CN110339355B - 一种以细菌样颗粒为载体的新型艾滋病黏膜疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学领域，涉及一种以细菌样颗粒为载体的新型艾滋病黏膜疫苗。具体涉及到一种以细菌样颗粒为载体、能够通过滴鼻免疫诱导全身黏膜免疫的新型疫苗的设计构建及其应用。

Description

一种以细菌样颗粒为载体的新型艾滋病黏膜疫苗
技术领域
本发明涉及一种疫苗，特别涉及一种以细菌样颗粒为载体的新型艾滋病黏膜疫苗。
背景技术
艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)感染引发的重大传染性疾病。由于HIV病毒感染机制的复杂性，以及传播过程中的高突变性，目前尚没有针对HIV病毒有效的疫苗上市。
HIV-1感染和致病机制的研究中，研究者逐渐认识到黏膜的重要性：在HIV-1的传播中，性接触传播占绝大部分(75％～80％)；而且在感染初期，HIV-1在胃肠道黏膜大量复制，并导致黏膜部位CD4+T淋巴细胞大量损耗。HIV-1病毒无论通过何种途径感染，均会首先在肠黏膜大量复制，形成庞大的病毒库，其规模可能远大于先前研究所预计的，并且在感染初期直接或间接导致肠黏膜CD4+T细胞大量损失，即使通过高效抗逆转录病毒治疗(Highlyactive antiretroviral therapy,HARRT)也很难恢复，这种永久性的损伤构成了黏膜免疫缺陷的基础，并最终导致艾滋病发生[1,2]。因此，对于预防并控制HIV-1感染而言，黏膜保护至关重要。
事实上，在处于HIV-1暴露但未感染的个体中，可在其阴道和宫颈分泌物中检测到HIV-1特异性的分泌型IgA(sIgA)。这个结果表明，这些抗体具有中和活性或阻断HIV-1的转胞吞的能力[3]。毋庸置疑，HIV-1特异性黏膜免疫反应是有助于保护机体免受HIV-1感染。但迄今为止，只有少数疫苗的临床或临床前实验探讨了HIV-1的黏膜免疫反应[4]。
在泰国开展的RV144临床实验中显示，该疫苗预防HIV-1感染的有效性为31.2％[5]。进一步的分析表明，这种保护作用可能与高水平的Env特异性的IgA有关[6]。然而，在RV144实验中并没有收集黏膜样本来检测黏膜免疫反应。在另一项研究中，用表面带有gp41蛋白的类病毒颗粒作为抗原免疫5只猕猴，首先用肌肉注射的方式进行初次免疫，然后用滴鼻免疫的方式加强免疫。5只猕猴中有4只在受到SHIV-SF162P3病毒攻毒后，并未被感染。在这4只猕猴中检测到了具有阻断HIV-1病毒转胞吞作用功能的gp41特异性的IgA[7]。
HIV-1的gp120通过与细胞表面上的CD4分子结合来介导HIV-1与靶细胞的膜融合，它是阻断HIV-1感染的重要靶点[8]。因此，能够诱导针对gp120黏膜免疫反应的疫苗很可能具有预防HIV-1感染的能力。许多研究表明，接近天然构象的Env蛋白三聚体很可能是诱导广泛中和抗体(bNAb)的理想免疫原[9]。同时有文献表明，三聚体形式的Env蛋白与非三聚体形式的蛋白相比，可能更适合作为黏膜疫苗的免疫原[10]。因此，本发明采用的免疫原是在前期研究基础上获得的三聚体形式的gp120蛋白。
为了打破黏膜耐受，促进抗原的提呈，合适的黏膜佐剂或是黏膜载体必不可少。到目前为止，许多佐剂被尝试用于改善HIV-1黏膜疫苗的免疫原性，包括GM-CSF DNA、霍乱毒素、MPLA等[11]。在我们的研究中，一种新型的黏膜载体被用来诱导针对HIV-1的黏膜免疫应答。这种被称为细菌样颗粒(Bacterium-like particles,BLPs)的载体基于非重组的乳酸乳球菌，该颗粒在美国食品和药物管理局(FDA)中被认为是安全的[12]。在制备BLPs的过程中，除了细胞壁中的肽聚糖，所有的其余成分，包括内部的DNA和蛋白质都被除去，最终得到具有和原细菌大小，形态类似的球状颗粒。BLPs有两种使用方式，一种是与抗原混合作为佐剂。另一种是作为抗原载体，通过肽聚糖结合标签Protan与抗原结合，研究表明这种结合型的疫苗在诱导黏膜免疫反应重更具优势。Protan的设计基于乳酸乳球菌细胞壁水解酶结合域的蛋白[13]。BLPs已被用于流感和呼吸道合胞病毒在内的一些呼吸道病毒的黏膜疫苗设计中。在这些研究中，发现BLPs通过激活TLR2受体来增强黏膜免疫反应[14]。
发明内容
本发明提供了一种新型的艾滋病黏膜疫苗，其特点以细菌样颗粒BLP为载体，载体表面通过蛋白连接器Protan展示三聚体形式的HIV-1gp120蛋白。BLP是一种新型的黏膜佐剂，来源于灭活的食品级乳酸乳球菌。基于其良好的颗粒性质与免疫刺激性质，本发明提供的疫苗可以更为安全有效地诱导HIV-1特异性的黏膜免疫反应。
为了提升疫苗的有效性，本发明所提供的疫苗抗原是在艾滋病病毒中国流行株CRF01_AE亚型gp120亚单位疫苗基础上进一步优化获得的三聚体形式的重组gp120蛋白。
