CN110353088A - 一种发酵豆粕的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵豆粕的制备方法，其中，以大豆粕和大豆皮为发酵底物，添加发酵菌种混合液，然后先进行有氧发酵、后进行无氧发酵，即得所述发酵豆粕，所述菌种包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌及罗伊氏乳杆菌。本发明制备的发酵豆粕中活菌数是外购发酵豆粕的1000倍，且有大量乳杆菌和酵母菌存活；用本发明制备的发酵豆粕饲养仔猪，仔猪的体重相比外购发酵豆粕显著增加。
Description
技术领域
本发明涉及豆粕发酵技术领域，尤其是一种发酵豆粕的制备方法。
背景技术
仔猪消化吸收器官发育不全，胃酸分泌量不足，体内酶活性较低，因此早期断奶容易出现食欲差、饲料利用率低、生长慢、抗病力下降等症状，此外断奶应激和饲粮的变化易使仔猪肠道结构受损从而加重上述症状。豆粕的蛋白质含量高，且氨基酸比例与理想蛋白质模型相近，是仔猪饲料蛋白质的重要来源，但断奶仔猪对豆粕中大分子蛋白的消化能力差，且对其中的抗营养因子敏感，这大大限制了豆粕在断奶仔猪上的应用，因此需要对豆粕进行加工处理。研究表明采用高压膨化、电子束辐照、不同加热处理、酶解、微生物发酵等方法，均可改善豆粕的营养成分，降低其抗营养物质含量。其中，微生物发酵法不仅可以有效改善豆粕的营养成分，还可以发酵产生多种有益代谢产物，且发酵完成后还会有大量益生菌存活，因此，微生物发酵法是改善豆粕营养价值的一种理想处理方法，也是近年来研究的热点。
发酵按照含水量可以分为固态发酵和液体发酵。固态发酵是微生物通过利用饲料中糖类等能量物质发酵改变饲料的理化性质或提高某种饲料原料的消化率，固态发酵是以固体原料作为发酵底物，在水分较少的条件下发酵产生，菌种经过培养扩大，原料经过灭菌等预处理，通过设定适宜的温度和湿度进行发酵。然而，目前市场上可购买的发酵豆粕用于饲养仔猪，仔猪的体重增加量仍然不够理想。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种发酵豆粕的制备方法，其制备的豆粕用于饲养仔猪，可显著地增加仔猪的体重。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种发酵豆粕的制备方法，包括以下步骤：以大豆粕和大豆皮为发酵底物，添加发酵菌种混合液，然后先进行有氧发酵、后进行无氧发酵，即得所述发酵豆粕，所述菌种包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌及罗伊氏乳杆菌。
作为上述方案的进一步优化，所述发酵底物中大豆粕的质量百分比为95％，大豆皮的质量百分比为5％。
作为上述方案的进一步优化，所述菌种为酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌及罗伊氏乳杆菌。
作为上述方案的进一步优化，所述酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌及罗伊氏乳杆菌的数量比为1:1:1:1；更优选地，所述发酵菌种混合液中酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌及罗伊氏乳杆菌的含量均为6.05×108 CFU/mL。本申请的发明人经多次试验发现，用益生菌发酵豆粕后，不仅可以改善豆粕的营养成分，还可以得到多种益生菌，若以湿态形式饲喂断奶仔猪，会使发酵豆粕和益生菌在仔猪体内协同发挥作用，从而显著增加仔猪体重。
作为上述方案的进一步优化，发酵体系由发酵底物和发酵菌种混合液组成，发酵菌种混合液中菌的总质量占发酵体系总质量的10％。
