CN110366552A - 新化合物、包含该新化合物的用于荧光衍生化的试剂、以及使用该新化合物对氨基酸的光学异构体进行光学拆分的方法和经荧光衍生化的氨基酸 - Google Patents

新化合物、包含该新化合物的用于荧光衍生化的试剂、以及使用该新化合物对氨基酸的光学异构体进行光学拆分的方法和经荧光衍生化的氨基酸 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是开发在手性氨基酸的分析中不发生消光的光学拆分试剂。通过提供不发生消光的光学拆分用的新化合物来解决课题。本发明涉及新化合物、包含该新化合物的光学拆分用试剂、包含使该新化合物反应的工序的进行光学拆分的方法、以及使该新化合物与氨基酸反应而获得的光学异构体。

Description

新化合物、包含该新化合物的用于荧光衍生化的试剂、以及使 用该新化合物对氨基酸的光学异构体进行光学拆分的方法和 经荧光衍生化的氨基酸
技术领域
本发明涉及新化合物、包含该新化合物的用于荧光衍生化的试剂、和将使该新化合物与氨基酸反应而获得的荧光衍生化氨基酸进行光学拆分的方法、和使该新化合物与氨基酸反应而获得的氨基酸的荧光衍生物。
背景技术
以往，认为在高等动物的生物体中存在的氨基酸仅为L-氨基酸。然而，近年来，根据分析技术的发展，明确了在高等动物、特别是包含人的哺乳类的生物体内也存在D-氨基酸，具有记忆、学习、激素产生、分泌等生理功能。此外，在各种组织、生物体试样中存在的D-氨基酸之中的若干显示随着身体的状态例如肾衰竭等疾病而变动，期待作为健康、疾病标志物的利用(专利文献1)。
从阐明生物体内的氨基酸的生理作用的观点考虑，进行了利用高效液相色谱(HPLC)法，进行了将氨基酸(例如，参照非专利文献1-3)、D-氨基酸和L-氨基酸精密地分离并定量的分析手法(例如，参照非专利文献4)的开发研究。此外，开发了通过作为以往的HPLC标签化用的试剂的4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并二唑(NBD-F)而实现荧光衍生化，组合2维手性HPLC，从而对构成蛋白质的全部氨基酸进行选择性分析的方法(非专利文献5)。进一步，也开发了可以更高灵敏度且简便地将氨基酸的光学异构体混合物进行光学拆分的光学拆分用的试剂(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2013/140785号公报
专利文献2：日本特开2015-48332号公报
非专利文献
非专利文献1：K.Shimbo et al.,Anal.Chem.，2009，81，5172-5179
非专利文献2：K.Shimbo et al.,Rapid Commun.Mass Spectrom.，2009，23，1483-1492
非专利文献3：S.A.Cohen et al.,Anal.Biochem.，1993，211,279-287
非专利文献4：R.J.Reischl et al.,J.Chromatogra.A.，2012,1269，262-269
非专利文献5：T.Kimura,et al.,Scientific Reports,(2016),6,26137
发明内容
发明所要解决的课题
在使用了作为以往的HPLC标签化用的试剂的4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并二唑(NBD-F)的D-氨基酸的分析技术中，发现在色氨酸与NBD-F试剂反应而产生的NBD-色氨酸中，发生消光，检测灵敏度变低这样的课题。一般的氨基酸分析系统的测定范围为3～4数量级，但NBD-色氨酸由于消光而测定值不落入该范围，与有40种以上的其它手性氨基酸的同时分析变得困难，因此有时不能适用于将代谢物进行全面分析的代谢组学的手法。
