CN110354114B - 一种组合物及其在制备抗神经炎药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗炎药物技术领域，公开了一种组合物及其在制备抗神经炎药物中的应用。所述组合物由水飞蓟宾和2‑苯基乙基异硫代氰酸酯按照摩尔比为1.25～5:1组成。本发明所述组合物由水飞蓟宾和2‑苯基乙基异硫代氰酸酯按照一定的摩尔量组成；所述两种活性成分均为天然活性成分，没有毒副作用；同时二者联合使用，具有协同增效作用，可以达到多靶点多抑制的效果，同时抗神经炎症的效果更好，用药量降低，有利于降低或延缓抗药性的产生。

Description

一种组合物及其在制备抗神经炎药物中的应用
技术领域
本发明涉及抗炎药物技术领域，更具体地，涉及一种组合物及其在制备抗神经炎药物中的应用。
背景技术
中枢神经系统炎症的发生是中枢神经系统为抵御感染和损伤，与外周免疫系统相互作用的结果。在大多数情况下，神经炎症有利于机体正常的免疫防御，对于清除病原体、自身异常代谢产物及修复神经元损伤有重要作用。中枢神经系统炎症的发生和发展与脑内星形胶质细胞和小胶质细胞BV2的激活密切相关。小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，当中枢神经系统遭受炎症、外伤等病理性刺激时，小胶质细胞被广泛活化，激活的小胶质细胞释放多种促炎因子，如TNF-α、IL-6等导致神经元的损伤甚至死亡，也可以通过释放一氧化氮(NO)和活性氧的生成促进神经元的死亡。
神经炎症已被证明参与各种神经退行性疾病，神经退行性疾病是一类由大脑和脊髓的神经元发生不可逆损害或丢失，导致脑神经功能障碍的疾病状态，包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化症和多发性硬化症等。研究表明，在中枢神经系统疾病中，炎症介质如细胞因子、NO、趋化因子等表达均上调。急性炎症反应能局限化细胞损伤并修复受损的神经元，从而发挥神经保护作用。然而，一旦急性炎症转变为难控的慢性炎症，神经炎症的加剧与神经元病变程度相互影响，最终导致神经元功能障碍或死亡，进而产生神经退行性病变。因此在中枢神经系统病变过程中，炎症反应的神经保护作用和损伤效果如何将决定疾病的走向。炎症反应是神经退行性疾病发展的重要因素之一，小胶质细胞激活也是此类疾病的共同特征。
NO是在炎症介导的神经元退行性病变中起重要作用的介质。在正常生理情况下，大脑中合成少量的NO，一方面可以促进脑血管内血液循环流通，有益于大脑记忆功能的形成；另一方面也是免疫细胞应对外界损伤和刺激的调节分子，可影响致炎细胞因子的生成和释放。当炎症发生时，小胶质细胞中的诱导型一氧化氮合酶参与的合成，生成的高水平NO损坏甚至产生细胞毒害作用。因此，NO在中枢神经系统免疫调节中的作用不可忽视。
传统的抗炎药物虽然对炎症的抑制具有显著的效果，但是都存在一些不良反应，而且存在一定的抗药性。因此，目前较多的研究倾向于多种药物的联合应用，从而可以达到减少药物的用量，从而降低不良反应，同时还能缓解抗药性的产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种组合物。本发明所述组合物是由一定量的水飞蓟宾、2-苯基乙基异硫代氰酸酯组成，其二者联合使用时，相互之间具有协同增效作用，抗神经炎症效果好，二者联合使用时，可降低药物的使用量，减少不良反应或抗药性的产生。
本发明的另一目的在于提供所述组合物在制备抗神经炎药物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种组合物，所述组合物由水飞蓟宾和2-苯基乙基异硫代氰酸酯按照摩尔比为1.25～5:1组成。
优选地，所述组合物由水飞蓟宾和2-苯基乙基异硫代氰酸酯按照摩尔比为1.25～2.5:1组成。
优选地，所述组合物由水飞蓟宾和2-苯基乙基异硫代氰酸酯按照摩尔比为1.25:1组成。
本发明同时还保护所述组合物在制备抗神经炎药物中的应用。
优选地，所述抗神经炎药物为抑制小胶质细胞炎症的药物。
优选地，所述小胶质细胞炎症由脂多糖诱导产生。
优选地，所述抗神经炎药物为降低小胶质细胞产生一氧化氮的量。
优选地，所述组合物中，水飞蓟宾的使用浓度低于50μM；所述2-苯基乙基异硫代氰酸酯的使用浓度低于20μM。
