CN110367243A - 一种用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球及制备方法，该空心琼脂糖球的制备是：步骤1)取10ml的海藻酸和碳酸钙的水溶液与20ml的含有卵磷脂及醋酸的石蜡油混合，得混合液；步骤2)将步骤1)的混合液过150目筛网，得到直径在60–100μm的海藻胶小球；步骤3)将海藻胶小球加入10ml质量百分比浓度为1％的琼脂糖溶液中，加热沸腾；步骤4)将步骤3)含海藻胶小球的琼脂糖溶液注入到磁力搅拌的10ml石蜡油中，形成琼脂糖小球，待琼脂糖小球冷却后过150目筛网得到直径在80–120μm的琼脂糖小球；步骤5)将直径在80–120μm的琼脂糖小球用清水洗净后加入50ml的柠檬酸溶液，柠檬酸溶液将琼脂糖小球中的海藻胶溶解后得到空心琼脂糖球。本发明简便有效。

Description

一种用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球及制备方法

技术领域

本发明涉及医学领域，具体涉及一种用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球及制备方法。

背景技术

随着环境污染日趋严重、激素滥用等导致男性精子质量和数量不断下降，男性不育比例日益增高，其中将近60％-75％的男性不育患者表现为少精子、弱精子、无精子症等。目前，临床上对于严重男性不育患者采用的基本策略都是先将取到的精子冷冻保存，然后再女方取卵当日解冻后挑选存活精子进行ICSI治疗。但由于精子数量太少，活力太差，所以对于精子的冷冻保存，目前在世界范围内仍然是个难题。

发明内容

本发明的目的是：针对现在有存在的问题，提供了一种用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球及方法。本发明利用空心琼脂糖球模拟空透明带作为载体进行精子冷冻，能有效简便的保存单个或微量精子，而且冷冻精子解冻后具有较高的精子回收率与存活率。

本发明的技术方案是：一种用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球，该空心琼脂糖球的制备是：

步骤1)取10ml的海藻酸和碳酸钙的水溶液与20ml的含有卵磷脂及醋酸的石蜡油混合，得混合液；其中，水溶液中海藻酸为3％，碳酸钙为0.6％；石蜡油中卵磷脂为3％，醋酸为0.5％；上述百分比均为质量百分比；

步骤2)将步骤1)的混合液过150目筛网，得到直径在60–100μm的海藻胶小球；

步骤3)将步骤2)的海藻胶小球加入10ml质量百分比浓度为1％的琼脂糖溶液中，加热沸腾；

步骤4)将步骤3)含海藻胶小球的琼脂糖溶液注入到磁力搅拌的10ml石蜡油中，形成琼脂糖小球，待琼脂糖小球冷却后过150目筛网得到直径在80–120μm的琼脂糖小球；

步骤5)将直径在80–120μm的琼脂糖小球用清水洗净后加入50ml的柠檬酸溶液，柠檬酸溶液将琼脂糖小球中的海藻胶溶解后得到空心琼脂糖球。

所述步骤4)含海藻胶小球的琼脂糖溶液是通过1ml针管进行注入。

一种用于单精子冷冻保存的方法，利用上述所述的用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球，通过持针将该空心琼脂糖球固定，将筛选的精子注射入到空心琼脂糖球中；将内有精子的空心琼脂糖球，转移至冷冻载杆上；然后将装有空心琼脂糖球的冷冻载杆，置于液氮泡沫盒上方10cm处开始熏蒸，经5min逐渐下降至液氮蒸汽内，再静置1min后，将冷冻载杆投入液氮，可长期保存。

所述的一种用于单精子冷冻保存的方法，具体包括如下步骤：

步骤S1：精子冷冻皿的制备

精子冷冻皿的制备：皿内包含一个PVP滴和数个精子注射滴，以及一个平铺的精子筛选滴，在无CO₂的37℃培养箱内过夜平衡，备用；其中，数个精子注射滴是用含10％SSS的m-HTF做成的液滴；

