CN110050072B - 用于标记寡核苷酸探针的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于标记核酸探针的新型方法。所述方法使用连接酶催化的反应将核酸探针与预先制备的核酸标记载体分子在稳定互补的夹板寡核苷酸的存在下连接。所述方法允许用多种不同标记对多个探针进行简单、廉价和快速的标记。通过这种方式，显著降低了生成单分子荧光原位杂交(smFISH)测定的成本和投入。本发明还提供了用于生成包括本发明新型工具的FISH文库和标记试剂盒的方法。

Description

用于标记寡核苷酸探针的方法
发明领域
本发明提供了用于标记核酸探针的新型方法。该方法使用连接酶催化的反应将核酸探针与预先制备的核酸标记载体分子在稳定互补的夹板寡核苷酸的存在下连接。该方法允许用多种不同标记对多个探针进行简单、廉价和快速的标记。通过这种方式，显著降低了生成单分子荧光原位杂交(smFISH)测定的成本和投入。本发明还提供了用于生成包括本发明新型工具的FISH文库和标记试剂盒的方法。
描述
自从40多年前Joseph G.Gall和Mary-Lou Pardue发明原位杂交(ISH)以来，这种强大的技术极大地改变了用于生物标志物检测的基础研究(即基因表达等)和诊断。只有通过ISH，研究人员才能够研究基因表达，并利用空间信息诊断生物标志物水平。如今，ISH及其衍生物已经成为包括组织学、单细胞生物学等在内的各领域中的主力。甚至有一些组学规模的努力试图拥有一个完整的基因表达图谱，如基于ISH的艾伦脑图谱(Allen BrainAtlas)。随着荧光团化学和显微术硬件的发展，荧光原位杂交(FISH)由于其优异的低背景和纳米级空间定位信号(相对于ISH的酶促反应产生的扩散信号)而受到更多的关注，并且其可以用作ISH的良好替代品，特别是在需要对生物标志物进行数字和时空量化的精密医学的未来应用中。
自90年代以来，Robert Singer及其同事将FISH创新性地用于对单个分子水平的单独mRNA转录物进行原位成像(smFISH)，从那时起基因表达或生物标志物检测能够以数字和单分子方式进行(图1)。然而，第一探针文库是由五种基因特异性不同的定制合成的五荧光团标记的寡核苷酸制成的，其现在仍然非常昂贵，这使这一强大的发明不适用于每种基因。从2008年开始，Ariun及其同事发明了一种基于经典EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐)共轭化学的汇集单荧光团标记方法，这大大降低了探针文库的成本。并且，该新型标记现已获得Biosearch Technologies公司的许可，因此科研用户和临床用户可以以100-400个反应约760欧元的价格使用这种技术。使用商业FISH探针文库的这一特别高的成本以及它的低通量是smFISH的根本限制，通常smFISH方法允许一次只探测一些基因。这种低通量是由于缺乏用于标记细胞的分辨探针以及产生高效染色所需的大量标记探针的成本导致的。因此，smFISH探针生成的改进和提高检测效率是必要的。
在描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方案，并且因此当然可以改变。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制，这是因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
本申请说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指出通过引用并入一样，并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是针对其在提交日期之前的公开内容，并且不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于这些出版物。此外，提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要独立地确认。
上述问题通过用于产生标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针的方法解决，所述方法包括以下步骤：
a.提供探针-序列-寡核苷酸，其包含与靶核酸互补的核苷酸序列，
b.提供标记-载体-寡核苷酸，其包含至少一个标记部分或其他功能部分，其中所述标记-载体-寡核苷酸具有预定的核苷酸序列，
c.提供互补-夹板-寡核苷酸，所述互补-夹板-寡核苷酸包含：(i)反向互补区，其具有与所述标记-载体-寡核苷酸的序列反向互补的序列，和(ii)随机序列区，其包含随机核苷酸序列；
d.使所述探针-序列-寡核苷酸、标记-载体-寡核苷酸和所述互补-夹板-寡核苷酸在杂交条件下接触以形成复合物，其中在所述复合物中，游离的(未封闭的)-OH基团与游离的(未封闭的)磷酸基团在空间上紧密接近，
e.在连接条件下使用连接酶使所述复合物反应以在3’-OH基团和5’-磷酸基团之间形成共价键，从而形成所述标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针(“连接产物”)，
f.任选地，去除所述互补-夹板-寡核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，标记-载体-寡核苷酸与探针-序列-寡核苷酸的3’末端连接。在该实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a.提供探针-序列-寡核苷酸，其包含与靶核酸互补的核苷酸序列并且在3’末端具有游离的(未封闭的)-OH基团，