作为上述方案的进一步优化，所述发酵菌种混合液含有2％(W/W)的葡萄糖、0.2％(W/W)的KH2PO4、0.3％(W/W)的K2HPO4和蛋白酶混合物，所述蛋白酶混合物的浓度为50U/1g发酵底物。
作为上述方案的进一步优化，所述有氧发酵温度为37～40℃，优选37℃，发酵时间为48h，每2h向发酵罐中通入无菌空气10s，24h翻料一次。
作为上述方案的进一步优化，所述无氧发酵温度为37～40℃，优选37℃，发酵时间为48h。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明制备的发酵豆粕中活菌数是外购发酵豆粕的1000倍，且有大量乳杆菌和酵母菌存活；用本发明制备的发酵豆粕饲养仔猪，仔猪的体重相比外购发酵豆粕饲养的仔猪体重显著增加。
附图说明
图1是豆粕发酵前后颜色变化的对比图；
图2是发酵豆粕中菌落形态鉴定结果图；
图3是豆粕、发酵豆粕蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分布图，其中，蛋白条带1为外购发酵豆粕，2、3和4、5分别为两批次的自制发酵豆粕。
具体实施方式
本发明选用对仔猪生长性能有提高作用的植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌组合作为发酵菌种对豆粕进行两步法固态发酵，旨在探究益生菌固态发酵对豆粕营养价值的影响，并进一步研究自制发酵豆粕饲喂仔猪的效果。鉴于固态发酵生产工艺简单，废水废渣较少，利于规模化生产，具有产量高、能耗低、投资低的特点，因此，本发明所选用的豆粕发酵方法为固态发酵法。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法，如无特别说明，本发明中的试剂浓度均为质量浓度。
实施例1固态发酵对豆粕营养价值的影响
1.1发酵原料
豆粕(20目)、大豆皮，采购于南沙植之元油脂实业有限公司；酸性蛋白酶(500000U/g)、中性蛋白酶(100000U/g)、碱性蛋白酶(200000U/g)，购于广东新南都饲料科技有限公司。葡萄糖(食品级)、KH2PO4、K2HPO4，购于广州市梓兴化玻仪器有限公司。外购发酵豆粕，为低温烘干粉碎形态，其发酵菌种为酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌及嗜酸乳酸菌。
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae CNCM I-1079)，采购于安琪酵母股份有限公司；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum CGMCC1258，简称LP)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri LR1)，为广东省农业科学院动物科学研究所猪营养与饲料研究室保存；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，采购于广州市微生物研究所。各菌种经过平板涂布培养目检及镜检正常后方可使用。
1.2试验试剂
MRS培养基：MRS肉汤培养基购自广东环凯微生物科技有限公司，使用时取54g加1L蒸馏水混匀，灭菌后使用，配置固体培养基时向其中加1.8％的琼脂粉。
LB培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 10g/L，混匀后高压蒸汽灭菌。固体培养基加1.5％的琼脂粉。
YPD培养基：葡萄糖20g/L，酵母菌膏10g/L，蛋白胨20g/L，混匀后高压蒸汽灭菌。固体培养基加1.5％的琼脂粉。本试验YPD培养基用来培养酵母菌，酵母菌为真菌，高压蒸汽灭菌后温度降至50℃左右时向培养基中加入青-链霉素50ug/mL，从而抑制细菌生长而对酵母菌生长无影响。
0.2％氢氧化钾溶液：2g氢氧化钾溶解于水中，稀释并定容至1L。