本发明提供的黏膜疫苗是通过滴鼻免疫的，但疫苗可以在鼻腔、直肠以及生殖道等多个黏膜组织诱导产生分泌型IgA。
附图说明
图1.新型艾滋病黏膜疫苗设计示意图。
图2.gp120三聚体蛋白表达及鉴定。
图3.蛋白与BLP连接能力检测。
图4.小鼠免疫策略示意图。
图5.小鼠体液免疫反应监测。
具体实施方式
实施例1构建抗原蛋白表达载体
本方案以pTT5质粒作为表达载体，采用CRF01_AE亚型的BJOX015毒株的Env序列(序列1)进行抗原的构建。通过在gp120基因N段融合表达Protan(序列2)标签蛋白，使gp120通过Prtoan蛋白和BLP特异性结合。通过在gp120基因C端加入MTQ(序列3)三聚模序，使gp120形成三聚体结构。另外，利用组织分泌型信号肽(tPA，序列4)使我们的蛋白能够分泌表达。
将pTT5空载体酶切成线性片段，然后利用PCR分别扩增出tPA，Protan，gp120，MTQ的片段，利用同源重组试剂盒进行同源重组的到pTT5-tPA-Protan-gp120-MTQ抗原蛋白表达载体，表达出的抗原蛋白Protan-gp120-MTQ简写为PAM。
引物设计：
tPA-F:CTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGCCACCATGGATGCAATGAAGAGA
tPA-R:GCGGGTTTAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGGGTACCGCTGGGCGAAACGAAGAC
Protan-F：CACTGGGCATCGCCCCAACTGGATCCGGTGGTGGT
Protan-R：GTTTAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGTTATTTAATACGCA
gp120-F:AGTTTAAACGGATCTCTAGCGAATTCGCCACCATGGATGCAATGAAGAG
gp120-R:AGCCAGAGGTCGAGGTCGGGCTCGAGTTAAGTTGGGGCGATGCCCA
MTQ-F:TCGTTTCGCCCAGCGGTACC TCCAACAATCTGTGGGTCA
MTQ-R:GAACCACCACCACCGGATCC GCAACAACCCCCAGCAAT
酶切反应体系：
Figure BDA0002182048420000031
反应条件：37℃，1h。
酶切反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像仪UV照射下，切下目的片段，再根据凝胶回收试剂盒说明书，进行目的片段的回收，取1μl样品用于浓度测定。
PCR反应体系：
Figure BDA0002182048420000032
Figure BDA0002182048420000041
PCR程序：
98℃ 10s
55℃ 15s}30次循环
72℃ 30s
胶回收目的片段，准备和线性载体片段一起进行同源重组。
同源重组体系：
Figure BDA0002182048420000042
反应条件：50℃，15min。
大肠杆菌转化培养：
加入重组产物，冰上放置15min。42℃水浴30秒后，迅速置于冰上冷却3-5min。向管中加入800μlLB液体培养基(不含抗生素)，37℃ 180rpm振荡培养1h。将菌液3000rpm离心1min，弃上清留取约100μl培养基重悬菌体，涂布氨苄抗性固体筛选培养基上。正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，37℃培养16-24h。
单克隆培养：
用无菌白枪头挑取单克隆菌落，培养于5ml卡那抗性LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养16h。
质粒提取：
根据质粒大提试剂盒的操作指南，进行质粒提取。取1μl质粒直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，或酶切鉴定，选取正确的质粒送测序公司进行测序。
实施例2抗原蛋白表达纯化
瞬时转染293-6E悬浮细胞72h后收获细胞培养上清。通过扁豆凝集素进行亲和层析，得到抗原蛋白，然后通过蛋白电泳和Western blot进行性质鉴定。具体步骤如下：
瞬时转染293-6E步骤：
1.细胞复苏后传至三代以上,细胞状态良好者,可进行转染。
2.转染前对细胞进行计数,保证细胞密度在1.5xl06 cells/mL。
3.配制DNA/PEI复合物，DNA：PEI＝1:4，DNA终浓度为1.25μg/1×106cells加入到新培养基中，DNA与PEI(1μg/ul)分别加入2ml培养基中，孵育5min后，将含有PEI培养基加入到含有DNA的培养基中，终体积4ml，室温静置10～15min。