一种由上述组合物以及药学上可接受的辅料制备而成的抗神经炎药物也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述抗神经炎药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或注射液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述组合物由水飞蓟宾和2-苯基乙基异硫代氰酸酯按照摩尔比为1.25～5:1组成；所述两种活性成分均为天然活性成分，没有毒副作用；同时二者联合使用，具有协同增效作用，可以达到多靶点多抑制的效果，同时抗神经炎症的效果更好，用药量降低，有利于降低或延缓抗药性的产生。
附图说明
图1为不同浓度的水飞蓟宾、2-苯基乙基异硫代氰酸酯以及两者联用对BV2小胶质细胞的生长影响结果。
图2为不同浓度的水飞蓟宾、2-苯基乙基异硫代氰酸酯以及两者联用对LPS诱导的BV2产生NO的结果。
图3为剂量效应曲线。
图4为CI-Fa曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
用MTT实验测定不同浓度的水飞蓟宾、2-苯基乙基异硫代氰酸酯以及两者联用对BV2小胶质细胞的生长影响，具体实施方案如下：
用胰蛋白酶将BV2细胞从培养瓶中消化下来，离心5分钟，使用10％FBS的DMEM培养基中制成细胞悬浮液，以接种浓度3×104个/mL的浓度接种于96孔板(100μL/孔)，置于5％CO2，37℃培养箱中培养24小时。设置水飞蓟宾(Silibinin)浓度为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM和2-苯基乙基异硫代氰酸酯(2-phenethyl isothiocyanate，PEITC)的浓度为80μM、40μM、20μM、10μM、5μM，每个浓度设置4个复孔。5％CO2，37℃培养24h，吸掉上清液后加入100μL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液(用5mg/mL MTT溶液于基础DMEM中稀释10倍得到)；放入培养箱中继续培养4h后，小心吸去孔内上清液。每孔加入150μL DMSO，在培养箱静置十分钟；用酶标仪测量570nm处各孔的吸光值。
测试结果如图1所示(Silibinin为水飞蓟宾，2-PEITC为2-苯基乙基异硫代氰酸酯)，从图中可知，2-苯基乙基异硫代氰酸酯(2-phenethyl isothiocyanate，2-PEITC)在0-40μM浓度范围内，随着药物浓度增加，BV2细胞存活率降低，该药物具有一定毒性，故取最大安全浓度20μM作为抗炎实验最大浓度。
水飞蓟宾(Silibinin)在0-100μM浓度范围内，随着药物浓度增加，BV2细胞存活率降低，该药物具有一定毒性，故取最大安全浓度50μM作为抗炎实验最大浓度。
实施例2
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞外壁的一种成份，具有很强的致炎作用，但对神经元没有直接毒性作用。其目前已经广泛用于各种炎症反应和氧化应激模型的建立，包括小胶质细胞体外炎症模型，因此以下试验采用LPS造模进行试验。
基于LPS(脂多糖)诱导，2-苯基乙基异硫代氰酸酯(2-phenethylisothiocyanate，2-PEITC)20μM、10μM和水飞蓟宾(Silibinin)50μM、25μM进行单独以及两两联合用药对BV2产生NO含量的影响。通过Griess实验，具体实施方案如下：