10％TCA溶液：10g三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)溶解于水中，稀释定容至100mL。
柠檬酸钠缓冲液：0.1mol/L柠檬酸钠，调pH至5.0。
样品蛋白质提取液：0.03mol/L，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，含0.01mol/L的β-巯基乙醇。蛋白质在此溶液中将被解离为亚基。
1.3发酵底物配置及培养
发酵底物：95％大豆粕+5％粗大豆皮，粗大豆皮的作用是使物料疏松，便于搅拌、通气和散热。
发酵菌种混合液的配置及添加量：酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌及罗伊氏乳杆菌按1:1:1:1的比例添加，各菌种含量分别为6.05×108CFU/mL，总接种量为发酵体系质量的10％。
物料配置及培养：向发酵菌种混合液中加蒸馏水，使初始含水量为发酵体系的40％，混合均匀后向其中加入葡萄糖、KH2PO4、K2HPO4和蛋白酶混合物(添加量分别为2％、0.2％、0.3％和50U/(g发酵底物))，充分混匀后边搅拌边与发酵底物混合。
本实施例所用发酵桶为实验室自制，容量为50kg，发酵桶中加装了温控器及空气过滤器，可以有效过滤空气中的细菌，需要通氧时，打开通气阀即可向发酵桶充入37℃恒温无菌空气，控制发酵温度在37～40℃，发酵时间4d，前48h内每隔2h向桶内通入无菌空气10s，后48h将发酵桶密封进行厌氧发酵。好氧处理24h时翻料一次。发酵完成后将发酵豆粕装入双层密封袋内20℃以下低温保存，一周内使用。
1.4发酵样品采集
发酵过程中每隔2h观察记录发酵桶内温度状况，每隔12h从发酵桶内均匀取样约100g，测定pH值并用平板涂布法及时检测菌数生长状况。发酵完成后取样500g，立即测定pH及活菌数，60℃烘干粉碎后检测其他成分含量。
1.5试验结果与分析
1.5.1固态发酵对豆粕形态及营养成分的影响
(1)豆粕发酵前后形态、气味及颜色的变化
图1中，由左到右分别为豆粕、自制发酵豆粕烘干后及水溶液的照片。与豆粕相比，自制发酵豆粕有酸香气味。称取豆粕和自制发酵豆粕各5g样品溶解至70mL水中观察其颜色变化，发现与豆粕相比，自制发酵豆粕烘干后及水溶液的颜色均有不同程度的加深，且自制发酵豆粕的水溶液变浑浊。
(2)发酵豆粕菌种鉴定及计数
如图2所示，自制发酵豆粕未烘干，所以各菌种存活状态良好。发酵豆粕各菌落数如表1所示，与豆粕相比，自制发酵豆粕中有大量乳杆菌、芽孢杆菌和酵母菌存活，外购发酵豆粕中仅有枯草芽孢杆菌存活，原因可能是枯草芽孢杆菌在生长后期会分裂出很多芽孢，其抗逆性较强，在合适条件下仍可复苏生长。与外购发酵豆粕相比，自制发酵豆粕的活菌数是其1000倍，且有大量乳杆菌和酵母菌存活。
表1豆粕、自制发酵豆粕及外购发酵豆粕中各菌数①(CFU/g)
注：①n＝8。
②乳杆菌包括植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。
(3)固态发酵对豆粕干物质、粗蛋白质、粗脂肪及总能的影响
表2数据显示，豆粕发酵前后干物质含量分别为87.55％和51.84％。以干物质基础计算，豆粕经发酵后总能增加了2.20％，粗蛋白质含量增加了7.60％，粗脂肪含量由0.96％变为0.58％，下降了39.60％，粗纤维含量增加了73％。自制发酵豆粕的总能、粗纤维高于外购发酵豆粕，但粗蛋白质和粗脂肪含量都低于外购发酵豆粕。
表2豆粕、发酵豆粕的营养成分含量(干物质基础)
注：豆粕的干物质含量为87.55％，自制发酵豆粕的干物质含量为51.84％，外购发酵豆粕的干物质含量为92.58％。
(4)固态发酵对豆粕氨基酸含量的影响