4.将转染体系缓慢逐滴滴加入细胞中，边加边摇晃。
5.从培养1天开始，每日取样检测细胞存活状态，需保证存活率>90％。
6. 72h后收获细胞培养上清，进行蛋白纯化。
蛋白纯化步骤：
1.将收获的细胞上清液1000g离心2h去除细胞。收获上清，进一步用8000g离心10min去除细胞碎片。收获上清，用0.45μm滤膜过滤。
2.配制1×PBS，过0.45μm滤膜。
3.先用纯化水清洗机器，再用PBS清洗，将层析柱连接在机器上，冲洗其中剩余的20％乙醇，加入4个柱体积的1×PBS平衡柱料。
4.平衡后，以0.5ml/min进样，(根据总溶液体积及时间可调整。)
5.上样结束后，加入4个柱体积PBS冲洗杂蛋白，可适当加快流速。
6.用40ml 10％甘露糖的PBS洗脱目的蛋白，流速1ml/min。
7.用40ml含有0.1％Triton的PBS去除甘露糖(提前配置，50℃水浴中溶解)，再生柱料，可适当加快流速，5ml/min。
8.最后用20％乙醇封柱，将装好的层析柱4℃保存。
蛋白浓缩：
1.使用100KD超滤管，使用台式离心机4000rpm，直至蛋白溶液体积至1ml左右。
2.加入经过0.22μm滤膜过滤的PBS，4000rpm 40min漂洗3-4次。
3.最后将蛋白溶液超滤浓缩至1ml左右，加入到1.5ml离心管中-20℃保存。
蛋白电泳：
1.配置10％SDS-PAGE，15电泳胶每孔加入样品为7μl。
2.浓缩胶电压80V，分离胶电压120，待溴酚蓝前沿进入电泳缓冲液后，电泳结束。
3.轻轻取下电泳胶浸泡在适量考马斯亮兰染色液中，放置在脱色摇床上染色40min。
4.随后换为脱色液进行脱色，每隔30min换一次脱色液，直至蛋白条带清晰为止。
Western blotting：SDS-PAGE结束后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。加入3B3单抗及HRP偶联的山羊抗小鼠二抗，以及ECL色液，在全自动化学发光图像分析系统下显色观察。
实施例3抗原蛋白于BLP结合具体步骤：
1.将BLP与抗原蛋白溶液进行混和，4℃摇晃过夜。
2. 8000g离心10min去除上清溶液，收获沉淀的BLP。
3.用PBS重悬BLP，再次8000g，离心10min。重复三次，漂洗BLP，去除未与BLP结合的抗原蛋白。
4.适当浓度重悬BLP，的到与抗原蛋白结合的BLP。
5.将BSA标准品进行系列稀释2mg至0.25mg/ml，同不同的目的蛋白同时进行SDS-PAGE，用Quantity One软件对电泳结果进行分析，将标准品的浓度对光密度作图得到标准曲线，通过代入目的蛋白的光密度得到相应蛋白浓度。
最终得到结论，1mgBLP可以结合50μg PAM蛋白。
实施例4Balb/C小鼠免疫实验
1.将20只豚鼠随机分为3组，每组5只，分别免疫抗原PAM-BLP，BLP，PBS。免疫剂量为每只小鼠10μg抗原蛋白。PAM-BLP组免疫BLP的质量则依照BLP与PAM结合的比例换算，该组小鼠免疫0.2mg的BLP。单独的BLP对照组免疫0.2mg的BLP，PBS组则免疫10μl PBS。所有的动物经过滴鼻免疫方式进行免疫。
2.免疫一共进行4次，间隔两周。每次免疫后12天进行采血。
3.采血采用的方式为脸部静脉丛采血，每次每只小鼠采血100μl。
4.血清处理：先置于37℃促凝1h，随后在4℃条件下保存1h，利于血清的析出。3000rpm离心30min,小心吸取上层血清至一新的EP管中，切忌吸出血细胞。血清标记后，分装保存于-80℃。
5.ELISA检测血清结合抗体滴度以及黏膜样品IgA滴度。
ELISA步骤：
1.包被：用包被液将PAM稀释成浓度为1ng/μl，每孔100μl，4℃包被过夜。
2.洗涤：每孔加入200μl PBST，洗涤5次，每次3min。
3.封闭：每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h。
4.加入血清：洗涤5次后，每孔加入100μl血清(5倍系列稀释)37℃孵育2h。
5.加入二抗：洗涤5次后，每孔加入100μl HRP偶联的小鼠IgG二抗(1:10000稀释)或HRP偶联的小鼠IgA二抗(1:10000稀释)，37℃孵育45min。
6.显色：洗涤5次后，每孔加入100μl TMB显色15min，每孔加入50μl终止液终止反应，酶标仪读取450nm处的吸光度。
实验结果
本方案成功表达了PAM抗原蛋白，并将其成功连接于BLP表面。通过滴鼻的方式对Balb/C小鼠进行免疫，成功地诱导出Env特异性地黏膜sIgA。具体结果见实验结果图。
主要试剂和耗材：
Figure BDA0002182048420000071