步骤S2：精子冷冻液的准备

不含蛋黄的精子冷冻液以1：1的比例用含10％SSS的mHTF稀释而成；

步骤S3：精子解冻液的准备

添加1ml含10％SSS的m-HTF液体于双井皿中，在无CO₂的37℃培养箱内过夜平衡，备用；

步骤S4：精子注射和冷冻

①在400X的放大倍数下，筛选活力好且无形态学畸形的精子；

②通过持针将空心琼脂糖球固定，将筛选的精子注射入到空心琼脂糖球中，根据具体情况，注射入1-5条精子；

③将内有精子的空心琼脂糖球，转移至冷冻载杆上，每个载杆装载1-3枚空心琼脂糖球；

④用镊子夹持装有空心琼脂糖球的冷冻载杆，置于液氮泡沫盒上方10cm处开始熏蒸，经5min逐渐下降至液氮蒸汽内，再静置1min后，将冷冻载杆投入液氮，可长期保存。

所述的精子为人类精子或非人类哺乳动物的精子。

本发明的有益效果：本发明利用空心琼脂糖球模拟空透明带作为载体进行精子冷冻，能有效简便的保存单个或微量精子，而且冷冻精子解冻后具有较高的精子回收率与存活率。其中，海藻酸和碳酸钙反应后生成的藻酸钙形态稳定，具有良好三维结构的均匀凝胶，可以大大提高空心琼脂糖球的形成率，而且藻酸钙作为止血敷料对人体并无毒性，所以用藻酸钙作为支撑的内核是安全有效的。

附图说明

图1是本发明将精子注射入空心琼脂糖球中的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球，该空心琼脂糖球的制备是：

步骤1)取10ml的海藻酸和碳酸钙的水溶液与20ml的含有卵磷脂及醋酸的石蜡油混合，得混合液；其中，水溶液中海藻酸为3％，碳酸钙为0.6％；石蜡油中卵磷脂为3％，醋酸为0.5％；上述百分比均为质量百分比；

步骤2)将步骤1)的混合液过150目筛网，得到直径在60–100μm的海藻胶小球；

步骤3)将步骤2)的海藻胶小球加入10ml质量百分比浓度为1％的琼脂糖溶液中，加热沸腾；

步骤4)将步骤3)含海藻胶小球的琼脂糖溶液注入到磁力搅拌的10ml石蜡油中，形成琼脂糖小球，待琼脂糖小球冷却后过150目筛网得到直径在80–120μm的琼脂糖小球；

步骤5)将直径在80–120μm的琼脂糖小球用清水洗净后加入50ml的柠檬酸溶液，柠檬酸溶液将琼脂糖小球中的海藻胶溶解后得到空心琼脂糖球。

实施例2

在实施例1的基础上，所述步骤4)含海藻胶小球的琼脂糖溶液是通过1ml针管进行注入。

实施例3

一种用于单精子冷冻保存的方法，利用实施例1或实施例2所述的用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球，通过持针将该空心琼脂糖球固定，将筛选的精子注射入到空心琼脂糖球中；将内有精子的空心琼脂糖球，转移至冷冻载杆上；然后将装有空心琼脂糖球的冻载杆，置于液氮泡沫盒上方10cm处开始熏蒸，经5min逐渐下降至液氮蒸汽内，再静置1min后，将冷冻载杆投入液氮，可长期保存。

实施例4

利用实施例1或实施例2所述的用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球的用于单精子冷冻保存的方法，具体包括如下步骤：

步骤S1：精子冷冻皿的制备

精子冷冻皿的制备：皿内包含一个PVP滴和数个精子注射滴，以及一个平铺的精子筛选滴，在无CO₂的37℃培养箱内过夜平衡，备用；其中，数个精子注射滴是用含10％SSS的m-HTF做成的液滴；

步骤S2：精子冷冻液的准备

不含蛋黄的精子冷冻液以1：1的比例用含10％SSS的m-HTF稀释而成；

步骤S3：精子解冻液的准备

添加1ml含10％SSS的mHTF液体于双井皿中，在无CO₂的37℃培养箱内过夜平衡，备用；

步骤S4：精子注射和冷冻

①在400X的放大倍数下，筛选活力好且无形态学畸形的精子；

②通过持针将空心琼脂糖球固定，将筛选的精子注射入到空心琼脂糖球中如图1所示，根据具体情况，注射入1-5条精子；

③将内有精子的空心琼脂糖球，转移至冷冻载杆上，每个载杆装载1-3枚空心琼脂糖球；

④用镊子夹持装有空心琼脂糖球的冷冻载杆，置于液氮泡沫盒上方10cm处开始熏蒸，经5min逐渐下降至液氮蒸汽内，再静置1min后，将冷冻载杆投入液氮，可长期保存。

将采用本发明的空心琼脂糖球进行冷冻保存的实施例3或实施例4进行精子解冻：取出冷冻载杆，在空气中停留1-2秒，迅速浸入事先准备好的精子解冻液中，在体式镜下迅速找到琼脂糖小球，再转移到ICSI注射皿中，备用。