b.提供标记-载体-寡核苷酸，其包含至少一个标记部分或其他功能部分，其中所述标记-载体-寡核苷酸具有预定的核苷酸序列并且在5’末端具有游离的(未封闭的)磷酸基团，
c.提供互补-夹板-寡核苷酸，其包含以5’至3’方向具有以下的序列：(i)反向互补区，其包含与所述标记-载体-寡核苷酸的序列反向互补的序列；和(ii)随机序列区，其包含随机核苷酸序列，任选地其中所述互补-夹板-寡核苷酸包含3’-末端封闭基团，
d.使所述探针-序列-寡核苷酸、标记-载体-寡核苷酸和所述互补-夹板-寡核苷酸在杂交条件下接触以形成复合物，其中在所述复合物中，在所述探针-序列-寡核苷酸的3’末端的游离的(未封闭的)-OH基团与在所述标记-载体-寡核苷酸的5’末端的游离的(未封闭的)磷酸基团在空间上紧密接近，
e.在连接条件下使用连接酶使所述复合物反应以在所述探针-序列-寡核苷酸的3’末端和所述标记-载体-寡核苷酸的5’-末端之间形成共价键，从而形成所述标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针，
f.任选地，去除所述互补-夹板-寡核苷酸。
在本发明的另一个实施方案中，标记-载体-寡核苷酸与探针-序列-寡核苷酸的5′末端连接。在该实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a.提供探针-序列-寡核苷酸，其包含与靶核酸互补的核苷酸序列，在5’末端具有游离的(未封闭的)-磷酸基团，
b.提供标记-载体-寡核苷酸，其包含至少一个标记部分或其他功能部分，其中所述标记-载体-寡核苷酸具有预定的核苷酸序列并且在3’末端具有游离的(未封闭的)-OH基团，
c.提供互补-夹板-寡核苷酸，其包含以3’至5’方向具有以下的序列：(i)反向互补区，其包含与所述标记-载体-寡核苷酸的序列反向互补的序列；和(ii)随机序列区，其包含随机核苷酸序列，并且其中所述互补-夹板-寡核苷酸包含3’-末端封闭基团，
d.使所述探针-序列-寡核苷酸、标记-载体-寡核苷酸和所述互补-夹板-寡核苷酸在杂交条件下接触以形成复合物，其中在所述复合物中，在所述标记-载体-寡核苷酸的3’末端的游离的(未封闭的)-OH基团与在所述探针-序列-寡核苷酸的5’末端的游离的(未封闭的)磷酸基团在空间上紧密接近，
e.在连接条件下使用连接酶在所述探针-序列-寡核苷酸的5’-末端和所述标记-载体-寡核苷酸的3’末端之间形成共价键，从而形成所述标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针，
f.任选地，去除所述互补-夹板-寡核苷酸。
本发明的方法和化合物允许快速、廉价和容易地标记核酸探针。本发明的构想是提供一种系统，该系统允许从业者推迟标记任何给定的寡核苷酸探针(探针-序列-寡核苷酸)，而无需将标记-部分连接至单独的探针序列-这是昂贵的，并因此损害了许多标记的单独探针文库的生成。为此，本发明现在提供了一种系统，其包含一种或多种预先制备的携带标记的寡核苷酸，可能选择各自具有不同标记或其它修饰或其组合的携带标记的寡核苷酸，以根据探针使用进行选择。使用根据本发明的互补-夹板-寡核苷酸，将这些标记载体仅仅与探针寡核苷酸连接，以获得标记的探针产物。由于可以标记大量相同的携带标记的寡核苷酸，然后其可以在简单且廉价的连接反应中使用，因此成本显著降低。
在本发明的上下文中，当提及具体的寡核苷酸、或探针、或提及描述核酸的其他表述时，技术人员将认识到该表述不是指单个分子，而是指单一种类的分子。在实验室的实际应用中，技术人员使用一种例如一条寡核苷酸序列的众多分子的制剂。在这样的分子群中，通常所有核苷酸都是相同的，除了例如在寡核苷酸合成期间产生包含随机序列区的寡核苷酸。这可以通过将寡核苷酸与多于一种类型的核苷酸的均匀混合物聚合，然后将其偶然偶联来实现。在这种情况下，混合物中的寡核苷酸的种类含有“简并”序列。
术语“核苷”和“核苷酸”旨在包括那些不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，而且还含有已经被修饰的其他杂环碱基的部分。此类修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其他杂环。此外，术语“核苷酸”包括那些含有半抗原或荧光标记，并且不仅可以含有常规的核糖和脱氧核糖，而且还可以含有其他糖的部分。修饰的核苷或核苷酸还包含对糖部分的修饰，如其中一个或多个羟基基团被卤素原子或脂族基团替换，被官能化为醚、胺等。
术语“核酸”是指由核苷酸如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的任何长度，如大于约2个碱基、大于约10个碱基、大于约100个碱基、大于约500个碱基、大于1000个碱基、多达约10,000个或更多个(如，100,000,000个或更多个)碱基的聚合物，并且可以酶促或合成产生，其可以与天然存在的核酸以与两条天然存在的核酸类似的序列特异性方式杂交，如可以参与Watson-Crick碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶/尿嘧啶(分别为G、C、A和T/U)。
如本文所用的术语“寡核苷酸”表示约2至约500个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以是合成的，或可以酶促制备。寡核苷酸可含有核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)、脱氧核糖核苷酸单体或这两者的组合。寡核苷酸的长度可以是10至20、11至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150、150至200或200-250或多达500个核苷酸。