Figure BDA0002182048420000081
主要溶液：
1.细菌培养液
1)LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，去离子水定容到1000ml，高压灭菌。
2)氨苄卡那霉素：0.5g溶于去离子水中并定容到10ml，配制成最终浓度为50mg/ml溶液，0.22μm无菌滤膜过滤除菌，分装保存-20℃，1:1000稀释使用。
2.蛋白表达及纯化溶液
1)PEI溶液：1gPEI溶于1000ml水中，配置成最终浓度为1mg/ml溶液，0.22μm无菌滤膜过滤除菌，分装保存-20℃。
2)PBS缓冲液(pH7.2)：称取0.2g KCl,0.8g NaCl,0.2g KH2PO4,1.15g Na2HPO4·7H2O,去离子水定容到1L，0.45μm无菌滤膜过滤除菌。
3)甘露糖洗脱液(500mM)：40mg甘露糖溶于40mlPBS溶液中，0.45μm无菌滤膜过滤除菌。
3.SDS-PAGE及Western blot所需溶液
1)Tris-甘氨酸电泳缓冲液：称取3.03g Tris、18.75g甘氨酸、1g SDS粉末，去离子水配制，溶解后定容到1L。
2)10％SDS：称取50g SDS粉末，430ml去离子水配制，调pH值为7.2，定容到500ml。
3)30％丙烯酰胺：称取1.6g N,N’-甲叉双丙烯酰胺，58.4g丙烯酰胺，去离子水配制，定容到200mL，过滤除杂，避光保存。
4)Tris-HCl(pH6.8)：称取12.12g Tris粉末，去离子水配制成1M，HCl调pH值至6.8。
5)Tris-HCl(pH8.8)：称取18.8g Tris粉末，去离子水配制成1.5M，HCl调pH值至8.8。
6)10％APS：称取1g过硫酸铵，10ml去离子水配制。
7)10％SDS-PAGE分离胶：1.9ml H2O，1.7ml 30％丙烯酰胺，1.3ml Tris-HCl(pH8.8)，50μl 10％SDS，50μl 10％APS，2μl TEMED。
8)SDS-PAGE浓缩胶：1.4ml H2O，0.33ml 30％丙烯酰胺，0.25ml Tris-HCl(pH6.8)，20μl 10％SDS，20μl 10％APS，2μl TEMED。
9)4×sample buffer：0.8g SDS，0.04g溴酚蓝粉末，0.4mlβ-巯基乙醇，5ml Tris-HCl(0.5M pH6.8)，4.6ml甘油，去离子水定容到5ml。
10)电转buffer：称取3.05g Tris和14.4g甘氨酸粉末，加入200ml甲醇去离子配制，溶解后定容到1L。
11)考马斯亮兰染色液：称取考马斯亮兰R-250粉末50mg，加入250ml去离子水、50ml 85％磷酸、25ml 95％乙醇，定容到500mL。
12)考马斯亮蓝脱色液：量取水900ml,甲醇900ml,冰醋酸200ml，混合均匀。
13)PBS缓冲液(pH6.8)：称取0.2g KCl,0.8g NaCl,0.2g KH2PO4,1.15g Na2HPO4·7H2O,去离子水定容到1L。
14)PBST：1L PBS含有500μl Tween-20(2‰，V/V)。
15)封闭液：90ml PBS-T中加入3g脱脂奶粉，溶解后定容到100ml，现用现配。
4.ELISA所需溶液
1)包被液：称取1.7g Na2CO3、2.9g的NaHCO3，去离子水配制，调pH为9.6，定容到1L。
2)洗涤液：PBS-T，PBS含有0.05％Tween-20(V/V)，调pH值为7.4。
3)封闭液：洗涤液配制，含有1％BSA(V/V)。
4)二抗buffer：100ml水中加入0.38g的十二水磷酸钠和0.46g的氯化钠，混匀溶解，pH为7.6。
5)终止液：2MH2SO4。
主要仪器：
Figure BDA0002182048420000091
Figure BDA0002182048420000101
参考文献
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序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种以细菌样颗粒为载体的新型艾滋病黏膜疫苗
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 852
<212> PRT
<213> Env
<400> 1
Met Ala Val Ala Gly Ile Gly Met Ala Thr Pro His Leu Thr Leu Thr
1 5 10 15
Gly Ile Leu Ile Ile Gly Leu Val Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ala Ala
