CN110337497A - 通过多路连接标记寡核苷酸探针 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过连接对核酸探针进行多重标记的新方法。所述方法使用连接酶催化的反应，在稳定互补的适配子寡核苷酸的存在下，将核酸探针与多个预先制备的核酸标记载体分子进行连接。所述方法允许用多个不同的标记对多个探针进行简单、廉价和快速的标记。通过这种方式，显著降低了生成单分子荧光原位杂交(smFISH)测定的成本和投入，从而允许核酸探针的组合多色条形码。本发明还提供了用于生成包括本发明新工具的FISH文库和标记试剂盒的方法。
Description
发明领域
本发明提供了通过连接对核酸探针进行多重标记的新方法。该方法使用连接酶催化的反应，在稳定互补的适配子寡核苷酸的存在下，将核酸探针与多个预先制备的核酸标记载体分子进行连接。该方法允许用多个不同的标记对多个探针进行简单、廉价和快速的标记。通过这种方式，显著降低了生成单分子荧光原位杂交(smFISH)测定的成本和投入，允许核酸探针的组合多色条形码。本发明还提供了用于生成包括本发明新工具的FISH文库和标记试剂盒的方法。
描述
自从40多年前Joseph G.Gall和Mary-Lou Pardue发明原位杂交(ISH)以来，这种强大的技术极大地改变了用于生物标志物检测的基础研究(即基因表达等)和诊断。只有通过ISH，研究人员才能够研究基因表达，并利用空间信息诊断生物标志物水平。如今，ISH及其衍生物已经成为包括组织学、单细胞生物学等在内的各领域中的主力。甚至有一些组学规模的努力试图拥有一个完整的基因表达图谱，如基于ISH的艾伦脑图谱(Allen BrainAtlas)。随着荧光团化学和显微术硬件的发展，荧光原位杂交(FISH)由于其优异的低背景和纳米级空间定位信号(相对于ISH的酶促反应产生的扩散信号)而受到更多的关注，并且其可以用作ISH的良好替代品，特别是在需要对生物标志物进行数字和时空量化的精密医学的未来应用中。
自90年代以来，Robert Singer及其同事将FISH创新性地用于对单个分子水平的单独mRNA转录物进行原位成像(smFISH)，从那时起基因表达或生物标志物检测能够以数字和单分子方式进行(图1)。然而，第一探针文库是由五种基因特异性不同的定制合成的五荧光团标记的寡核苷酸制成的，其现在仍然非常昂贵，这使这一强大的发明不适用于每种基因。从2008年开始，Arjun及其同事发明了一种基于经典NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)共轭化学的汇集单荧光团标记方法，这大大降低了探针文库的成本。并且，该新型标记现已获得Biosearch Technologies公司的许可，因此科研用户和临床用户可以以100-400个反应约760欧元的价格使用这种技术。使用商业FISH探针文库的这一特别高的成本以及它的低通量是smFISH的根本限制，通常smFISH方法允许一次只探测一些基因。这种低通量是由于缺乏用于标记细胞的分辨探针以及产生高效染色所需的大量标记探针的成本导致的。因此，smFISH探针生成的改进和提高检测效率是必要的。
欧洲申请号16190862.9公开了用于生成标记的寡核苷酸的基于连接的方法。然而，该方法将探针序列与多个标记的第二寡核苷酸连接。然而，一个寡核苷酸的多重标记可能由于诸如标记部分之间的猝灭的干扰而导致间隔问题。
在描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方案，并且因此当然可以改变。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制，这是因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
本申请说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指出通过引用并入一样，并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于这些出版物。此外，提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要独立地确认。
上述问题通过用于产生标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针的方法解决，所述方法包括以下步骤：
(a)提供探针-序列-寡核苷酸，其包含：(i)探针序列，所述探针序列包含与靶核酸互补的核苷酸序列，以及(ii)与第一适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列,
(b)提供标记-载体-寡核苷酸，其包含至少一个标记部分或其他功能部分，其中所述标记-载体-寡核苷酸具有与第二适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列，
(c)提供适配子-寡核苷酸，其包含直接序列中的第一适配子核苷酸序列和第二适配子核苷酸序列；
(d)使所述探针-序列-寡核苷酸、所述标记-载体-寡核苷酸和所述适配子-寡核苷酸在杂交条件下接触以形成复合物，其中在所述复合物中，游离的(未封闭的)-OH基团与游离的(未封闭的)磷酸基团在空间上紧密接近,
(e)在连接条件下使用连接酶，使所述复合物反应以在3’-OH基团与5’-磷酸基团之间形成共价键，从而形成所述标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针；
(f)任选地，去除所述适配子-寡核苷酸。