用于解决课题的方法
针对上述课题，对在将氨基酸进行衍生化时，不发生消光的化合物进行了探索，结果发现在通过以下式所示的化合物将色氨酸衍生化的情况下，所得的色氨酸衍生物不发生消光，并且能够通过手性柱色谱将色氨酸衍生物的D-氨基酸与L-氨基酸分离，从而完成了本发明。
因此本发明涉及以下：
[1]以下式所示的化合物、或其盐。
[2]一种用于荧光衍生化的试剂，其包含以下式所示的化合物、或其盐。
[3]一种对试样中的含有氨基的化合物进行分析的分析方法，其包含下述工序：
使包含该含有氨基的化合物的试样与以下式所示的化合物反应的工序；
将反应的产物导入到色谱的工序。
[4]根据项目3所述的方法，上述分析方法为将光学异构体进行光学拆分的方法，色谱为手性色谱。
[5]根据项目3或4所述的方法，上述含有氨基的化合物为氨基酸。
[6]一种氨基酸的荧光衍生物的制造方法，其包含使氨基酸与以下式所示的化合物反应的步骤。
[7]以下式所示的化合物。
[式中，R为氨基酸的侧链]
发明的效果
根据本发明，能够抑制由消光引起的检测灵敏度的降低，能够提供光学拆分所使用的用于荧光衍生化的化合物。
附图说明
图1涉及将含有构成蛋白质的氨基酸的试样通过NBD-F进行荧光衍生化，供于HPLC分析而获得的色谱图。
图2表示将含有D-丙氨酸和L-丙氨酸、和D-色氨酸和L-色氨酸的试样通过NBD-F(A)或NBD-COOSu(B)和(C)进行衍生化，供于手性HPLC分析而获得的色谱图。(A)和(B)中，通过荧光分析测定手性HPLC的分离物，另一方面，(C)中通过质谱分析测定手性HPLC的分离物。
具体实施方式
(新化合物)
本发明者们新制造出下述式所示的化合物(2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-[N-(4-硝基苯并[c][1,2,5]二唑-7-基)-N-甲基氨基]乙酸酯(NBD-COOSu))。因此，本发明的一方案涉及以下式所示的化合物或其盐。
作为盐，可以举出与任意的酸形成的盐。可举出例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐和高氯酸盐等无机酸盐、或乙酸盐、草酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐或丙二酸盐等有机酸盐。
(新化合物的合成)
该化合物可以通过任意的方法制造，例如可以基于下述方案1和方案2制造。
方案1
方案2
(用于荧光衍生化的试剂及其反应)
本发明的化合物基于硝基苯并二唑(NBD)而发出荧光，并且基于琥珀酰亚胺基的反应性而与具有氨基的化合物反应而生成荧光衍生物。只要是具有氨基的化合物，就可以与任意的化合物反应，可举出例如氨基酸。具体而言，例如基于下述方案，生成氨基酸的荧光衍生物。因此，本发明的其它方案中，涉及包含2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-[N-(4-硝基苯并[c][1,2,5]二唑-7-基)-N-甲基氨基]乙酸酯(NBD-COOSu)的用于荧光衍生化的试剂。如后所述，将经荧光衍生化试剂进行了荧光衍生化的氨基酸导入到手性柱色谱，从而可以将D-氨基酸与L-氨基酸分离，因此本发明的荧光衍生化试剂也可以称为光学拆分用试剂。
方案3
(式中，R表示氨基酸的任意的侧链)
在进一步的其它方案中，本发明也涉及制造氨基酸的荧光衍生物的方法，其包含使本发明的化合物与氨基酸反应的步骤。此外也涉及通过该制造方法制造的氨基酸的荧光衍生物，即具有以下式的氨基酸荧光衍生物。
(式中，R表示任意的氨基酸的侧链)