用胰蛋白酶将BV2细胞从培养瓶中消化下来，离心5分钟，使用10％FBS的DMEM培养基中制成细胞悬浮液，以接种浓度1×106个/mL的浓度接种于96孔板(100μL/孔)，置于5％CO2，37℃培养箱中培养。24小时后，吸去培养基，空白组加入100μL DMEM基础培养基，LPS(脂多糖)组加入100μL含100ng/mL LPS的基础DMEM，实验组水飞蓟宾(50μM、25μM)，2-苯基乙基异硫代氰酸酯(20μM、10μM)、水飞蓟宾50μM+2-苯基乙基异硫代氰酸酯20μM，水飞蓟宾50μM+2-苯基乙基异硫代氰酸酯10μM，水飞蓟宾25μM+2-苯基乙基异硫代氰酸酯20μM，水飞蓟宾25μM+2-苯基乙基异硫代氰酸酯10μM，使用含100ng/mL LPS的基础DMEM稀释药物浓度，每孔加入100μL，每个浓度设置3个复孔。然后置于37℃、5％CO2培养箱内培养。24h后，每孔取50μL上清液加入另一个96孔培养板中，再往每孔加入50μL Griess ReagentⅠ试剂和50μLGriess ReagentⅡ试剂，轻轻摇动培养板混匀，用酶标光度计检测540nm波长处的吸光光度值，NO的浓度依据NaNO2标准曲线进行计算。
测得结果如图2所示(Silibinin为水飞蓟宾，2-PEITC为2-苯基乙基异硫代氰酸酯)，从图中可以看出，水飞蓟宾或2-苯基乙基异硫代氰酸酯单独用药对LPS诱导的BV2产生NO均具有一定抑制效果，两者均呈现出剂量依赖性，水飞蓟宾在浓度为50μM抑制效果较好；当两者进行组合用药时，对LPS诱导的BV2产生NO的抑制效果明显优于单独用药。
采用Compusyn 2.0软件分析2-PEITC与Silibinin的联合效应，将NO实验测定结果导入Compusyn 2.0，生成Fa-Does曲线图(图3)和CI-Fa曲线图(图4)，其中P代表药物2-PEITC，S代表药物Silibinin，Com代表联合用药组。采用联合作用指数(CombinationIndex，CI)判断两种药物的协同性。Chou-Talalay药物联合方法基于中效方程，为定量测定药物相互作用的联合指数(CI)等线图方程提供了理论基础，其中CI<1表示协同作用，CI＝1表示加性作用，CI>1表示拮抗作用。
从剂量效应曲线以及CI-Fa曲线可以看出，四组联合实验组均具有表示出协同作用。其中，特别是水飞蓟宾50μM+2-苯基乙基异硫代氰酸酯20μM实验组以及水飞蓟宾25μM+2-苯基乙基异硫代氰酸酯20μM实验组，这两组联合用药具有显著的抗炎活性，联合指数分别为0.55和0.41(表1)，表明二者的联用具有协同增效作用。
表1联合实验组CI值
Figure BDA0002132344080000051
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种由水飞蓟宾和2-苯基乙基异硫代氰酸酯组成的组合物在制备抗神经炎药物中的应用，其特征在于，所述组合物中水飞蓟宾和2-苯基乙基异硫代氰酸酯的摩尔比为1.25～5:1。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述组合物中水飞蓟宾和2-苯基乙基异硫代氰酸酯的摩尔比为1.25～2.5:1。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述组合物中水飞蓟宾和2-苯基乙基异硫代氰酸酯的摩尔比为1.25:1。
4.根据权利要求1至3任一所述应用，其特征在于，所述抗神经炎药物为抑制小胶质细胞炎症的药物。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述小胶质细胞炎症由脂多糖诱导产生。
6.根据权利要求1至3任一所述应用，其特征在于，所述抗神经炎药物为降低小胶质细胞产生一氧化氮的量的药物。
7.根据权利要求1至3任一所述应用，其特征在于，所述组合物中，水飞蓟宾的使用浓度低于50µM；2-苯基乙基异硫代氰酸酯的使用浓度低于20µM。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Isothiocyanates Are Promising Compounds against Oxidative Stress, Neuroinflammation and Cell Death that May Benefit Neurodegeneration in Parkinson’s Disease;Giulia Sita等;《Int. J. Mol. Sci.》;20160901;第17卷;第1-18页 *
Silibinin 对小胶质细胞的调控作用;毛翘;《万方数据知识服务平台》;20171101;第1-35页 *

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