本发明的方法可用于将标记-载体-寡核苷酸与探针-序列-寡核苷酸的3’末端和5’末端连接。因此，在一个实施方案中，本发明的方法是优选的，其中在所述探针-序列-寡核苷酸中，所述探针序列是所述预定的标签核苷酸序列的5’，并且在所述适配子-寡核苷酸中，所述第一适配子核苷酸序列和第二适配子核苷酸序列在直接序列中按照3’至5’方向，并且在步骤(d)中的所述复合物中，所述探针-序列-寡核苷酸的游离的3’OH基团与所述标记-载体-寡核苷酸的游离的(未封闭的)磷酸基团在空间上紧密接近。在本发明的替代实施方案中，提供了一种方法，其中在所述探针-序列-寡核苷酸中，所述探针序列是所述预定的标签核苷酸序列的3’，并且在所述适配子-寡核苷酸中，所述第一适配子核苷酸序列和第二适配子核苷酸序列在直接序列中按照5’至3’方向，并且在步骤(d)中的所述复合物中，所述探针-序列-寡核苷酸的游离的(未封闭的)磷酸基团与所述标记-载体-寡核苷酸的游离的3’OH基团在空间上紧密接近。
本发明的方法和化合物允许快速、廉价和容易地标记核酸探针。本发明的构想是提供一种系统，该系统允许从业者推迟标记任何给定的寡核苷酸探针(探针-序列-寡核苷酸)，而无需将标记-部分连接至单独的探针序列-这是昂贵的且因此损害了许多标记的单独探针文库的生成。为此，本发明现在提供了一种系统，其包含一种或优选更多种预先制备的标记-载体-寡核苷酸，其中每种标记-载体-寡核苷酸包含不同的标记或其他修饰。然后，本发明提供具有与探针-序列-寡核苷酸和标记-载体-寡核苷酸中的预定的标签核苷酸序列互补的序列的适配子寡核苷酸，以将这些分子组装成复合物，在复合物中它们可以通过简单的连接而融合在一起。以这种方式，本发明提供了通过连接将多个不同的标记连接到核苷酸序列探针的简单方法。对于连接的标记-载体-寡核苷酸中的每一个，仅使用一些，优选仅一个标记或其他修饰，这些标记中的每一个也彼此充分间隔以避免干扰。
最优选地，本发明方法的步骤(b)包括：提供第一标记-载体-寡核苷酸和第二标记-载体-寡核苷酸、任选地第三或更多个(第四、第五、第六、…第五十…第一百等)标记-载体-寡核苷酸，其中所述第一标记-载体-寡核苷酸具有与第二适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列，所述第二标记-载体-寡核苷酸具有与第三适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列，任选地，所述第三或更多个标记-载体-寡核苷酸具有与第四或更多个适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列，并且其中在步骤(c)中，所述适配子-寡核苷酸包含直接序列中的第一、第二、第三、任选地第四或更多个适配子核苷酸序列。在该实施方案中，本发明的所述探针-序列-寡核苷酸可以容易地用多个标记或其他部分标记。
在本发明的上下文中，当提及具体的寡核苷酸、或探针、或提及描述核酸的其他表述时，技术人员将认识到该表述不是指单个分子，而是指单一种类的分子。在实验室的实际应用中，技术人员使用一种例如一条寡核苷酸序列的众多分子的制剂。在这样的分子群中，通常所有核苷酸都是相同的，除了例如在寡核苷酸合成期间产生包含随机序列区的寡核苷酸。这可以通过将寡核苷酸与多于一种类型的核苷酸的均匀混合物聚合，然后将其偶然偶联来实现。在这种情况下，混合物中的寡核苷酸的种类含有“简并”序列。
术语“核苷”和“核苷酸”旨在包括那些不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，而且还含有已经被修饰的其他杂环碱基的部分。此类修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其他杂环。此外，术语“核苷酸”包括那些含有半抗原或荧光标记，并且不仅可以含有常规的核糖和脱氧核糖，而且还可以含有其他糖的部分。修饰的核苷或核苷酸还包含对糖部分的修饰，如其中一个或多个羟基基团被卤素原子或脂族基团替换，被官能化为醚、胺、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)等。
术语“核酸”是指由核苷酸如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的任何长度，如大于约2个碱基、大于约10个碱基、大于约100个碱基、大于约500个碱基、大于1000个碱基、多达约10,000个或更多个(如，100,000,000个或更多个)碱基的聚合物，并且可以酶促或合成产生，其可以与天然存在的核酸以与两条天然存在的核酸类似的序列特异性方式杂交，如可以参与Watson-Crick碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶/尿嘧啶(分别为G、C、A和T/U)。
如本文所用的术语“寡核苷酸”表示约2至约500个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以是合成的，或可以酶促制备。寡核苷酸可含有核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)、脱氧核糖核苷酸单体或这两者的组合。寡核苷酸的长度可以是10至20、11至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150、150至200或200-250或多达500个核苷酸。
术语“杂交”是指经由Watson-Crick碱基配对进行的核酸与互补核酸的特异性结合。因此，术语“原位杂交”是指核酸与细胞内或完整染色体中的互补核酸的特异性结合。关于核酸，术语“杂交”和“结合”可互换使用。
