
(8)目的蛋白洗脱2(可选项)：上述微萃取柱中吸入40μL含20mM磷酸钠,0.5MNaCl,500mM咪唑，pH 7.4的洗脱缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的重组蛋白溶液；
(9)中和、透析：在上述纯化过的蛋白溶液中加入10μL 1M Tris buffer。也可根据下游实验选择合适的中性溶液对步骤(8)获得的蛋白溶液进行透析。
实施例4：利用Hamilton Microlab Nimbus液体处理自动工作站及1mL钴树脂枪头式分散固相微萃取柱(IMtipsTM)对大肠杆菌菌液中重组his标签蛋白的自动纯化
(1)枪头式分散固相微萃取柱选择：本实验应用标准1mL IMtipsTM钴树脂枪头式分散固相微萃取柱，内含25μL cobalt-IMAC slurry树脂(钴树脂)；结合缓冲液组成：20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，20～40mM咪唑，pH 7.4。
(2)样品处理：将大肠杆菌菌液离心，弃去上清，用结合缓冲液重悬菌体沉淀(0.5mL–2.5mL)后，超声破碎菌体，离心后取上清液作为样品溶液用于步骤(4)；
(3)预处理：取出1-96根1mL IMtipsTM钴树脂枪头式分散固相微萃取柱，除去上下保护帽体，与Hamilton自动移液器紧密结合后，吸入800μL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(4)样品吸附：用步骤(3)中预处理后的萃取柱吸入步骤(2)中准备的样品，一次吸入体积800μL，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打5-10次，最后排空；
(5)洗涤1：继续吸入800μL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(6)洗涤2：继续吸入800μL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(7)目的蛋白洗脱1：吸入200μL含20mM磷酸钠,0.5M NaCl,500mM咪唑，pH 7.4的洗脱缓冲液(注：如果只用一次洗脱，则需要350-500μL)，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的蛋白溶液；
(8)目的蛋白洗脱2(可选项)：上述微萃取柱中吸入200μL含20mM磷酸钠,0.5MNaCl,500mM咪唑，pH 7.4的洗脱缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的重组蛋白溶液；
(9)中和、透析：在上述纯化过的蛋白溶液中加入50μL 1M Tris buffer。也可根据下游实验选择合适的中性溶液对步骤(8)获得的蛋白溶液进行透析。
实施例5：利用Integra液体处理自动工作站及1mL钴树脂枪头式分散固相微萃取柱(IMtipsTM)对大肠杆菌菌液中重组his标签蛋白的自动法纯化
(1)枪头式分散固相微萃取柱选择：本实验应用标准1mL IMtipsTM钴树脂枪头式分散固相微萃取柱，内含25μL cobalt-IMAC slurry树脂；结合缓冲液组成：20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，20～40mM咪唑，pH 7.4。
(2)样品处理：将大肠杆菌菌液离心，弃去上清，用结合缓冲液重悬菌体沉淀(0.5mL–2.5mL)后，超声破碎菌体，离心后取上清液作为样品溶液用于步骤(4)；
(3)预处理：取出1-96根1mL IMtipsTM钴树脂枪头式分散固相微萃取柱，除去上下保护帽体，与Integra自动移液器紧密结合后，吸入800μL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(4)样品吸附：用步骤(3)中预处理后的萃取柱吸入步骤(2)中准备的样品，一次吸入体积800μL，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打5-10次，最后排空；
(5)洗涤1：继续吸入800μL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(6)洗涤2：继续吸入800μL结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(7)目的蛋白洗脱1：最后吸入200μL含20mM磷酸钠,0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 7.4的洗脱缓冲液(注：如果只用一次洗脱，则需要350-500μL)，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的蛋白溶液；
(8)目的蛋白洗脱2(可选项)：上述微萃取柱中吸入含200μL 20mM磷酸钠,0.5MNaCl,500mM咪唑，pH 7.4的洗脱缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中钴树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打3次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的重组蛋白溶液；
(9)中和、透析：在上述纯化过的蛋白溶液中加入50μL 1M Tris buffer。也可根据下游实验选择合适的中性溶液对步骤(8)获得的蛋白溶液进行透析。
结论：
通过SDS-PAGE(图3)检测重组his标签蛋白纯化效果，结果显示采用本申请纯化方法得到的蛋白纯度高、得率好。本申请提供了一种高通量的方法，提高了蛋白纯化效率，简化纯化过程、减少缓冲液的使用，且蛋白的得率和纯度完全能够满足纯化要求，在提高纯化效率的前提下依然确保蛋白的纯度和收得率。与常规离心柱形式相比，提取过程不需要额外的孵育时间或额外的离心等步骤，有效提高蛋白纯化效率，且只需要很少的缓冲液即可完成所有蛋白纯化过程。