术语“杂交”是指经由Watson-Crick碱基配对进行的核酸与互补核酸的特异性结合。因此，术语“原位杂交”是指核酸与细胞内或完整染色体中的互补核酸的特异性结合。关于核酸，术语“杂交”和“结合”可互换使用。
术语“杂交条件”意指足以允许至少一部分互补序列彼此退火的时间、温度和pH，以及反应物和试剂的必要量和浓度的那些条件。如本领域众所周知的，实现杂交所需的时间、温度和pH条件取决于待杂交的寡核苷酸分子的大小、待杂交的寡核苷酸之间的互补程度以及杂交反应混合物、盐等中其他材料的存在。每个杂交步骤所必需的实际条件是本领域众所周知的，或者无需过多实验即可确定。
如本文所用的术语“原位杂交条件”是指允许核酸与细胞中的互补核酸，如，RNA或DNA分子中核苷酸的序列和互补寡核苷酸，杂交的条件。合适的原位杂交条件可包括杂交条件和任选的洗涤条件两者，所述条件包括温度、变性试剂的浓度、盐、孵育时间等。此类条件是本领域已知的。
短语“随机核苷酸序列”是指变化的核苷酸序列，当与多核苷酸群体中的其他随机核苷酸序列组合时，其表示对于给定长度的核苷酸，核苷酸的所有或基本上所有可能的组合。例如，由于在任何给定位置处存在四种可能的核苷酸，长度为两个随机核苷酸的序列具有16种可能的组合，长度为三个随机核苷酸的序列具有64种可能的组合，或者长度为四个随机核苷酸的序列有265种可能的组合。因此，当用于指代本发明的方法时，随机核苷酸序列具有与样品中的任何靶多核苷酸杂交的潜力。在优选的实施方案中，随机序列包含约25％的每种核苷酸类型(腺嘌呤、胸腺嘧啶/尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤)。此类序列区段也被称为“简并的”。
在本发明的一些实施方案中，探针-序列-寡核苷酸、标记-载体-寡核苷酸和互补-夹板-寡核苷酸是单链核酸分子，优选RNA和/或DNA。此外，所有核酸分子均可含有非天然或修饰的核酸残基，诸如O-甲基修饰的残基。然而，特别优选的是DNA寡核苷酸，其更容易且更廉价合成。
在一些实施方案中，优选的是探针-序列-寡核苷酸不包含多核苷酸的3’末端OH基团和/或5’末端磷酸基团的修饰，特别优选的是探针-序列-寡核苷酸不包含末端胺基团。在本发明的上下文中，可能的是，探针-序列-寡核苷酸是根据现有技术的寡核苷酸合成程序化学合成的。此类程序通常包括使用掩蔽或封闭基团，其优选在将探针-序列-寡核苷酸应用于本发明的方法之前全部去除。此外，寡核苷酸的合成通常产生5’末端OH基团。在一些实施方案中，当标记-载体-寡核苷酸与探针-序列-寡核苷酸的5’末端连接时，有必要连接末端5’磷酸基团以允许连接反应。
在一些实施方案中，优选的是标记-载体-寡核苷酸包含两个或更多个，优选三个、四个或五个标记部分或其他功能部分。最优选地，多个标记提供独特的标记组合。在该实施方案中，标记-载体-寡核苷酸可以通过多种颜色标记的独特组合加彩色条形码。该实施方案允许同时探测细胞中多种靶序列诸如mRNA种类。
标记-载体-寡核苷酸可具有适合与探针序列寡核苷酸连接的任何长度。本发明的一些优选的标记-载体-寡核苷酸的长度为3至200个核苷酸，优选3至100个核苷酸，更优选3至30个核苷酸，或5至20个核苷酸。标记-载体-寡核苷酸的序列对本发明的标记方法并不重要或并非不利。然而，可能优选的是，基于标记的寡核苷酸探针的后期使用来选择序列，例如以避免经由标记-载体-寡核苷酸序列与非靶序列结合，或允许连接多个标记分子诸如荧光团。
在一个优选的实施方案中，标记-载体-寡核苷酸包含5’(游离)磷酸基团，以允许酶催化与探针-序列-寡核苷酸的连接。在另一个实施方案中，标记-载体-寡核苷酸包含3’末端的末端OH基团。
术语“夹板寡核苷酸”一般是指这样的寡核苷酸，其具有与末端相邻的第一寡核苷酸的区域互补的第一序列的核苷酸，以及与末端相邻的第二寡核苷酸的区域互补的第二序列的核苷酸。夹板寡核苷酸能够结合第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以产生复合物，从而使第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的末端空间接近。通过使第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的末端接近，夹板寡核苷酸增加了第一寡核苷酸和第二寡核苷酸之间连接的机会。第一寡核苷酸和第二寡核苷酸在本上下文中是探针-序列-寡核苷酸和标记载体寡核苷酸。由于对于本申请，探针-序列寡核苷酸的序列是可变的，夹板的互补性通过使用本公开在别处所述的随机(简并)序列来提供。因此，本发明的互补-夹板-寡核苷酸包含(i)反向互补区和(ii)随机序列区，并且区域(i)介导与标记-载体-寡核苷酸的杂交，以及区域(ii)介导与探针-序列-寡核苷酸的杂交。在一些优选的实施方案中，在(i)和(ii)之间不存在核苷酸，这意味着两个区域彼此直接相邻。反向互补区优选位于互补-夹板-寡核苷酸中，使得在标记-载体-寡核苷酸和互补-夹板-寡核苷酸结合/杂交后，反向互补区被置于与待与探针-序列-寡核苷酸连接的标记-载体-寡核苷酸的游离末端直接相邻(如附图所示)。因此，本发明的互补-夹板-寡核苷酸用作“夹板”以将标记-载体-寡核苷酸和探针-序列-核苷酸直接彼此相邻定位，所以它们相应的3’和5’末端可连接。