由表3数据可知，豆粕经益生菌固态发酵后，氨基酸总量增加了1.28％，大部分氨基酸含量有所提高。与外购发酵豆粕相比除丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸外，其他氨基酸含量等于或大于外购发酵豆粕，氨基酸总量比外购发酵豆粕多0.59％。
表3豆粕、发酵豆粕的水解氨基酸含量(％，干物质基础)
(5)固态发酵对豆粕pH值、TCA可溶解蛋白及蛋白分布的影响
由表4中数据可得，豆粕经发酵后pH值为4.66下降了1.96，低于外购发酵豆粕，更加偏向酸性。TCA可溶解蛋白增加了91.8μmol/g变为原来的3.19倍，是外购发酵豆粕的2.36倍。
SDS-PAGE凝胶电泳图(图3)中蛋白条带1为外购发酵豆粕，2、3和4、5为不同批次的自制发酵豆粕，Image J软件分析自制发酵豆粕蛋白条带显示，发酵豆粕大分子蛋白被降解了56.30％，且自制发酵豆粕蛋白质主要分布于26kDa范围内，在此范围内占比为75.25％，是未发酵豆粕的2.22倍，比外购发酵豆粕高19.84％。7S球蛋白在电泳图谱中，三条亚基的相对分子质量从上到下分别为81kDa、72kDa、51kDa，11S球蛋白亚基相对分子质量主要为41kDa、37.5kDa、19.6kDa、16kDa。由图2-3可以看出，与豆粕相比，自制发酵豆粕和外购发酵豆粕中7S球蛋白和11S球蛋白被明显降解。
表4豆粕和发酵豆粕pH值、TCA可溶解蛋白含量及蛋白分布
实施例2固态发酵对豆粕饲喂仔猪效果的影响
发明人发现，用益生菌发酵豆粕后，不仅可以改善豆粕的营养成分，还可以得到多种益生菌，若以湿态形式饲喂断奶仔猪，可能会使发酵豆粕和益生菌在仔猪体内协同发挥作用。因此，本实施例将前期制作的发酵豆粕以湿态形式添加到断奶仔猪饲粮中，以探究发酵豆粕替代豆粕对断奶仔猪生长性能、血液指标、腹泻率以及肠道健康的影响，同时比较了添加自制发酵豆粕、添加外购发酵豆粕和添加益生菌对断奶仔猪的作用效果。
2.1材料与方法
2.1.1试验动物与分组
试验选取144头健康且体重相近的杜×长×大23±1日龄断奶仔猪(体重7.49±0.73kg)，随机分为4个处理组，各处理组6个重复，每个重复6头仔猪(公母各半)。4个处理组分别为：(1)对照组：玉米-豆粕型饲粮；(2)自制发酵豆粕组：自制发酵豆粕以干物质基础100％替代对照组中的豆粕；(3)外购发酵豆粕组：商品发酵豆粕100％替代对照组中的豆粕；(4)复合益生菌组：玉米-豆粕型基础饲粮+自制发酵豆粕组中同样种类、剂量的益生菌(即每千克饲粮中酵母菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌分别为22.68×108CFU)。试验期14天，其中生长性能统计到试验42天。
2.1.2试验饲粮
试验饲粮中，自制发酵豆粕直接以发酵完成后的初始状态，即未烘干状态添加到饲料中。各处理组试验饲粮中添加0.3％的Cr2O3作为指示剂，参照NRC 2012中7～11kg阶段猪营养需要量配制饲粮，试验饲粮组成及营养水平见表5。
表5饲粮配方与营养水平
注：①对照组和益生菌组饲粮中添加的豆粕中包含5％的粗大豆皮，以保证豆粕和自制发酵豆粕的物料成分相同，自制发酵豆粕仅为将豆粕发酵处理后的产物。
②本试验中自制发酵豆粕以湿态添加到饲粮中，考虑到其中水分含量较高，所以自制发酵豆粕的实际添加量以对照组中豆粕的干物质含量为标准；该组饲粮每3～5天配制一次。
③1％预混料为每kg试验饲粮提供维生素的量为：维生素A 12400IU；维生素D2800IU；维生素E 30mg；维生素K3 5mg；维生素B1 3mg；维生素B2 10mg；维生素B6 8mg；维生素B12 40μg；泛酸15mg；叶酸1mg；生物素0.08mg。为每kg饲粮提供微量元素的量为：Fe(FeSO4)120mg；Zn(ZnSO4)120mg；Cu(CuSO4)16mg；Mn(MnSO4)70mg；I(CaI2O6)0.7mg；Se(Na2SeO3)0.3mg。