20 25 30
Leu Thr Val Thr Val Thr Thr Gly Val Pro Val Thr Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Thr Thr Leu Pro Cys Ala Ser Ala Ala Leu Ala His Met Thr Gly Val
50 55 60
His Ala Val Thr Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro
65 70 75 80
Gly Gly Ile Pro Leu Gly Ala Val Thr Gly Ala Pro Ala Met Thr Leu
85 90 95
Ala Ala Met Val Gly Gly Met Gly Gly Ala Val Ile Ser Leu Thr Ala
100 105 110
Gly Ser Leu Leu Pro Cys Val Leu Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu
115 120 125
Ala Cys Thr Ala Ala Ala Leu Ala His Ala Leu Thr His Ala Ile Thr
130 135 140
Thr Gly Ala Ala Ala Ile Gly Ala Ile Thr Ala Gly Val Leu Ala Cys
145 150 155 160
Thr Pro Ala Met Thr Thr Gly Ile Ala Gly Leu Gly Gly Leu Val His
165 170 175
Ala Leu Pro Thr Ala Leu Ala Ile Val His Met Gly Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Gly Thr Ala Leu Ile Ser Cys Ala Thr Ser Val Ile Leu Gly Ala Cys
195 200 205
Pro Leu Ile Ser Pro Ala Pro Ile Pro Ile His Thr Cys Ala Pro Ala
210 215 220
Gly Thr Ala Ile Leu Leu Cys Ala Ala Leu Leu Pro Ala Gly Thr Gly
225 230 235 240
Pro Cys Leu Ala Val Ser Thr Val Gly Cys Thr His Gly Ile Leu Pro
245 250 255
Val Val Ser Thr Gly Leu Leu Leu Ala Gly Ser Leu Ala Gly Gly Gly
260 265 270
Ile Ile Ile Ala Ser Gly Ala Leu Thr Ala Ala Val Leu Thr Ile Ile
275 280 285
Val Gly Pro Ala Leu Ser Val Ser Ile Ala Cys Thr Ala Pro Ser Ala
290 295 300
Ala Thr Ala Thr Ser Val Ala Ile Gly Pro Gly Gly Met Pro Thr Ala
305 310 315 320
Thr Gly Ala Ile Ile Gly Ala Ile Ala Leu Ala Thr Cys Gly Ile Ala
325 330 335
Gly Thr Gly Thr Ala Gly Thr Leu Ala Gly Val Thr Gly Leu Leu Leu
340 345 350
Gly His Pro Leu Ala Leu Thr Ile Val Pro Gly Pro Pro Ser Gly Gly
355 360 365
Ala Leu Gly Thr Thr Met His His Pro Ala Cys Ala Gly Gly Pro Pro
370 375 380
Thr Cys Ala Thr Thr Leu Leu Pro Ala Ser Thr Gly Ala Gly Thr Met
385 390 395 400
Gly Gly Ala Ala Thr Thr Ile Ile Leu Pro Cys Leu Ile Leu Gly Ile
405 410 415
Val Ala Met Thr Gly Gly Val Gly Gly Thr Met Thr Ala Pro Pro Ile
420 425 430
Ser Gly Ile Ile Ser Cys Thr Ser Ala Ile Thr Gly Ile Leu Leu Thr