在本发明中，R表示任意的氨基酸的侧链，可以为构成蛋白质的氨基酸的侧链。进一步从进行光学拆分的观点考虑，优选为构成蛋白质的氨基酸之中除甘氨酸侧链(-H)以外的任意的侧链。代表性地有丙氨酸侧链(-CH3)或下述色氨酸侧链。
这些氨基酸荧光衍生物在能够发出由NBD部分引起的荧光、并且不发生可能由一部分氨基酸侧链的结构而产生的荧光消光方面具有特征。此外，这些氨基酸荧光衍生物保持原来的氨基酸所具有的手性。因此，通过将氨基酸荧光衍生物导入到手性柱色谱，从而能够基于原来的氨基酸的手性进行D-氨基酸与L-氨基酸的分离方面也成为特征。
在使用作为现有技术的NBD-F进行了衍生化的情况下，色氨酸衍生物发生了消光(图1和图2A)。因此，不发生消光的色氨酸衍生物在D-氨基酸的全面分析上特别有用。在本发明的实施例中，明确了在上述氨基酸衍生物之中的色氨酸衍生物中，不发生消光(图2B)。这里，消光的含义虽然不受理论限定，但是是指由化合物中的与具有荧光性的结构相邻的结构引起的荧光消失。
通过对使本发明的化合物与具有光学异构体的化合物例如氨基酸(D-氨基酸+L-氨基酸)反应而获得的氨基酸的荧光衍生物，进行光学拆分色谱，能够基于原来的光学异构进行分离和分析。因此，本发明的进一步其它方案中，涉及包含本发明的化合物的、光学拆分用试剂。也可以涉及包含用于光学拆分和/或荧光衍生化的试剂、和光学拆分用柱的用于光学拆分和/或荧光衍生化的试剂盒或系统。
在本发明的其它方案中，本发明涉及对试样中的含有氨基的化合物进行分析的方法。具体而言，包含下述工序：
使包含含有氨基的化合物的试样与以下式所示的化合物反应的工序；
将反应的产物导入到色谱的工序。
本发明的分析方法特别优选为将光学异构体分离的光学拆分方法，作为该情况下的色谱，进行手性色谱。只要是具有氨基的化合物，就可以使用任意的化合物。可举出例如氨基酸，可以将氨基酸、特别是构成蛋白的氨基酸的光学异构体即D-氨基酸与L-氨基酸分离而进行分析。
使包含含有氨基的化合物的试样与本发明的化合物反应的工序可以通过将包含含有氨基的化合物的试样、与包含本发明的化合物的溶液混合，根据情况进行加热来进行反应。从避免荧光褪色的目的考虑，该反应优选在暗处进行。可以任意使用适当的溶剂，可以使用例如水、甲醇、乙醇、乙腈等。
包含含有氨基的化合物的试样可以为生物体试样、环境试样、实验试样、工业试样(食品试样、药品试样、化妆品试样)等任意的试样。作为生物体试样，可举出血液、唾液、泪液、淋巴液等体液、细胞、脏器等组织试样、和尿、粪便等排泄物试样。可以将这些试样直接与本发明的化合物反应，但优选在反应工序之前，根据试样而适当纯化。此外，也可以在反应工序后进行纯化。关于试样的纯化，过滤、除蛋白、溶剂提取、离子交换、固相提取等可以根据试样的种类而适当选择，或组合进行。
在上述反应工序中，与本发明的化合物反应而被衍生化的含有氨基的化合物供于具备光学拆分柱的色谱。作为色谱，优选为HPLC。在供于具备光学拆分柱的色谱之前，可以使用其它柱系预先进行色谱。光学拆分柱可以任意选择能够将被本发明的化合物进行了衍生化的D-氨基酸与L-氨基酸分离的柱。光学拆分柱使用仅包含一个光学异构体的化合物作为固定相，例如作为一例，可以使用甘氨酸衍生物、亮氨酸衍生物、奎宁衍生物等。对于通过色谱而分离成D-氨基酸与L-氨基酸的氨基酸衍生物，可以通过检测其荧光来进行分析。荧光的检测可以在色谱系统所包含的检测器中进行。检测器通过照射激发NBD的激发光(470nm)，检测来源于激发的NBD的荧光(荧光波长：530nm)，从而可以对经衍生化的氨基酸进行分析。