互补-夹板-寡核苷酸优选包含具有至少3个、优选4个、5个、6个、7个、8个或更多个核酸的反向互补区。在一些实施方案中，反向互补区由与标记-载体-寡核苷酸的序列反向互补的序列组成。甚至更优选，本发明的互补-夹板-寡核苷酸的序列由随机序列区和反向互补区组成。选择互补-夹板-寡核苷酸的反向互补区和标记-载体-寡核苷酸之间的互补程度，以允许在适于进行连接的条件下两个分子稳定杂交。在这个背景下，反向互补程度优选是至少90％，最优选95％或100％。
本发明的优选标记-载体-寡核苷酸和/或互补-夹板-寡核苷酸序列提供于SEQ IDNO：1、2和35中(后者用于携带标记-载体-寡核苷酸的双重标记)。应当理解，实际上用于证明本发明的概念而对标记的位置或性质没有任何限制的序列是优选的。
在一些实施方案中，该方法还可以包括纯化探针-序列-寡核苷酸和标记-载体-寡核苷酸的连接产物的步骤。连接产物形成标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针，因此形成本发明方法中的产物。纯化可以通过本领域技术人员已知的用于纯化核酸探针的方法进行，并且包括但不限于经由凝胶电泳的纯化，诸如PAGE。
在一些实施方案中，该方法还可以包括提供包含与标记-载体-寡核苷酸序列互补的序列的适配子寡核苷酸以及使探针-序列-寡核苷酸和标记-载体-寡核苷酸的连接产物与适配子寡核苷酸在杂交条件下接触以形成稳定的寡核苷酸探针的步骤。当标记-载体-寡核苷酸包含多个标记部分时，该实施方案是优选的。因为多个标记部分可以在单链核酸探针中彼此猝灭，所以可以通过在标记的末端经由使适配子寡核苷酸与连接产物中的标记-载体-寡核苷酸区杂交形成双链区来稳定探针。
如本文所用的术语“连接酶”是指一种通常用于将多核苷酸连接在一起或连接单个多核苷酸的末端的酶。本发明的连接酶优选选自ATP依赖性双链多核苷酸连接酶、NAD+-依赖性双链DNA或RNA连接酶和单链多核苷酸连接酶，并且优选选自细菌连接酶，诸如大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶、热稳定性DNA连接酶、噬菌体连接酶，诸如T3DNA连接酶、T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶及其突变体，包括含有DNA结合结构域和连接酶的融合连接酶，诸如Sso7-T3 DNA连接酶、Sso7-T4 DNA连接酶、Sso7-T7 DNA连接酶、Sso7-TaqDNA连接酶、Sso7-大肠杆菌DNA连接酶、Sso7-Ampligase、DNA连接酶Sso7、T4 RNA连接酶1、T4 RNA连接酶2以及T4截短和突变(K227Q)RNA连接酶。最优选是使用T4 DNA连接酶，因为这种酶是稳健、廉价和有效的。
术语“靶标”是指一种可以在空间上分离，与探针杂交并可视化的生物实体。沉积在阵列中的细胞、单个染色体和材料是靶标的实例。在本发明的上下文中，靶核酸是靶标单链核酸，其包含具有至少一个，优选多个通过本发明的方法产生的核酸探针的结合区的序列。在优选的实施方案中，靶核酸是信使RNA(mRNA)。
在本发明的上下文中，标记是可以直接或间接地产生信号的可检测部分。直接产生信号的可检测部分的一个实例是荧光分子。间接产生信号的可检测部分包括在暴露于检测试剂诸如底物或抗体等时产生信号的部分。直接产生信号的可检测部分可任选地通过间接手段检测，诸如通过使用结合该部分的标记的抗体。在某些情况下，信号可以具有可通过光检测器(如光学显微镜、分光光度计、荧光显微镜、荧光样品读取器或荧光激活细胞分选仪等)检测的特定波长。在本发明的上下文中，标记部分可以是允许检测该部分是否存在的任何部分。合适的标记包括荧光染料，其包括呫吨染料，如荧光素和罗丹明染料，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(通常以缩写FAM和F表示)、6-羧基-2′，4′，7′，4，7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)和罗丹明110；花青染料，如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，如伞形酮；苯甲酰亚胺染料，如Hoechst 33258；菲啶染料，如德克萨斯红；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料，如花青染料，诸如Cy3、Cy5等；BODIPY染料和喹啉染料。在一些应用中常用的具体目标荧光团包括：芘、香豆素、二乙基氨基香豆素、FAM、荧光素氯三嗪基、R110、曙红、JOE、R6G、四甲基罗丹明、TAMRA、丽丝胺、ROX、萘基荧光素、德克萨斯红、萘基荧光素、Cy3和Cy5等。可用于主题方法的合适的可区分的荧光标记对包括Cy-3和Cy-5(Amersham Inc.，Piscataway，N.J.)、Quasar 570和Quasar 670(BiosearchTechnology，Novato Calif.)，优选以下四种Alexa染料：Alexa fluor 488、Alexa fluor555、Alexa fluor 594和Alexa fluor 647(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)；BODIPY V-1002和BODIPY V1005(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)、POPO-3和TOTO-3(MolecularProbes，Eugene，Oreg.)和POPRO3 TOPRO3(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)。其他合适的可区分的可检测标记可以在Kricka等人(Ann Clin Biochem.39：114-29，2002)中找到。