435 440 445
Ala Ala Gly Gly Ser Gly Ala Ala Ala Thr Gly Thr Pro Ala Pro Gly
450 455 460
Gly Gly Ala Ile Leu Ala Ala Thr Ala Ser Gly Leu Thr Leu Thr Leu
465 470 475 480
Val Val Gly Ile Gly Pro Leu Gly Ile Ala Pro Thr Ala Ala Leu Ala
485 490 495
Ala Val Val Ala Ala Gly Leu Ala Ala Val Gly Ile Gly Ala Met Ile
500 505 510
Pro Gly Pro Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Ile
515 520 525
Thr Leu Thr Val Gly Ala Ala Gly Leu Leu Ser Gly Ile Val Gly Gly
530 535 540
Gly Ser Ala Leu Leu Ala Ala Ile Gly Ala Gly Gly His Leu Leu Gly
545 550 555 560
Leu Thr Val Thr Gly Ile Leu Gly Leu Gly Ala Ala Val Leu Ala Val
565 570 575
Gly Ala Thr Leu Leu Ala Gly Leu Pro Leu Gly Leu Thr Gly Cys Ser
580 585 590
Gly Leu Ile Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Thr Ala Ser Thr Thr Ser
595 600 605
Ala Leu Ser Thr Gly Gly Ile Thr Ala Ala Met Thr Thr Ile Gly Thr
610 615 620
Gly Leu Gly Ile Ser Ala Thr Thr Ala Leu Ile His Ala Leu Leu Thr
625 630 635 640
Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Leu Ala Leu Leu Gly Leu
645 650 655
Ala Leu Thr Ala Ser Leu Thr Ala Thr Pro Ala Ile Thr Leu Thr Leu
660 665 670
Thr Thr Ile Leu Ile Pro Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Ile Gly Leu
675 680 685
Ala Ile Ile Pro Ala Val Leu Ser Ile Val Ala Ala Val Ala Gly Gly
690 695 700
Thr Ser Pro Leu Ser Pro Gly Thr Pro Pro His Gly Gly Ala Gly Pro
705 710 715 720
Ala Ala Pro Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala
725 730 735
Ala Ser Val Ala Leu Val Ser Gly Pro Leu Ala Leu Ala Thr Ala Ala
740 745 750
Leu Ala Ala Leu Cys Leu Pro Ser Thr His Ala Leu Ala Ala Pro Val
755 760 765
Leu Ile Ala Thr Ala Thr Val Gly Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ala Ala
770 775 780
Gly Thr Gly Ser Leu Leu Thr Leu Gly Ala Leu Leu Leu Thr Thr Gly
785 790 795 800
Gly Gly Leu Leu Thr Ser Ala Ile Ser Leu Leu Ala Ala Ile Ala Ile
805 810 815
Thr Thr Ala Gly Thr Thr Ala Ala Val Ile Gly Val Ala Gly Gly Ala
820 825 830
Thr Ala Ala Leu Leu His Ile Pro Ala Ala Ile Ala Gly Gly Leu Gly
835 840 845
Ala Ala Leu Leu
850
<210> 2