所谓构成蛋白质的氨基酸，是指构成蛋白质的20种氨基酸。作为构成蛋白质的氨基酸，可举出丙氨酸(Ala/A)、精氨酸(Arg/R)、天冬酰胺(Asn/N)、天冬氨酸(Asp/D)、半胱氨酸(Cys/C)、谷氨酸(Glu/E)、谷氨酰胺(Gln/Q)、甘氨酸(Gly/G)、组氨酸(His/H)、异亮氨酸(Ile/I)、亮氨酸(Leu/L)、赖氨酸(Lys/K)、蛋氨酸(Met/M)、苯丙氨酸(Phe/F)、脯氨酸(Pro/P)、丝氨酸(Ser/S)、苏氨酸(Thr/T)、色氨酸(Trp/W)、酪氨酸(Tyr/Y)、和缬氨酸(Val/V)。这些氨基酸之中除甘氨酸以外的氨基酸存在D-氨基酸和L-氨基酸的光学异构体。此外，苏氨酸与异亮氨酸中存在别位异构体。在将本发明的试样中的氨基酸进行光学拆分而分析的方法中，被分析的氨基酸优选为除甘氨酸以外的构成蛋白质的氨基酸，但对于其它氨基酸，例如鸟氨酸、瓜氨酸等，也可以进行分析。
实施例
实施例1：2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-[N-(4-硝基苯并[c][1,2,5]二唑-7-基)-N-甲基氨基]乙酸酯(NBD-COOSu)的合成
(1)NBD-COOH的合成
方案1
在暗处，将N-甲基甘氨酸(1.85g，20.8mmol)溶解于0.52M碳酸氢钠水溶液(100mL)，在其中滴加NBD-Cl(1.04g，5.23mmol)的乙腈溶液(50mL)。将溶液在室温下搅拌2小时后，在减压下将乙腈蒸馏除去。在溶液中加入6M盐酸水溶液(14mL)形成酸性后，在室温下搅拌30分钟。将析出的固体抽滤，在减压下干燥，获得了橙色固体(1.35g,定量)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.54(d,J＝9.0Hz,1H),6.47(d,J＝9.2Hz,1H),4.91(s,2H),3.47(s,3H)。
(2)2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-[N-(4-硝基苯并[c][1,2,5]二唑-7-基)-N-甲基氨基]乙酸酯(NBD-COOSu)的合成
方案2
在暗处，将实施例1中调制的NBD-COOH(236mg，0.935mmol)溶解于二氯甲烷(2mL)，滴加草酰氯(1.1mL)加入到溶液中。将N,N-二甲基甲酰胺(5μL)加入到溶液中，在室温下搅拌1小时。然后，在减压下将溶剂蒸馏除去，真空干燥。将所得的残渣溶解于二氯甲烷(1mL)，滴加到将N-羟基琥珀酸酰亚胺(115.2mg，1.00mmol)和N-甲基吗啉(0.1mL)溶解于二氯甲烷(1mL)的溶液中。在1天的搅拌后，加入二氯甲烷(50mL)，用水(20mL)洗涤2次，用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)洗涤2次，用水(20mL)洗涤1次，用硫酸钠使其干燥。将硫酸钠过滤后，在减压下将溶剂蒸馏除去，获得了橙色的粉末(206mg，收率63.2％)
1HNMR(500MHz,CD2Cl2)δ8.50(d,J＝8.7Hz,1H),6.32(d,J＝8.8Hz,1H),5.26(s,2H),3.52(s,3H),2.84(s,4H)。
实施例2：采用NBD-COOSu的氨基酸的荧光衍生化
方案3
[R为-CH3、或下式所示的基团]
在分别包含20pM的D-色氨酸和80pM的L-色氨酸的色氨酸水溶液(10μL)、和分别包含0.5pM的D-丙氨酸和2pM的L-丙氨酸的丙氨酸水溶液(10μL)中加入400mM硼酸盐缓冲液(pH8.0)20μL，进一步加入40mM的NBD-COOSu的乙腈溶液(5μL)在60℃下反应2分钟。接下来加入0.2％三氟乙酸水溶液(75μL)使反应停止，取得氨基酸衍生物(NBD-CO-Trp、和NBD-CO-Ala)。