术语“杂交条件”意指足以允许至少一部分互补序列彼此退火的时间、温度和pH，以及反应物和试剂的必要量和浓度的那些条件。如本领域众所周知的，实现杂交所需的时间、温度和pH条件取决于待杂交的寡核苷酸分子的大小、待杂交的寡核苷酸之间的互补程度以及杂交反应混合物、盐等中其他材料的存在。每个杂交步骤所必需的实际条件是本领域众所周知的，或者无需过多实验即可确定。
如本文所用的术语“原位杂交条件”是指允许核酸与细胞中的互补核酸，如，RNA或DNA分子中核苷酸的序列和互补寡核苷酸，杂交的条件。合适的原位杂交条件可包括杂交条件和任选的洗涤条件两者，所述条件包括温度、变性试剂的浓度、盐、孵育时间等。此类条件是本领域已知的。
在本发明的一些实施方案中，探针-序列-寡核苷酸、标记-载体-寡核苷酸和适配子-寡核苷酸是单链核酸分子，优选RNA和/或DNA。此外，所有核酸分子均可含有非天然或修饰的核酸残基，诸如O-甲基修饰的残基。然而，特别优选的是DNA寡核苷酸，其更容易且更廉价合成。
在一些实施方案中，优选的是探针-序列-寡核苷酸不包含多核苷酸的3’末端OH基团和/或5’末端磷酸基团的修饰，特别优选的是探针-序列-寡核苷酸不包含末端胺基团。在本发明的上下文中，可能的是，探针-序列-寡核苷酸是根据现有技术的寡核苷酸合成程序化学合成的。此类程序通常包括使用掩蔽或封闭基团，其优选在将探针-序列-寡核苷酸应用于本发明的方法之前全部去除。此外，寡核苷酸的合成通常产生5’末端OH基团。在一些实施方案中，当标记-载体-寡核苷酸与探针-序列-寡核苷酸的5’末端连接时，有必要连接末端5’磷酸基团以允许连接反应。
在一些实施方案中，优选的是标记-载体-寡核苷酸包含优选至少一个，在其他实施方案中，两个或更多个，优选三个、四个或五个标记部分或其他功能部分。
然而，在更优选的实施方案中，标记-载体-寡核苷酸仅包含一个或不超过两个或三个这样的标记部分或其他功能部分。根据本发明，可以通过使用多个标记-载体-寡核苷酸用多个标记对每个探针-序列-寡核苷酸进行标记，所述多个标记-载体-寡核苷酸通过本发明的方法与所述探针-序列-寡核苷酸全部串联连接。然后，用不同的标记或修饰来标记所述多个标记-载体-寡核苷酸中的每个标记-载体-寡核苷酸。该实施方案允许同时探测诸如细胞中的mRNA物质的多种靶序列。
标记-载体-寡核苷酸可具有适合与探针-序列-寡核苷酸连接的任何长度。本发明的一些优选的标记-载体-寡核苷酸的长度为5至200个核苷酸，优选5至100个核苷酸，更优选5至30个核苷酸，或8至20个核苷酸，更优选约15个核苷酸。在优选的实施方案中，标记-载体-寡核苷酸的序列应允许预定的标签核苷酸序列与相应的适配子序列的特异性结合。
在一个优选的实施方案中，标记-载体-寡核苷酸包含5’(游离的)磷酸基团，以允许酶催化与探针-序列-寡核苷酸的连接。在另一个实施方案中，标记-载体-寡核苷酸包含3’末端的末端OH基团(探针-序列-寡核苷酸的标记在5’末端进行的情况下)。
术语“适配子-寡核苷酸”通常是指以串联排列的方式包含至少两个，优选更多个适配子序列的寡核苷酸，所述适配子序列与探针-序列-寡核苷酸和标记-载体-寡核苷酸中预定的标签核苷酸序列互补。因此，适配子序列也是预定的。在一些实施方案中，探针-序列寡核苷酸中预定的标签核苷酸序列和也是通过互补对应的适配子序列的序列，以及每个标记-载体-寡核苷酸彼此不同。在其中3’末端进行探针-序列-寡核苷酸标记的实施方案中，适配子-寡核苷酸从其3’末端至5’末端以连续顺序包含第一个适配子序列，然后是第二个适配子序列。如果使用另外的标记-载体-寡核苷酸，则将适配子序列连续添加到适配子-寡核苷酸的3’末端(第三、第四、第五等)。如果在探针-序列-寡核苷酸的5’末端上进行标记，则该顺序为5’到3’。通过这种方式，当在杂交条件下接触时，探针-序列-寡核苷酸、所有标记-载体-寡核苷酸和适配子-寡核苷酸形成双链复合物，其中由探针-序列-寡核苷酸和所有标记-载体-寡核苷酸组成的链在每个单独的寡核苷酸之间包含可连接的“切口”。可连接的切口是两个寡核苷酸之间的缺口，该缺口足够窄，以允许3’OH和5’磷酸基团参与酶催化的连接酶反应以形成共价键，从而形成磷酸二酯骨架。在一些实施方案中，适配子-寡核苷酸的3’末端和5’末端可以被修饰，使得它们不能参与连接反应以避免在连接过程中产生任何不需要的副产物。
适配子-寡核苷酸优选包含两个或更多个适配子序列，每个适配子序列具有至少3个、优选4个、5个、6个、7个、8个或更多个核酸位置，优选8至20个、10至20个、12至18个，更优选约15个核酸位置。在一些实施方案中，每个适配子序列由与相应预定的标签核苷酸序列反向互补(当从5’至3’看时)的序列组成。选择适配子-寡核苷酸的适配子序列与标记-载体-寡核苷酸或探针-序列-寡核苷酸的相应预定的标签核苷酸序列之间的互补程度，以允许两个序列在适合于进行连接的条件下的稳定杂交。在此背景下，反向互补程度优选为至少90％，最优选95％或100％。
在优选的实施方案中，除前面所述的之外，适配子-寡核苷酸在3’末端和/或5’末端不包含简并悬突，优选不在形成复合物时能够与探针序列-寡核苷酸中的探针序列杂交的末端。
在一些实施方案中，本发明的方法还可以包括纯化探针-序列-寡核苷酸和标记-载体-寡核苷酸(s)的连接产物的步骤。连接产物形成标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针，因此形成本发明方法中的产物。纯化可以通过本领域技术人员已知的用于纯化核酸探针的任何方法进行，并且包括但不限于经由凝胶电泳的纯化，如PAGE。最优选地，首先纯化单链连接的产物，随后在第二步中再次与适配子-寡核苷酸杂交，以在使用之前稳定探针。