短语“可区分的标记”或“不同颜色的标记”或其任何语法等同物是指可以独立地检测和测量的标记，即使标记是混合的亦如此。换句话说，即使当标记共同定位(如，在同一个管中或在同一个双链体分子中或在同一个细胞中)时，每个标记的标记存在量(如，荧光量)也是可以单独确定的。上述标记可用作可区分的标记。一些优选的可区分的荧光标记对包括Cy-3和Cy-5(Amersham Inc.，Piscataway，N.J.)、Quasar570和Quasar 670(BiosearchTechnology，Novato Calif.)、Alexafluor555和Alexafluor647(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)、BODIPY V-1002和BODIPY V1005(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)、POPO-3和TOTO-3(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)及POPRO3和TOPRO3(MolecularProbes，Eugene，Oreg.)，并且优选FAM和ATTO550。其他合适的可区分的可检测标记可以在Kricka等人(Ann Clin Biochem.39：114-29，2002)中找到。
术语“预定”是指在使用前已知的东西。
优选地，待用于本发明方法中的探针-序列-寡核苷酸的长度为20至300个核苷酸。取决于根据本发明产生的探针检测哪种靶核酸，选择探针的长度。虽然对于smFISH探针的应用，探针的长度选择为低于500个碱基，但是其他应用可能需要使用较长的核酸探针。由于探针序列的长度对于标记过程并不重要，因此本发明不限于任何具体长度。然而，优选的是用于smFISH中的探针序列。
在本发明的上下文中，互补-夹板-寡核苷酸的随机序列区包含简并序列，其意指旨在非特异性地结合探针-序列-寡核苷酸的序列的随机产生的悬突。互补-夹板-寡核苷酸的随机序列区可以由2至10个，优选2至8个，更优选2至6个，且最优选4个核苷酸组成。
在本发明的一些优选的实施方案中，互补-夹板-寡核苷酸的3-’末端被胺(NH2)基团封闭。
此外，该问题通过用于生成单分子荧光原位杂交(smFISH)探针文库的方法来解决，该方法包括根据上述公开发明的标记方法产生至少两种荧光标记的寡核苷酸探针，其中至少两种荧光寡核苷酸探针能够结合一种靶核酸。
本发明的一些实施方案涉及上述文库生成方法，其中至少两种荧光标记的寡核苷酸探针能够在不同的，优选非重叠位置(序列)结合一种靶核酸。在本发明的文库中，至少两种荧光标记的寡核苷酸探针是至少10，优选至少30，更优选30至150，且最优选约100种荧光标记的寡核苷酸探针，并且其中所述荧光标记的寡核苷酸探针中的每一种能够结合优选非重叠位置的一种靶核酸。
在该方面的一些优选实施方案中，文库中至少两种荧光标记的寡核苷酸探针中的至少两种用多个标记部分标记，然而，优选其中文库中每种标记的寡核苷酸探针包含相同的标记或相同的标记组合。在本发明的上下文中，核酸探针的文库应表示用于探测和检测一种核酸分子，例如smFISH方法中的一种mRNA，的一组探针。
在本发明的另一方面，提供了用于探测细胞中信使核糖核酸分子(mRNA)的靶序列的方法，所述靶序列包括多个非重叠的探针结合区，所述方法包括将所述细胞浸入过量的至少两种寡核苷酸探针中，其中每种寡核苷酸探针用至少两种不同颜色的荧光标记的相同组合进行多重标记，并且每种含有与所述靶序列的不同探针结合区互补的核酸序列；洗涤所述固定细胞以去除未结合的探针；以及检测来自所述探针的荧光。
在本发明的上下文中，不同颜色的荧光标记是具有不同激发和/或信号波长的荧光部分，因此允许单独检测。
本发明的另一方面还涉及同时探测细胞中信使核糖核酸分子(mRNA)的至少两条靶序列的方法，所述靶序列各自包括多个非重叠的探针结合区，所述方法包括将所述细胞浸入过量的探针组中，一个探针组针对每种靶序列，其中每个探针组包括至少两种寡核苷酸探针，并且探针组中的每种寡核苷酸探针用至少两种不同颜色的荧光标记的相同组合进行多重标记，以为每种靶序列提供彩色条形码，并且其中不同颜色荧光标记的组合在每个探针组之间是不同的，并且其中探针组中的每种寡核苷酸探针含有与所述靶序列的不同探针结合区互补的核酸序列；洗涤所述固定细胞以去除未结合的探针；以及检测来自所述探针的荧光。
在本发明的上下文中，细胞优选是固定和渗透化的细胞。
在这方面，“寡核苷酸探针”优选根据上文所公开的本发明的标记方法制备。
在一些实施方案中，靶mRNA和探针中的探针结合区的数量可以为40至60。在其他实施方案中，至少30种探针具有靶标-互补序列，所述靶标-互补序列的长度为7-40个核苷酸，最优选15-30个核苷酸。
每个探针可以以每微升0.2-10纳克的浓度添加到细胞中。
固定细胞优选通过甲醛固定制备。
检测优选包括使用宽视场荧光显微镜成像。
此外，提供了用于标记寡核苷酸探针的标记试剂盒，该试剂盒包含标记-载体-寡核苷酸，其包含至少一个标记部分或其他功能部分，其中该标记-载体-寡核苷酸具有预定的核苷酸序列；互补-夹板-寡核苷酸，其包含(i)反向互补区，其具有与所述标记-载体-寡核苷酸的序列反向互补的序列，和(ii)随机序列区，其包含简并核苷酸序列。本发明方法的组成的具体描述同样适用于本发明的标记试剂盒的相应组成。