除上述实施例外，本发明还包括有其他实施方式，凡采用等同变换或者等效替换方式形成的技术方案，均应落入本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤，
（1）枪头式分散固相微萃取柱规格选择：采用枪头式分散固相微萃取柱，内含 IMtipsTM金属离子树脂作为湿性填料；结合缓冲液组成：磷酸钠，氯化钠，咪唑，pH 7±0.5；
（2）样品处理：将原液离心，弃去上清液，用结合缓冲液重悬菌体沉淀，超声破碎菌体，离心后取上清液作为样品溶液；
（3）预处理：取出枪头式分散固相微萃取柱，与移液器紧密结合后，吸入结合缓冲液缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中金属离子树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打数次，最后排空弃掉全部的结合缓冲液；
（4）样品吸附：用步骤（3）中预处理后的萃取柱吸入步骤（2）中准备的样品溶液，吸液过程中使微萃取柱中金属离子树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打数次，最后排空；
（5）洗涤：继续吸入结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中金属离子树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打数次，最后排空弃掉结合缓冲液；
（6）目的蛋白洗脱：一次或分多次吸入洗脱缓冲液，含磷酸钠、NaCl、咪唑，吸液过程中使微萃取柱中金属离子树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打数次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的蛋白溶液；
中和、透析：向步骤（6）纯化过的蛋白溶液中加入Tris buffer或选择中性溶液进行透析。
2.根据权利要求1所述的应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法，其特征在于：所述枪头式分散固相微萃取柱包括锥形移液管和连接管，所述锥形移液管和连接管为一整体成型件，在锥形移液管的尖头端和连接管的上端分别设置有可脱卸的保护帽体，所述锥形移液管的尖头管口处设置有过滤层，所述过滤层具有能够使液体试样通过的孔或孔隙结构；所述过滤层的上方为填料层，所述填料层为堆积在所述过滤层上方的松散的湿性填料；所述湿性填料上方为湍流室，所述湍流室上部设置有透气挡板；所述液体试样由下而上经所述过滤层过滤将湿性填料冲散，裹挟着湿性填料的液体试样冲入倒锥形的湍流室完成亲和吸附；所述连接管位于移液管的上端，所述连接管作为密封接头，所述连接管具有光滑的内壁。
3.根据权利要求2所述的应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法，其特征在于：所述填料层上方设置有分散环，所述分散环为能够在湍流室内上下自由浮动，当液体试样或气体从下端吸入时，分散环会随之上下浮动，和填料反复接触，促进填料在湍流室内湍流混合；或所述分散环为设置在锥形移液管内壁的突出环，或所述分散环为带有分配孔的网孔结构。
4.根据权利要求2所述的应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法，其特征在于：所述过滤层选自多孔玻璃、多孔氧化物、玻璃纤维、多孔高分子或金属网中的一种或几种的混合。
5.根据权利要求2所述的应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法，其特征在于：所述湿性填料的体积占移液管体积的0.3%～15%。
6.根据权利要求1所述的应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法，其特征在于：所述结合缓冲液组成：20 mM 磷酸钠，0.5 M 氯化钠，20～40 mM 咪唑，pH7.4；所述洗脱缓冲液的组成：20 mM 磷酸钠，0.5 M NaCl, 500 mM 咪唑，pH 7.4。
7.根据权利要求1所述的应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法，其特征在于：所述枪头式分散固相微萃取柱与手动移液管搭配进行小批量纯化操作，或与自动移液工作站搭配同步操作多个枪头式分散固相微萃取柱进行高通量纯化操作。
8.根据权利要求7所述的应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法，其特征在于：所述自动移液工作站包括Hamilton Microlab Nimbus 液体处理自动工作站、Integra 液体处理自动工作站。
9.根据权利要求1所述的应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法，其特征在于：步骤（2）所述原液包括细菌、哺乳动物细胞培养上清液、腹水、血清。
10.根据权利要求1所述的应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法，其特征在于：所述金属离子树脂包括镍树脂、钴树脂、锌树脂、铜树脂中的一种或多种的组合。
CN201910691782.0A 2019-07-30 2019-07-30 一种应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法 Pending CN110372772A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910691782.0A CN110372772A (zh) 2019-07-30 2019-07-30 一种应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910691782.0A CN110372772A (zh) 2019-07-30 2019-07-30 一种应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110372772A true CN110372772A (zh) 2019-10-25