如本文所用的术语“连接酶”是指一种通常用于将多核苷酸连接在一起或连接单个多核苷酸的末端的酶。本发明的连接酶优选选自ATP依赖性双链多核苷酸连接酶、NAD+-依赖性双链DNA或RNA连接酶和单链多核苷酸连接酶，并且优选选自细菌连接酶，诸如大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶、热稳定性DNA连接酶、噬菌体连接酶，诸如T3DNA连接酶、T4DNA连接酶、T7DNA连接酶及其突变体，包括含有DNA结合结构域和连接酶的融合连接酶，诸如Sso7-T3DNA连接酶、Sso7-T4DNA连接酶、Sso7-T7DNA连接酶、Sso7-TaqDNA连接酶、Sso7-大肠杆菌DNA连接酶、Sso7-Ampligase、DNA连接酶Sso7、T4RNA连接酶1、T4RNA连接酶2以及T4截短和突变(K227Q)RNA连接酶。最优选是使用T4DNA连接酶，因为这种酶是稳健、廉价和有效的。
术语“靶标”是指一种可以在空间上分离，与探针杂交并可视化的生物实体。沉积在阵列中的细胞、单个染色体和材料是靶标的实例。在本发明的上下文中，靶核酸是靶标单链核酸，其包含具有至少一个，优选多个通过本发明的方法产生的核酸探针的结合区的序列。在优选的实施方案中，靶核酸是信使RNA(mRNA)。
在本发明的上下文中，标记是可以直接或间接地产生信号的可检测部分。直接产生信号的可检测部分的一个实例是荧光分子。间接产生信号的可检测部分包括在暴露于检测试剂诸如底物或抗体等时产生信号的部分。直接产生信号的可检测部分可任选地通过间接手段检测，诸如通过使用结合该部分的标记的抗体。在某些情况下，信号可以具有可通过光检测器(如光学显微镜、分光光度计、荧光显微镜、荧光样品读取器或荧光激活细胞分选仪等)检测的特定波长。在本发明的上下文中，标记部分可以是允许检测该部分是否存在的任何部分。合适的标记包括荧光染料，其包括呫吨染料，如荧光素和罗丹明染料，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(通常以缩写FAM和F表示)、6-羧基-2′,4′,7′,4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)和罗丹明110；花青染料，如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，如伞形酮；苯甲酰亚胺染料，如Hoechst 33258；菲啶染料，如德克萨斯红；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料，如花青染料，诸如Cy3、Cy5等；BODIPY染料和喹啉染料。在一些应用中常用的具体目标荧光团包括：芘、香豆素、二乙基氨基香豆素、FAM、荧光素氯三嗪基、R110、曙红、JOE、R6G、四甲基罗丹明、TAMRA、丽丝胺、ROX、萘基荧光素、德克萨斯红、萘基荧光素、Cy3和Cy5等。可用于主题方法的合适的可区分的荧光标记对包括Cy-3和Cy-5(Amersham Inc.,Piscataway,N.J.)、Quasar 570和Quasar 670(BiosearchTechnology,Novato Calif.)，优选以下四种Alexa染料：Alexa fluor 488、Alexa fluor555、Alexa fluor 594和Alexa fluor 647(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)；Atto染料:Atto488、Atto565、Atto594、Atto647N、Atto750(Atto-Tec GmbH)；BODIPY V-1002和BODIPYV1005(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)、POPO-3和TOTO-3(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)和POPRO3TOPRO3(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)。其他合适的可区分的可检测标记可以在Kricka等人(Ann Clin Biochem.39:114-29,2002)中找到。
短语“可区分的标记”或“不同颜色的标记”或其任何语法等同物是指可以独立地检测和测量的标记，即使标记是混合的亦如此。换句话说，即使当标记共同定位(如，在同一个管中或在同一个双链体分子中或在同一个细胞中)时，每个标记的标记存在量(如，荧光量)也是可以单独确定的。上述标记可用作可区分的标记。一些优选的可区分的荧光标记对包括Cy-3和Cy-5(Amersham Inc.,Piscataway,N.J.)、Quasar570和Quasar 670(BiosearchTechnology,Novato Calif.)、Alexafluor555和Alexafluor647(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)、BODIPY V-1002和BODIPY V1005(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)、POPO-3和TOTO-3(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)及POPRO3和TOPRO3(MolecularProbes,Eugene,Oreg.)，并且优选FAM和ATTO550。其他合适的可区分的可检测标记可以在Kricka等人(Ann Clin Biochem.39:114-29,2002)中找到。