在某些实施方案中，本发明的标记试剂盒可包含大量不同标记的标记-载体-寡核苷酸。在该实施方案中，标记试剂盒提供了偶联至不同颜色的标记部分的至少两种标记-载体-寡核苷酸。在最优选的实施方案中，标记试剂盒包含多种标记-载体-寡核苷酸，并且每种标记-载体-寡核苷酸都与多个(至少两个)标记部分偶联。在该标记试剂盒中，每种标记-载体-寡核苷酸包含不同的标记组合，诸如单独的颜色组合。这些单独的颜色组合可以用作标记-载体-寡核苷酸的标记条形码，以生成针对多种靶序列的寡核苷酸探针。该标记试剂盒优选用于smFISH方法中以同时探测多种mRNA。
本发明的标记试剂盒还可以包含连接酶，任选地与缓冲液或试剂一起使用。优选的连接酶如上文所述。
在本发明的另一个实施方案中，标记试剂盒还可以包含上文所述的适配子寡核苷酸。
本发明的标记试剂盒还可以包含其使用说明。
现在将参考附图和序列在以下实施例中进一步描述本发明，但本发明不限于此。出于本发明的目的，本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入。在图中：
图1：smFISH的分子结构。多个单个或多个荧光标记的基因特异性杂交探针原位结合靶mRNA。由于局部集中的荧光团，可以通过光学显微镜将单个mRNA可视化为衍射极限(200nm大小)内的单点。
图2：汇集物smFISH寡核苷酸的T4 DNA连接酶介导的荧光标记。通过具有5′随机四聚体和另外的胺基团的夹板DNA将未标记的smFISH探针与常见的荧光寡核苷酸桥接在一起，以阻断夹板的自连接。
图3：本发明的标记方法的反应方案。显示了寡核苷酸探针在3’末端标记的实施方案。
图4：Hepa 1-6中的Gapdh mRNA smFISH检测。蓝色染色是针对细胞核的DAPI染色，并且白点是落射荧光显微镜下Gapdh的smFISH信号。
图5：Hepa 1-6中的Gapdh mRNA smFISH检测。蓝色染色是针对细胞核的DAPI染色，并且彩色点是不同z轴的Gapdh的smFISH信号。
图6：小鼠NSC中的Gapdh mRNA smFISH双色检测。蓝色染色是针对细胞核的DAPI染色，并且绿色或红色点是Gapdh的smFISH信号。
在序列中：
SEQ ID NO：1标记-载体-寡核苷酸cta aat cca tta-ATTO550
SEQ ID NO：2互补-夹板-寡核苷酸ATGGATTTAGNNNN-NH2
SEQ ID NO：3-34小鼠Gapdh mRNA编码区特异性探针。
SEQ ID NO：35标记-载体-寡核苷酸用于双色
CTAAAzCCATACGGCGCAACT-ATTO550，z用于FAM-dT。
实施例
为了使smFISH探针易于在世界上的任何分子生物学和临床实验室中获得和生产，本申请的发明人开始重新改造当前的smFISH探针文库制备以使该方法更容易和更廉价。代替使用通常用于商业探针的基于EDC的化学，本申请的发明人认为使用酶促标记方法来生成smFISH探针文库。这种方法被认为更廉价和更容易在实验室中设置。通过这一关键变化，可以在文库中的每个寡核苷酸上合成没有末端胺基团的起始探针文库，这直接将单个寡核苷酸的价格从15欧元降低到2.5欧元(表1)。这大大降低了smFISH探针制作的成本。对于典型的smFISH探针文库，必须有至少32个和最多96个寡核苷酸。
表1：各种smFISH探针的价格比较
几种酶可以潜在地用于标记具有荧光标记的寡核苷酸的smFISH探针文库中的ssDNA寡核苷酸。一种可能性是使用T4 DNA连接酶，这是因为该酶的高效率和低成本而在此对其进行选择。本申请的发明人还生成了用于DNA连接的胺封闭夹板，其不会从夹板寡核苷酸生成自连接产物(图2)。
图3中提供了标记过程的一个实例的完整草图。在一个替代实例中，携带寡核苷酸的标记与在5′末端的探针寡核苷酸连接。在该实例中，夹板寡核苷酸的布置也是相反的。
在制备型尿素-PAGE凝胶上仔细纯化后，获得了针对Gapdh的高度纯化的smFISH探针文库，以及Bdnf和其他两个工作的smFISH探针文库。图4中显示了与可商购获得的Gapdh探针相比，小鼠Hepa 1-6细胞系中Gapdh mRNA染色的一个实例。利用Zeiss的更先进的成像方法，本申请的发明人能够使用在深部组织上获得更好的smFISH图像(图5)。/>
利用类似的标记策略，本申请的发明人已成功地将smFISH探针与多个荧光团立刻缀合，这构成了本发明的另一个实例。在下文中，根据本发明的多标记探针被称为“RainbowFISH”。在本发明的该实施方案中，关键的是包括互补DNA寡核苷酸以与携带荧光团的标记寡核苷酸形成常见标记序列的双链体。形成互补寡核苷酸的此类双链体被称为“适配子”寡核苷酸。在没有这种适配子寡核苷酸的情况下，多色smFISH探针将具有强烈的荧光猝灭。
还显示了用双色RainbowFISH进行的小鼠神经元干细胞中Gapdh mRNA检测的一个实例(图6)。Gapdh单分子mRNA点与绿色和红色信号完全共定位。这不仅增加了原位GapdhmRNA检测的特异性，而且还允许多种颜色组合以在一个检测杂交中条形码化每个mRNA种类。
如果单个荧光团不够强，则smFISH探针的多色标记也可以为smFISH图像提供更亮的点。此外，使用多个荧光团增加了文库中每个探针的信号，因此可以减少每个文库中包含的探针的数量(从总探针的最低24到甚至5-6)。
从理论上讲，独特组合的数量等于(n+m-1)！/n！(m-1)！(荧光团的数量为n，并且荧光团颜色的数量为m)。然后在6个位置的仅5种荧光团将产生210种独特的颜色组合，其在单分子水平上转化为210个不同的mRNA原位检测。如果我们可以用多色探针应用多轮杂交，基于MERFISH中使用的类似策略，将很容易在单细胞中完成整个转录组的原位成像和数字量化。
下文示出一般标记和探针杂交实例，分为几个主要步骤：
1.用于smFISH探针标记的反应.