④营养成分含量为干物质基础下数据，其中粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维均为实测值，其他为计算值。
2.1.3饲养管理
仔猪运至试验基地后，立即进行称重分组，打耳标，饮水添加抗应激电解液(自配)，缓解断奶与运输应激，每栏配有2个乳头式饮水器和1个料槽，圈舍为高床漏缝地板，猪舍温度控制在25℃左右。试验料为粉料，所有试验猪只自由采食和饮水。按猪场要求进行常规的免疫与驱虫保健。
2.2试验结果与分析
2.2.1固态发酵豆粕对断奶仔猪生长性能的影响
表6固态发酵豆粕对断奶仔猪生长性能、采食量及腹泻率的影响
注：①n＝6。
②a,b,c同行数据肩标不同字母者表示差异显著(P<0.05)，不标字母或标相同字母表示差异不显著，下同。
③表中平均日采食量为干物质基础。
分析表6中数据可知，试验期1～14天，与对照组相比，饲粮中添加自制发酵豆粕和益生菌显著提高了断奶仔猪的日增重(P<0.05)，而添加外购发酵豆粕并无显著效果；与对照组相比，添加自制发酵豆粕和益生菌显著提高了仔猪断奶后第14天的体重，且益生菌组显著高于对照组(P<0.05)，自制发酵豆粕组有高于对照组的趋势(P<0.10)，而添加外购发酵豆粕对仔猪断奶后14天结束体重并无显著影响(P>0.05)；自制发酵豆粕组的料重比低于其它处理组，但组间差异不显著(P>0.05)；试验1～14天各处理组平均日采食量、腹泻率差异不显著(P>0.05)。
试验15～42天，自制发酵豆粕组仔猪的平均日增重、试验末重、平均日采食量和料重比结果最优，但未达到显著水平(P>0.05)。试验全期，自制发酵豆粕组仔猪的平均日增重最大，料重比最小，但各组间差异不显著(P>0.05)。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种发酵豆粕的制备方法，包括以下步骤：以大豆粕和大豆皮为发酵底物，添加发酵菌种混合液，然后先进行有氧发酵、后进行无氧发酵，即得所述发酵豆粕，所述菌种包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌及罗伊氏乳杆菌。
2.权利要求1所述的制备方法，其中，所述发酵底物中大豆粕的质量百分比为95％，大豆皮的质量百分比为5％。
3.权利要求1所述的制备方法，其中，所述菌种为酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌及罗伊氏乳杆菌。
4.权利要求1或3所述的制备方法，其中，所述酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌及罗伊氏乳杆菌的数量比为1:1:1:1。
5.权利要求4所述的制备方法，其中，所述发酵菌种混合液中酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌及罗伊氏乳杆菌的含量均为6.05×108CFU/mL。
6.权利要求1所述的制备方法，其中，发酵体系由发酵底物和发酵菌种混合液组成，发酵菌种混合液中菌的总质量占发酵体系总质量的10％。
7.权利要求1所述的制备方法，其中，所述发酵菌种混合液含有2％(W/W)的葡萄糖、0.2％(W/W)的KH2PO4、0.3％(W/W)的K2HPO4和蛋白酶混合物，所述蛋白酶混合物的浓度为50U/1g发酵底物。
8.权利要求1所述的制备方法，其中，所述有氧发酵温度为37～40℃，优选37℃，发酵时间为48h，每2h向发酵罐中通入无菌空气10s，24h翻料一次。
9.权利要求1所述的制备方法，其中，所述无氧发酵温度为37～40℃，优选37℃，发酵时间为48h。
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