<211> 236
<212> PRT
<213> Protan
<400> 2
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gly Asn Thr Asn Ser Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ile Thr Asn
20 25 30
Asn Asn Ser Gly Thr Asn Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Val Lys Ser
35 40 45
Gly Asp Thr Leu Trp Gly Ile Ser Gln Arg Tyr Gly Ile Ser Val Ala
50 55 60
Gln Ile Gln Ser Ala Asn Asn Leu Lys Ser Thr Ile Ile Tyr Ile Gly
65 70 75 80
Gln Lys Leu Val Leu Thr Gly Ser Ala Ser Ser Thr Asn Ser Gly Gly
85 90 95
Ser Asn Asn Ser Ala Ser Thr Thr Pro Thr Thr Ser Val Thr Pro Ala
100 105 110
Lys Pro Thr Ser Gln Thr Thr Val Lys Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu
115 120 125
Trp Ala Leu Ser Val Lys Tyr Lys Thr Ser Ile Ala Gln Leu Lys Ser
130 135 140
Trp Asn His Leu Ser Ser Asp Thr Ile Tyr Ile Gly Gln Asn Leu Ile
145 150 155 160
Val Ser Gln Ser Ala Ala Ala Ser Asn Pro Ser Thr Gly Ser Gly Ser
165 170 175
Thr Ala Thr Asn Asn Ser Asn Ser Thr Ser Ser Asn Ser Asn Ala Ser
180 185 190
Ile His Lys Val Val Lys Gly Asp Thr Leu Trp Gly Leu Ser Gln Lys
195 200 205
Ser Gly Ser Pro Ile Ala Ser Ile Lys Ala Trp Asn His Leu Ser Ser
210 215 220
Asp Thr Ile Leu Ile Gly Gln Tyr Leu Arg Ile Lys
225 230 235
<210> 3
<211> 43
<212> PRT
<213> MTQ
<400> 3
Gly Gly Ser Gly Gly Ile Lys Glu Glu Ile Ala Lys Ile Lys Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Lys Ile Lys Glu Lys Ile Ala Glu Ile Glu Lys Arg Ile Ala
20 25 30
Glu Ile Glu Lys Arg Ile Ala Gly Gly Cys Cys
35 40
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> tPA
<400> 4
Ala Gly Arg Asn Glu Asp Cys Ser Thr Gln Gln Gln His Thr Ala Glu
1 5 10 15
Pro Ser Leu His Cys Ile His
20

Claims (4)

1.一种以细菌样颗粒为载体的新型艾滋病黏膜疫苗，其特征在于以细菌样颗粒为载体，三聚体形式的gp120蛋白为免疫原；三聚体形式的gp120蛋白特征为：采用CRF01_AE亚型的BJOX015毒株的Env序列进行抗原的构建，Env序列如序列1所示；通过在gp120基因N段融合表达Protan标签蛋白，Protan如序列2所示，使融合蛋白与BLP特异性结合；通过在gp120基因C端加入MTQ三聚模序，MTQ如序列3所示，形成三聚体结构。
2.如权利要求1所述的新型艾滋病黏膜疫苗，其特征在于：其中的细菌样颗粒载体衍生自乳酸乳球菌。
3.如权利要求1所述的新型艾滋病黏膜疫苗，其特征在于：其免疫方式为滴鼻、肌注、皮下、口服常规疫苗免疫接种途径。
4.如权利要求3所述的新型艾滋病黏膜疫苗，其特征在于：其免疫方式为滴鼻免疫。
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