100μl的反应实例(如果需要更大或更小的规模，则相应地改变)：
然后将组合物充分混合，并在PCR机器或温度控制的水浴中于16℃孵育1小时。通过加入900μl正丁醇来猝灭反应，以沉淀所有寡核苷酸，并在50μl 90％甲酰胺和负载染料(二甲苯蓝+溴酚蓝)中重新溶解寡核苷酸沉淀。将重新溶解的寡核苷酸在95℃下变性5分钟，并立即置于冰上。
2.凝胶纯化
同时，针对最多500ul样品/凝胶用制备梳(1.5毫米厚，1孔、5孔等)制备UREA PAGE凝胶：
在室温下聚合凝胶15分钟(在去除梳子之前，检查孔之间的聚合，在玻璃板中比在falcon管中更慢)。然后凝胶需要在1x TBE中在300V(电流大约30-50mA)下预运行30分钟。在上样之前，洗涤每个孔，之后上样，并在5孔凝胶中最多上样150ul/孔，或在1孔凝胶中上样600-700μl。运行条件为300V，30-45分钟分开，直到二甲苯蓝带迁移在凝胶的1/3和1/2之间。凝胶可以从板上取下，并对其进行切割，以获得探针-序列-寡核苷酸和标记-载体-寡核苷酸的荧光标记的连接产物的薄带。在环境光下可以看到该带，并且应该最小化切割凝胶的时间。使用1.5ml管内的微管杵将凝胶块均质化，并重新悬浮在至少1ml TE pH8.5缓冲液(或5体积凝胶块)中。需要在液氮/干冰中快速冷冻以帮助进一步分解凝胶粉末。然后，在90℃解冻5分钟，然后在室温下将反应物放在旋转仪上过夜。需要例如用铝箔保护管免受光照。
3.寡核苷酸清理和浓度
通过0.22μm过滤管过滤来从TE溶液中去除凝胶。室温下以最大16000g离心30分钟。通过依次添加总共6-8体积的正丁醇(任选的3个步骤)，再次浓缩收集的溶液。然后最大程度地去除丁醇的上相。然后向溶液中加入100μg糖原，用6体积的冷丙酮沉淀，并用70％乙醇洗涤一次。将干沉淀在30μl水中重新溶解，并使用例如Nanodrop机器检测浓度。
4.原位smFISH染色和成像
在室温下，用3.7％FA将细胞在盖玻片上固定10分钟。然后用PBS洗涤两次，并保藏在70％EtOH中过夜。在原位杂交之前，用2x SSC 10％甲酰胺、0.1％吐温20洗涤两次，每次10分钟。然后在30℃下在smFISH杂交1×缓冲液(2xSSC缓冲液，10％硫酸葡聚糖，10％甲酰胺，1mg/ml tRNA，2mM RVC(氧钒核糖核苷复合物)，0.2mg/ml BSA)中杂交过夜，探针稀释1∶100(如果探针浓度～100ng/ul)。杂交后，用2x SSC、10％甲酰胺、0.1％吐温20洗涤两次，每次30分钟，如果需要，第二次洗涤包括针对细胞核的DAPI染色。将样品加载到来自生命技术公司(life technologies inc)的ProLong封片介质中。对smFISH点成像可以通过普通的宽场荧光显微镜或超分辨率显微镜(包括结构照明显微镜、STED显微镜等)完成。

Claims (22)

1.用于产生标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供探针-序列-寡核苷酸，其包含与单链靶核酸互补的核苷酸序列，
b.提供单链的标记-载体-寡核苷酸，其包含至少一个标记部分或其他功能部分，其中所述单链的标记-载体-寡核苷酸具有预定的核苷酸序列，
c.提供单链的互补-夹板-寡核苷酸，所述单链的互补-夹板-寡核苷酸包含：(i)反向互补区，其具有与所述单链的标记-载体-寡核苷酸的序列反向互补的序列，和(ii)随机序列区，其包含随机核苷酸序列，
d.使所述探针-序列-寡核苷酸、所述单链的标记-载体-寡核苷酸和所述单链的互补-夹板-寡核苷酸在杂交条件下接触以形成复合物，其中在所述复合物中，游离的-OH基团与游离的磷酸基团在空间上紧密接近，
e.在连接条件下使用连接酶使所述复合物反应以在3’-OH基团和5’-磷酸基团之间形成共价键，从而形成所述标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针。
2.用于产生标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供探针-序列-寡核苷酸，其包含与单链靶核酸互补的核苷酸序列，并且在3’末端具有游离的-OH基团，
b.提供单链的标记-载体-寡核苷酸，其包含至少一个标记部分或其他功能部分，其中所述单链的标记-载体-寡核苷酸具有预定的核苷酸序列，并且在5’末端具有游离的磷酸基团，
c.提供单链的互补-夹板-寡核苷酸，其包含以5’至3’方向具有以下的序列：(i)反向互补区，其包含与所述单链的标记-载体-寡核苷酸的序列反向互补的序列；和(ii)随机序列区，其包含随机核苷酸序列，任选地其中所述单链的互补-夹板-寡核苷酸包含3’-末端封闭基团，
d.使所述探针-序列-寡核苷酸、所述单链的标记-载体-寡核苷酸和所述单链的互补-夹板-寡核苷酸在杂交条件下接触以形成复合物，其中在所述复合物中，在所述探针-序列-寡核苷酸的3’末端的游离的-OH基团与在所述单链的标记-载体-寡核苷酸的5’末端的游离的磷酸基团在空间上紧密接近，
e.在连接条件下使用连接酶使所述复合物反应以在所述探针-序列-寡核苷酸的3’末端和所述单链的标记-载体-寡核苷酸的5’-末端之间形成共价键，从而形成所述标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针。
3.用于产生标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供探针-序列-寡核苷酸，其包含与单链靶核酸互补的核苷酸序列，在5’末端具有游离的-磷酸基团，
b.提供单链的标记-载体-寡核苷酸，其包含至少一个标记部分或其他功能部分，其中所述单链的标记-载体-寡核苷酸具有预定的核苷酸序列，并且在3’末端具有游离的-OH基团，
c.提供单链的互补-夹板-寡核苷酸，其包含以3’至5’方向具有以下的序列：(i)反向互补区，其包含与所述单链的标记-载体-寡核苷酸的序列反向互补的序列；和(ii)随机序列区，其包含随机核苷酸序列，并且其中所述单链的互补-夹板-寡核苷酸包含3’-末端封闭基团，