术语“预定”是指在使用前已知的东西。
优选地，待用于本发明方法中的探针-序列-寡核苷酸的长度为20至300个核苷酸。取决于根据本发明产生的探针检测哪种靶核酸，选择探针的长度。虽然对于smFISH探针的应用，探针的长度选择为低于500个碱基，但是其他应用可能需要使用较长的核酸探针。由于探针序列的长度对于标记过程并不重要，因此本发明不限于任何具体长度。然而，优选的是用于smFISH中的探针序列。在探针-序列-寡核苷酸中，预定的标签核苷酸序列的长度为至少5个核酸，优选6个、7个、8个、9个、10个或15个或更多个，更优选5至50个、5至20个，更优选10至20个、12至18个，最优选约15个核酸。
此外，该问题通过用于生成单分子荧光原位杂交(smFISH)探针文库的方法来解决，该方法包括根据上述公开发明的标记方法产生至少两种荧光标记的寡核苷酸探针，其中至少两种荧光寡核苷酸探针能够结合一种靶核酸。
本发明的一些实施方案涉及上述文库生成方法，其中至少两种荧光标记的寡核苷酸探针能够在不同的，优选非重叠位置(序列)结合一种靶核酸。在本发明的文库中，至少两种荧光标记的寡核苷酸探针是至少10，优选至少30，更优选30至150，且最优选约100种荧光标记的寡核苷酸探针，并且其中所述荧光标记的寡核苷酸探针中的每一种能够结合优选非重叠位置的一种靶核酸。
在该方面的一些优选实施方案中，文库中至少两种荧光标记的寡核苷酸探针中的至少两种用多个标记部分标记，然而，优选其中文库中每种标记的寡核苷酸探针包含相同的标记或相同的标记组合。在本发明的上下文中，核酸探针的文库应表示用于探测和检测一种核酸分子，例如smFISH方法中的一种mRNA，的一组探针。
在本发明的另一方面，提供了用于探测细胞中信使核糖核酸分子(mRNA)的靶序列的方法，所述靶序列包括多个非重叠的探针结合区，所述方法包括将所述细胞浸入过量的至少两种寡核苷酸探针中，其中每种寡核苷酸探针用至少两种不同颜色的荧光标记的相同组合进行多重标记，并且每种含有与所述靶序列的不同探针结合区互补的核酸序列；洗涤所述固定细胞以去除未结合的探针；以及检测来自所述探针的荧光。
在本发明的上下文中，不同颜色的荧光标记是具有不同激发和/或信号波长的荧光部分，因此允许单独检测。
本发明的另一方面还涉及同时探测细胞中信使核糖核酸分子(mRNA)的至少两条靶序列的方法，所述靶序列各自包括多个非重叠的探针结合区，所述方法包括将所述细胞浸入过量的探针组中，一个探针组针对每种靶序列，其中每个探针组包括至少两种寡核苷酸探针，并且探针组中的每种寡核苷酸探针用至少两种不同颜色的荧光标记的相同组合进行多重标记，以为每种靶序列提供彩色条形码，并且其中不同颜色荧光标记的组合在每个探针组之间是不同的，并且其中探针组中的每种寡核苷酸探针含有与所述靶序列的不同探针结合区互补的核酸序列；洗涤所述固定细胞以去除未结合的探针；以及检测来自所述探针的荧光。
在本发明的上下文中，细胞优选是固定和渗透化的细胞。
在这方面，“寡核苷酸探针”优选根据上文所公开的本发明的标记方法制备。
在一些实施方案中，靶mRNA和探针中的探针结合区的数量可以为40至60。在其他实施方案中，至少30种探针具有靶标-互补序列，所述靶标-互补序列的长度为7-40个核苷酸，最优选15-30个核苷酸。
每个探针可以以每微升0.2-10纳克的浓度添加到细胞中。
固定细胞优选通过甲醛固定制备。
检测优选包括使用宽视场荧光显微镜成像。
此外，提供了用于标记寡核苷酸探针的标记试剂盒，所述试剂盒包含第一标记-载体-寡核苷酸和第二标记-载体-寡核苷酸、任选地第三或更多个标记-载体-寡核苷酸以及适配子-寡核苷酸，其中所述第一标记-载体-寡核苷酸具有与第二适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列，所述第二标记-载体-寡核苷酸具有与第三适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列，任选地，所述第三或更多个标记-载体-寡核苷酸具有与第四或更多个适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列；所述适配子-寡核苷酸包含直接序列第一适配子核苷酸序列、第二适配子核苷酸序列、第三适配子核苷酸序列、任选地第四或更多个适配子核苷酸序列，其中所述第一适配子核苷酸序列与探针-序列-寡核苷酸(或寡核苷酸探针)中预定的标签核苷酸序列互补。
本发明的标记试剂盒还可以包含连接酶，任选地与缓冲液或试剂一起使用。优选的连接酶如上文所述。
本发明的标记试剂盒还可以包含其使用说明。
现在将参考附图和序列在以下实施例中进一步描述本发明，但本发明不限于此。出于本发明的目的，本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入。在图中：
图1：基于本发明的多重荧光团标记。(a)基于多路(multiple-way)连接的荧光团标记。(b)用本发明制备的且与适配子-寡核苷酸预退火以避免多色荧光猝灭的探针进行原位染色。(c)在没有适配子-寡核苷酸稳定化的情况下，用缀合有Atto488、Atto565和Atto647N的Gapdh FISH探针在Hepa 1-6中表达Gapdh，。(d)通过(c)中适配子-寡核苷酸预退火探针将Gapdh mRNA可视化为单独的点。
图2：用于体内检测小鼠胚胎脑中发育基因的FISH 3色组合条形码。(a)来自3种基色的FISH的颜色编码方案。(b)E12.5小鼠胚胎脑室区中7种基因的检测-比例尺5μm。(c)这7种发育基因的mRNA转录物定量。