实施例3：采用HPLC的分离
将在实施例2中获得的氨基酸衍生物供于HPLC分析。HPLC分析所使用的柱为以KSAACSP-001R(1.5mm i.d.×250mm)作为手性固定相的ORIGINAL的Prikle型柱(专利5977765号)，作为流动相，使用了乙腈：甲醇(30:70)。检测使用荧光(激发波长470nm，荧光波长530nm)和UV/VIS(测定波长470nm)检测器进行。将丙氨酸衍生物水溶液供于HPLC分析。在分析后，洗柱(甲醇10分钟，甲酸铵10分钟，进一步甲醇20分钟)，用溶出液进行40分钟的稳定化，接着将色氨酸衍生物水溶液供于HPLC分析。将通过荧光检测获得的色谱图示于图2B中。此外，代替荧光检测，通过质谱分析进行检测。将通过质谱分析检测到的色谱图示于图2C中。
比较例1：使用了NBD-F的情况下的HPLC分析
在包含构成蛋白质的氨基酸和别位异构体的氨基酸的标准试样中加入400mM硼酸盐缓冲液(pH8.0)10μL，进一步加入40mM的NBD-F溶液(5μL)在60℃下使其反应2分钟。接下来加入0.2％三氟乙酸水溶液(75μL)使反应停止，取得氨基酸衍生物。将取得的氨基酸衍生物供于具备设定于45℃的反相柱(整体ODS柱，0.53mm i.d.×1000mm；资生堂)的HPLC。使用包含5～35％MeCN、0～20％THF、和0.05％TFA的水性流动相，使流动相的流速为25μL/分钟进行了梯度溶出。将通过荧光检测获得的色谱图示于图1中。显示出在色氨酸的荧光强度显著低，定量困难。
比较例2：使用了NBD-F的情况下的手性HPLC分析
在分别包含20pM的D-色氨酸和80pM的L-色氨酸的色氨酸水溶液(10μL)、和分别包含0.5pM的D-丙氨酸和2pM的L-丙氨酸的丙氨酸水溶液(10μL)中加入400mM硼酸盐缓冲液(pH8.0)10μL，进一步加入40mM的NBD-F溶液(5μL)在60℃下使其反应2分钟。接下来加入0.2％三氟乙酸水溶液(75μL)使反应停止，取得氨基酸衍生物(NBD-Trp、和NBD-Ala)。
将取得的氨基酸衍生物与实施例3同样地供于HPLC分析。将通过荧光检测获得的色谱图示于图2A中。
在比较例2中，显示出使用作为现有技术的NBD-F，将丙氨酸和色氨酸衍生化，将衍生物分别供于手性HPLC的结果。对于丙氨酸，D-丙氨酸和L-丙氨酸的峰分离地观察到，但对于色氨酸，D-色氨酸和L-色氨酸的两者的峰极其低，不能定量(图2A)。虽然不受理论限定，但可以认为在NBD环、与色氨酸的吲哚环之间，发生光致电子转移，结果发生了消光。另一方面，在实施例3中，显示出使用NBD-COOSu将丙氨酸和色氨酸衍生化，将衍生物分别供于手性HPLC的结果。对于丙氨酸和色氨酸两者，各自D体和L体的峰分离地观察到(图2B)。而且该峰与通过质谱分析检测到的结果一致。由这些结果显示出，使用了NBD-COOSu的氨基酸的衍生化对于将包含D体和L体的氨基酸分离而进行检测是有效的。

Claims (7)

1.以下式所示的化合物、或其盐，
2.一种用于荧光衍生化的试剂，其包含以下式所示的化合物、或其盐，
3.一种对试样中的含有氨基的化合物进行分析的分析方法，其包含下述工序：
使包含含有氨基的化合物的试样与以下式所示的化合物反应的工序；
将反应的产物导入到色谱的工序。
4.根据权利要求3所述的方法，所述分析方法为光学异构体的光学拆分方法，色谱为手性色谱。
5.根据权利要求3或4所述的方法，所述含有氨基的化合物为氨基酸。
6.一种氨基酸衍生物的制造方法，其包含使氨基酸与以下式所示的化合物反应的步骤，
7.以下式所示的化合物，
式中，R为氨基酸的侧链。
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