d.使所述探针-序列-寡核苷酸、所述单链的标记-载体-寡核苷酸和所述单链的互补-夹板-寡核苷酸在杂交条件下接触以形成复合物，其中在所述复合物中，在所述单链的标记-载体-寡核苷酸的3’末端的游离的-OH基团与在所述探针-序列-寡核苷酸的5’末端的游离的磷酸基团在空间上紧密接近，
e.在连接条件下使用连接酶在所述探针-序列-寡核苷酸的5’-末端和所述单链的标记-载体-寡核苷酸的3’末端之间形成共价键，以形成所述标记的或以其他方式修饰的寡核苷酸探针。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述单链的标记-载体-寡核苷酸包含两个或更多个标记部分。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述单链的标记-载体-寡核苷酸包含三个、四个或五个标记部分。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述两个或更多个标记部分包括至少两个或更多个不同的标记部分或其他功能部分。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其包括纯化所述探针-序列-寡核苷酸和单链的标记-载体-寡核苷酸的连接产物。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其包括以下另外的步骤：提供适配子寡核苷酸，其包含与所述单链的标记-载体-寡核苷酸的序列互补的序列；以及使所述探针-序列-寡核苷酸和单链的标记-载体-寡核苷酸的连接产物与所述适配子寡核苷酸在杂交条件下接触以形成稳定的寡核苷酸探针。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述探针-序列-寡核苷酸的长度为20至300个核苷酸。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述单链的互补-夹板-寡核苷酸的随机序列区由2至10个核苷酸组成。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述单链的互补-夹板-寡核苷酸的随机序列区由2至8个核苷酸组成。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述单链的互补-夹板-寡核苷酸的随机序列区由2至6个核苷酸组成。
13.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述单链的互补-夹板-寡核苷酸的随机序列区由4个核苷酸组成。
14.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法包括步骤f.去除所述单链的互补-夹板-寡核苷酸。
15.用于生成单分子荧光原位杂交(smFISH)探针文库的方法，其包括根据权利要求1至14中任一项所述的方法产生至少两种被荧光标记了的寡核苷酸探针，其中所述至少两种被荧光标记了的寡核苷酸探针能够结合一种单链靶核酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少两种被荧光标记了的寡核苷酸探针是至少10种被荧光标记了的寡核苷酸探针，并且其中所述荧光标记的寡核苷酸探针中的每一种能够结合所述一种单链靶核酸。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少两种被荧光标记了的寡核苷酸探针是至少30种被荧光标记了的寡核苷酸探针，并且其中所述荧光标记的寡核苷酸探针中的每一种能够结合所述一种单链靶核酸。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少两种被荧光标记了的寡核苷酸探针是至少30至150种被荧光标记了的寡核苷酸探针，并且其中所述荧光标记的寡核苷酸探针中的每一种能够结合所述一种单链靶核酸。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少两种被荧光标记了的寡核苷酸探针是约100种被荧光标记了的寡核苷酸探针，并且其中所述荧光标记的寡核苷酸探针中的每一种能够结合所述一种单链靶核酸。
20.用于标记寡核苷酸探针的标记试剂盒，所述试剂盒包含单链的标记-载体-寡核苷酸和单链的互补-夹板-寡核苷酸，所述单链的标记-载体-寡核苷酸包含至少一个标记部分或其他功能部分，其中所述单链的标记-载体-寡核苷酸具有预定的核苷酸序列；所述单链的互补-夹板-寡核苷酸包含(i)反向互补区，其具有与所述单链的标记-载体-寡核苷酸的序列反向互补的序列，和(ii)随机序列区，其包含简并核苷酸序列。
21.用于探测细胞中信使核糖核酸分子(mRNA)的靶序列的方法，所述靶序列包括多个非重叠的探针结合区，所述方法包括将所述细胞浸入过量的至少两种寡核苷酸探针中，其中所述至少两种寡核苷酸探针中的每一种用至少两种不同颜色荧光标记的相同组合多重标记，并且其中所述至少两种寡核苷酸探针中的每一种包含与所述靶序列的不同探针结合区互补的核酸序列；洗涤所述细胞以去除未结合的探针；以及检测来自所述探针的荧光，其中根据权利要求1至14中任一项所述的方法制备所述寡核苷酸探针。
22.用于同时探测细胞中信使核糖核酸分子(mRNA)的至少两种靶序列的方法，所述靶序列各自包括多个非重叠的探针结合区，所述方法包括将所述细胞浸入过量的探针组中，一个探针组针对一种靶序列，其中每个探针组包含至少两种寡核苷酸探针，并且探针组中的每种寡核苷酸探针用至少两种不同颜色的荧光标记的相同组合标记，以为每种靶序列提供彩色条形码，并且其中所述不同颜色的荧光标记的组合在每个探针组之间是不同的，并且其中探针组中的每种寡核苷酸探针含有与所述靶序列的不同探针结合区互补的核酸序列；洗涤所述细胞以去除未结合的探针；以及检测来自所述探针的荧光，其中根据权利要求1至14中任一项所述的方法制备所述寡核苷酸探针。
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