Family

ID=68256647

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910691782.0A Pending CN110372772A (zh) 2019-07-30 2019-07-30 一种应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110372772A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114441663A (zh) * 2020-11-04 2022-05-06 中国科学院上海药物研究所 一种使用固相微萃取亲和选择质谱筛选蛋白质阳性化合物的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN207755811U (zh) * 2017-12-29 2018-08-24 无锡微色谱生物科技有限公司 一种枪头式分散固相微萃取柱

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN207755811U (zh) * 2017-12-29 2018-08-24 无锡微色谱生物科技有限公司 一种枪头式分散固相微萃取柱

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
温瑞兴等: "《药理学实验教程》", 31 May 2014, 北京工业大学出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114441663A (zh) * 2020-11-04 2022-05-06 中国科学院上海药物研究所 一种使用固相微萃取亲和选择质谱筛选蛋白质阳性化合物的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7304015B2 (en) Compositions for separating molecules
CA1324100C (en) Multiple stage affinity process for isolation of specific cells from a cell mixture
US8603345B2 (en) Devices for component removal during blood collection, and uses thereof
US11846635B2 (en) Magnetic immunoglobulin-binding particles
CN110231207B (zh) 一种分离外泌体的方法
CN110016435A (zh) 一种用于游离核酸提取的离心微流控芯片及其在提取游离核酸的方法
CN107402303B (zh) 循环肿瘤细胞分离富集微流控芯片及其富集方法
CN110372772A (zh) 一种应用枪头式分散固相微萃取柱纯化His标签融合蛋白的方法
CN102838674A (zh) 一种利用蛋白a的高密度包被磁珠纯化抗体的方法
CN106867900A (zh) 利用磁珠分选细胞的装置
CN110272487A (zh) 一种枪头式分散固相微萃取柱、基于该枪头式分散固相微萃取柱的纯化方法及应用
CN201857395U (zh) 一种基于免疫磁珠的顺序流动式全自动磁性分选装置
CN113101737A (zh) 一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用
WO2018234115A1 (en) COMBINATORY SEPARATION
CN109651502A (zh) 一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子ix、x和ⅶ的方法
CN106269223B (zh) 磁分离方法以及磁分离装置
CN207958198U (zh) 蛋白质分离提取装置
CN102965339A (zh) 一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法
CN209485830U (zh) 医院及家庭用均可使的富集尿液细胞外囊泡的装置
KR20210143767A (ko) 생체분자의 분리 방법
CN206814786U (zh) 利用磁珠分选细胞的装置
CN108220233B (zh) 细胞分离器具表面处理方法、相关器具、外周血稀有细胞或循环肿瘤细胞快速高效分离方法
CN107384878A (zh) 一种精纯猪圆环病毒的方法
JP4684533B2 (ja) 下層コロイド媒体からのフローティングにより生物サンプルを回収または除去する多段階法
EP0665893B1 (en) A method and an apparatus for detecting cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191025