实施例
在先前的专利申请EP 16190862.9(通过引用并入本文)中，T4DNA连接酶(T4DL)已用于有效和划算地产生用于smFISH的荧光标记探针。然而，由于荧光预标记的寡核苷酸的化学性质，通过现有技术的寡核苷酸合成和标记技术，存在与产生多个荧光团标记的寡核苷酸有关的渐增的困难和成本。针对成本效益和解决技术难题，已经开发出先前方法的替代版本。本发明的方法背后的基本原理是利用T4DL(T4DNA连接酶)或其他dsDNA连接酶如T7DNA连接酶的多路连接能力。用常见的预定的标签核苷酸序列和单/多种荧光标记的寡核苷酸(标记-载体-寡核苷酸)以及适配子-寡核苷酸合成未标记的smFISH寡核苷酸汇集物。在一锅法连接反应后，将smFISH探针与3-荧光寡核苷酸缀合(从5至3端)，如图1A所示。各个标记之间的间隔为约15个核苷酸。
在通过适配子寡核苷酸稳定化的情况下，可以在针对用一个拷贝的Atto488、Atto565和Atto647N标记的Gapdh探针的所有3个通道中获得单独清晰的点(图1c和1d)。利用该方法的多重标记能力，本申请的发明人可以将各种颜色组合分配给一组基因，并通过计数它们在通道中的出现来解码这些点。smFISH的进化的多重荧光团标记能力使用自主的组合彩色条形码机制扩展了常规smFISH。每种颜色组合与单独的探针共价连接，因此荧光团化学计量在探针之间保持不变。在图像采集过程中，荧光团之间的强度比将与FISH点的亮度无关。条形码容量仅随通道(荧光团选择)数目n(组合的理论数目是所有颜色组合的总和，为2n-1)的指数而增加。如果FISH点成像足够准确，并且可以确定每个通道中的最大强度之间的相对比率，则组合可以更高。
smFISH最受关注的应用之一是在组织样品中探索多基因表达模式。只用3种基色，颜色组合可以用于在一轮杂交中检测7种基因。在此，本申请的发明人使用胎龄12.5天(E12.5)的小鼠胚胎冷冻切片样品使7种发育相关基因的组织异质性可视化(图2a)。同时7种基因检测显示了发育基因表达的细胞组织模式(图2b)。分层聚类显示了具有不同程度的干细胞标志物表达的4个簇(图2c)。
方法
细胞培养物和组织切片制备
从8周成年雄性C57BL/6J小鼠脑的脑室下区来分离小鼠原代神经干细胞(NSC)。将分离的组织块进一步切碎成1mm3大小，并用Accutase溶液(Sigma，A6964)在37℃下消化20分钟。将细胞在250g离心5分钟，然后在补充有以下组分的无血清培养基(DMEM/F-12HEPES)(ThermoFisher，31330095)中重悬浮并培养：0.6％葡萄糖、20mM HEPES(1M原液，Sigma，H0887)、0.2mM孕酮、0.06mM腐胺、2％B27、20ng/mL EGF、10ng/mL FGF、0.1％ITSS、1×青霉素/链霉素、0.36U/ml肝素(Sigma，H3149)、1.2％(w/v)NaHCO3)。对于包被板或盖玻片上的NSC培养，在37℃下，将板或盖玻片包被在补充有mg/ml多聚-L-赖氨酸(Sigma，P7280)、0.0025mg/mL层粘连蛋白(Roche，11243217001)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中过夜，然后在具有UV辐射的细胞培养罩中干燥。将小鼠Hepa 1-6细胞在含有10％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养。Hepa 1-6细胞直接在无包被的盖玻片上生长。胚胎小鼠脑组织冷冻切片是将包埋在组织-Tek O.C.T(Sakura，4583)中的胎龄12.5天的C57BL/6J小鼠胚胎切成6μm至10μm而成。
涂布的NSC细胞、Hepa 1-6贴壁细胞或冷冻切片用含4％甲醛的PBS固定10分钟，然后在室温下用含135mM甘氨酸的PBS猝灭10分钟。然后用PBS洗涤固定化细胞一次，并在4℃下在70％乙醇中透化过夜。用于FISH相关缓冲液的所有水均经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过。在透化后，将细胞储存于-20℃的冷冻保护剂(25％甘油、25％乙二醇、0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4)中直至FISH染色。
探针设计
基于常规设计的smFISH探针在R脚本中实施，首先用Primer3选择探针，使用Primer3中选择正确引物的标准条件从输入cDNA序列中获得不具有过强二级结构的所有可能的探针。然后选择具有2bp缺口的非重叠的smFISH探针。对于HuluFISH探针，在用于染色的条件下，另外计算来自Primer3的所有探针与R中的DECIPHER包的杂交效率。过滤探针以使杂交效率高于0.9(最大1)，然后如前所述选择非重叠的HuluFISH探针。随机生成适配子序列，并通过UNAfold控制所述适配子序列的强二级结构。将通过的序列针对小于或等于15bp的完全匹配的本地小鼠和人类转录物数据库(Ensemble release 87)进行BLAST检索。
HuluFISH探针标记和纯化
本发明的标记方法表示为“HuluFISH”。