实验结果显示：冷冻再复苏后，精子回收率达100％，存活率为91.4％。充分说明本发明冷冻精子解冻后具有较高的精子回收率与存活率。

上述实施例中所述的精子可以是人类精子，也可以是非人类哺乳动物的精子。

Claims (5)

1.一种用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球，其特征是：该空心琼脂糖球的制备是：

步骤1)取10ml的海藻酸和碳酸钙的水溶液与20ml的含有卵磷脂及醋酸的石蜡油混合，得混合液；其中，水溶液中海藻酸为3％，碳酸钙为0.6％；石蜡油中卵磷脂为3％，醋酸为0.5％；上述百分比均为质量百分比；

步骤2)将步骤1)的混合液过150目筛网，得到直径在60–100μm的海藻胶小球；

步骤3)将步骤2)的海藻胶小球加入10ml质量百分比浓度为1％的琼脂糖溶液中，加热沸腾；

步骤4)将步骤3)含海藻胶小球的琼脂糖溶液注入到磁力搅拌的10ml石蜡油中，形成琼脂糖小球，待琼脂糖小球冷却后过150目筛网得到直径在80–120μm的琼脂糖小球；

步骤5)将直径在80–120μm的琼脂糖小球用清水洗净后加入50ml的柠檬酸溶液，柠檬酸溶液将琼脂糖小球中的海藻胶溶解后得到空心琼脂糖球。

2.根据权利要求1所述的一种用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球，其特征是：所述步骤4)含海藻胶小球的琼脂糖溶液是通过1ml针管进行注入。

3.一种用于单精子冷冻保存的方法，其特征是：利用如权利要求1或2所述的用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球，通过持针将该空心琼脂糖球固定，将筛选的精子注射入空心琼脂糖球中；将内有精子的空心琼脂糖球，转移至冷冻载杆上；然后将装有空心琼脂糖球的冷冻载杆，置于液氮泡沫盒上方10cm处开始熏蒸，经5min逐渐下降至液氮蒸汽内，再静置1min后，将冷冻载杆投入液氮，可长期保存。

4.根据权利要求3所述的一种用于单精子冷冻保存的方法，其特征是：具体包括如下步骤：

步骤S1：精子冷冻皿的制备

精子冷冻皿的制备：皿内包含一个PVP滴和数个精子注射滴，以及一个平铺的精子筛选滴，在无CO₂的37℃培养箱内过夜平衡，备用；其中，数个精子注射滴是用含10％SSS的m-HTF做成的液滴；

步骤S2：精子冷冻液的准备

不含蛋黄的精子冷冻液以1：1的比例用含10％SSS的m-HTF稀释而成；

步骤S3：精子解冻液的准备

添加1ml含10％SSS的mHTF液体于双井皿中，在无CO₂的37℃培养箱内过夜平衡，备用；

步骤S4：精子注射和冷冻

①在400X的放大倍数下，筛选活力好且无形态学畸形的精子；

②通过持针将空心琼脂糖球固定，将筛选的精子注射入到空心琼脂糖球中，根据具体情况，注射入1-5条精子；

③将内有精子的空心琼脂糖球，转移至冷冻载杆上，每个载杆装载1-3枚空心琼脂糖球；

④用镊子夹持装有空心琼脂糖球的冷冻载杆，置于液氮泡沫盒上方10cm处开始熏蒸，经5min逐渐下降至液氮蒸汽内，再静置1min后，将冷冻载杆投入液氮，可长期保存。

5.根据权利要求3或4所述的一种用于单精子冷冻保存的方法，其特征是：所述的精子为人类精子或非人类哺乳动物的精子。