FISH探针寡核苷酸汇集物和适配子寡核苷酸由Sigma合成，具有最低质量的纯化(脱盐)。对于单独的基因，将寡核苷酸合并在一起以具有100μM的总寡核苷酸浓度。荧光寡核苷酸购自Eurofins Genomics，含有各种染料，包括Atto染料、Alexa染料或Cy染料。对于没有另外标签序列的探针标记，在T4DNA连接酶缓冲液(NEB，B0202S)中进行连接，该缓冲液中含有30μM具有简并序列的适配子寡核苷酸、3μM未标记的FISH探针寡核苷酸汇集物和荧光标记寡核苷酸，25％PEG8000、30U/μL T4DNA连接酶(NEB，M0202M)。然后将连接反应在热循环仪上温育，进行37℃，10秒/16℃，5分钟的12个循环。对于用标签序列进行的探针标记，如前所述进行连接，但有一些修改，所述修改如16.7μM的所有寡核苷酸组分和寡核苷酸汇集物、50U/μL T4DNA连接酶。然后将连接混合物在室温下于暗处放置2小时。用9倍体积的丁醇浓缩连接产物，并在4℃下以20,000g离心沉淀15分钟。将彩色标记的寡核苷酸沉淀用100％乙醇洗涤一次并快速离心以去除乙醇，然后再溶解于上样缓冲液(8M尿素、1×TBE(Carl Roth，A118.1)、0.01％溴酚蓝和二甲苯蓝)中。在90℃下变性5分钟，将寡核苷酸上样到15％尿素-PAGE凝胶(8M尿素、1×TBE、15％Rotiphorese凝胶30(Carl Roth，3029.2)、0.05％过硫酸铵、0.05％四甲基乙二胺)中，在300V下预运行30分钟。运行条件通常为300V，30分钟，或直至溴酚蓝达到末端。在环境光下切下具有荧光染料-寡核苷酸缀合物的凝胶条带。通过微管研杵(Sigma，Z359947-100EA)手动匀浆凝胶块，然后用500μL的10mM TE缓冲液(pH 8.5、10mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、1mM乙二胺四乙酸(EDTA))在室温下提取过夜，并用铝箔包裹避光。将TE中提取的寡核苷酸再次通过丁醇浓缩，并如之前的那样用乙醇洗涤一次。将最终的沉淀在室温下在黑暗中干燥5-10分钟，然后再溶解在H2O中。通过NanoDrop One(ThermoFisher)测定ssDNA的浓度。
FISH探针染色和成像
对于杂交缓冲液(2×SSC(盐水柠檬酸钠)、10％硫酸葡聚糖、10％甲酰胺、1mg/mLtRNA(Roche，10109541001)、2mM氧钒核糖核苷复合物(NEB，S1402S)、0.2mg/mL BSA)中的每种单一寡核苷酸，将HuluFISH探针混合物调节至10nM。Gapdh-Quasar570探针购自Biosearch Technology，重悬浮并按照制造商的说明进行染色。杂交在30℃的水浴中进行过夜，石蜡膜上的样品面朝下。在37℃下，用洗涤缓冲液(2×SSC，10％甲酰胺，0.1％吐温-20)洗涤盖玻片上的细胞或载玻片上的组织切片6×10分钟。最后的洗涤步骤包括针对细胞核染色的0.5μg/ml DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)。在ProLong Gold Antifade(ThermoFisher，P10144)中封固样品，并固化过夜。然后将样品在宽视场显微镜(ZeissCell Observer)上成像，对于405nm、488nm和561nm通道，使用200ms、950ms和5000ms；或者在具有Airyscan的共聚焦显微镜(Zeiss LSM800，配备有405nm、488nm、561nm和647nm激光器)上成像，在每个通道中具有最大的激光功率。用具有Zeiss软件提供的最佳设置的Airyscan技术扫描样品。
图像分析
除了在ImageJ中手动定义的细胞核轮廓之外，所有图像分析都在R中进行，并且主要基于EBImage包。所有强度阈值基于由Zeiss Airyscan产生的任意单元，因此在以下描述中未指定。FISH点识别依赖于2D局部最大值识别和对准。最初对于每个帧，鉴定出高于低阈值的2D最大值。每个2D局部最大值将其在相邻z切片上的投影视为对准：落在0.08um内的那些被分配给同一FISH点。提取鉴定的FISH点的具有最大强度(伪3D最大值)的像素以用于进一步分析。
针对每个单独的FISH点适应性地生成信噪比(SNR)和对比度。为此，像素值(局部背景)取自以围绕伪3D最大值为中心的正方形，不包括覆盖同一平面上的2D最大值的PSF(点扩散函数)的所有圆形区域。对比度定义为最大强度与其局部背景值的平均值之比；传统上定义的SNR等于最大强度除以局部背景值的标准偏差。
对于具有多种基因的Hulu-探针的样品中的颜色解码，最初分别确定每个通道上存在的荧光团。当来自不同通道的FISH点共定位在0.08μm内时，分配双色或三色编码。鉴于单色Hulu-探针中存在三个荧光团拷贝，单色分配需要具有更高强度的阈值。在ImageJ中的最大强度投影图像上手动分割细胞核。在没有膜免疫染色的帮助下，每个鉴定的FISH点被分配到其最接近的细胞核。
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Claims (13)
1.用于产生标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供探针-序列-寡核苷酸，其包含：(i)探针序列，所述探针序列包含与靶核酸互补的核苷酸序列，以及(ii)与第一适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列；
b.提供标记-载体-寡核苷酸，其包含至少一个标记部分或其他功能部分，其中所述标记-载体-寡核苷酸具有与第二适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列；
c.提供适配子-寡核苷酸，其包含直接序列中的所述第一适配子核苷酸序列和所述第二适配子核苷酸序列；
d.使所述探针-序列-寡核苷酸、所述标记-载体-寡核苷酸和所述适配子-寡核苷酸在杂交条件下接触以形成复合物，其中在所述复合物中，游离的(未封闭的)-OH基团与游离的(未封闭的)磷酸基团在空间上紧密接近；
e.在连接条件下使用连接酶，使所述复合物反应以在3’-OH基团与5’-磷酸基团之间形成共价键，从而形成所述标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针；
f.任选地，去除所述适配子-寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的用于产生标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针的方法，其中，
在所述探针-序列-寡核苷酸中，所述探针序列是所述预定的标签核苷酸序列的5’，并且
在所述适配子-寡核苷酸中，所述第一适配子核苷酸序列和所述第二适配子核苷酸序列在直接序列中按照3’至5’方向，并且，
在步骤(d)中的所述复合物中，所述探针-序列-寡核苷酸的游离的3’OH基团与所述标记-载体-寡核苷酸的游离的(未封闭的)磷酸基团在空间上紧密接近。
3.根据权利要求1所述的用于产生标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针的方法，其中，
在所述探针-序列-寡核苷酸中，所述探针序列是所述预定的标签核苷酸序列的3’，并且
在所述适配子-寡核苷酸中，所述第一适配子核苷酸序列和所述第二适配子核苷酸序列在直接序列中按照5’至3’方向，并且，
在步骤(d)中的所述复合物中，所述探针-序列-寡核苷酸的游离的(未封闭的)磷酸基团与所述标记-载体-寡核苷酸的游离的3’OH基团在空间上紧密接近。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于产生标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针的方法，其中，步骤(b)包括：提供第一标记-载体-寡核苷酸和第二标记-载体-寡核苷酸、任选地第三标记-载体-寡核苷酸或更多个标记-载体-寡核苷酸，其中所述第一标记-载体-寡核苷酸具有与第二适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列，所述第二标记-载体-寡核苷酸具有与第三适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列，任选地，所述第三或更多个标记-载体-寡核苷酸具有与第四或更多个适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列，并且其中在步骤(c)中，所述适配子-寡核苷酸包含直接序列中的所述第一适配子核苷酸序列、所述第二适配子核苷酸序列、所述第三适配子核苷酸序列、任选地所述第四适配子核苷酸序列或更多个适配子核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述适配子核苷酸序列中的每一个包含不同的核苷酸序列。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述标记-载体-寡核苷酸中的每一个被不同地标记或以其他方式修饰。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标记-载体-寡核苷酸包含两个或更多个，优选三个、四个或五个标记部分。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述两个或更多个，优选三个、四个或五个标记部分包括至少两个或更多个不同的标记部分或其他功能部分。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括纯化所述探针-序列-寡核苷酸和标记-载体-寡核苷酸的连接产物。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述探针-序列-寡核苷酸的长度为20至300个核苷酸。
11.用于生成单分子荧光原位杂交(smFISH)探针文库的方法，其包括根据权利要求1至10中任一项所述的方法产生至少两种荧光标记的寡核苷酸探针，其中所述至少两种荧光寡核苷酸探针能够结合一种靶核酸。
12.根据权利要求11所述方法，其中所述至少两种荧光标记的寡核苷酸探针是至少10种、优选至少30种、更优选30种至150种且最优选约100种荧光标记的寡核苷酸探针，并且其中所述荧光标记的寡核苷酸探针中的每一种能够结合所述一种靶核酸。
13.试剂盒，其包含第一标记-载体-寡核苷酸和第二标记-载体-寡核苷酸、任选地第三或更多个标记-载体-寡核苷酸以及适配子-寡核苷酸，其中所述第一标记-载体-寡核苷酸具有与第二适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列，所述第二标记-载体-寡核苷酸具有与第三适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列，任选地，所述第三或更多个标记-载体-寡核苷酸具有与第四或更多个适配子核苷酸序列互补的预定的标签核苷酸序列；所述适配子-寡核苷酸包含直接序列中的第一适配子核苷酸序列、第二适配子核苷酸序列、第三适配子核苷酸序列、任选地第四或更多个适配子核苷酸序列，其中所述第一适配子核苷酸序列与探针-序列-寡核苷酸(或寡核苷酸探针)中预定的标签核苷酸序列互补。
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