JP2020516278A - 多種多様なライゲーションによるオリゴヌクレオチドプローブの標識 - Google Patents
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- C12Q2565/1025—Multiple non-interacting labels labels being on the same oligonucleotide
Abstract
Description
(a)(i)標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブ配列および(ii)第1アダプターヌクレオチド配列に相補的な所定のタグヌクレオチド配列を含む、プローブ−配列−オリゴヌクレオチドを提供する工程、
(b)標識−担体−オリゴヌクレオチドが第2アダプターヌクレオチド配列に相補的な所定のタグヌクレオチド配列を有する、少なくとも1つの標識部分、または他の機能部分を含む、標識−担体−オリゴヌクレオチドを提供する工程、
(c)直接配列(direct sequence)において第1および第2アダプターヌクレオチド配列を含む、アダプター−オリゴヌクレオチドを提供する工程、
(d)複合体を形成するために、ハイブリダイズする条件下で、プローブ−配列−オリゴヌクレオチド、標識−担体−オリゴヌクレオチド、およびアダプター−オリゴヌクレオチドを接触させる工程であって、複合体において、遊離(非ブロック)−OH基が遊離(非ブロック)リン酸基に空間的に近接している、工程、
(e)ライゲーション条件下でリガーゼを使用して、3’−OH基と5’−リン酸基の間に共有結合を形成するために複合体を反応させ、標識された、または修飾されたオリゴヌクレオチドプローブを形成させる工程、
(f)任意で、アダプター−オリゴヌクレオチドを除去する工程、を含む。
細胞培養および組織切片調製
マウス初代神経幹細胞(NSC)は、8週間の成体オスC57BL/6Jマウス脳の脳室下帯から分離された。単離組織片をさらに1mm3のサイズに切り刻み、Accutase溶液(Sigma、A6964)で37℃で20分間消化した。細胞を250gで5分間遠心分離した後、無血清培地(0.6% グルコース、20mM HEPES (1M ストック、Sigma、H0887)、 0.2 mM プロゲステロン、0.06 mM プトレシン、2% B27、20 ng/ml EGF、10 ng/ml FGF、0.1% ITSS、1 x ペニシリン/ストレプトマイシン、0.36 U/ml ヘパリン (Sigma、H3149)、1.2 % (w/v) NaHCO3を添加したDMEM/F-12 HEPES(ThermoFisher、31330095))で再懸濁および培養した。コーティングされたプレートまたはカバースリップでのNSC培養では、プレートまたはカバースリップは、mg/mlポリ-l-リジン(Sigma、P7280)、0.0025 mg/mlラミニン(Roche、11243217001)を補充したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でコーティングされ37℃で一晩放置してから、紫外線照射で細胞培養フードの下で乾燥させた。マウスHepa1-6細胞を、10%ウシ胎仔血清および1 x ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM培地で培養した。Hepa 1-6細胞は、コーティングなしのカバースリップ上で直接成長させた。胚マウス脳組織凍結切片は、Tissue-Tek O.C.T. (Sakura、4583)に包埋された胚12.5日目のC57BL/6Jマウス胚から6〜10μmで切断された。
Primer3で正しいプライマーを選択するための標準条件を使用して、Primer3で最初にプローブを選択し、入力cDNAシーケンスから過度の二次構造のないすべての可能性のあるプローブを取得し、従来のdesign3に基づくsmFISHプローブをRスクリプトで実行した。次に、重複しないsmFISHプローブを2 bpギャップで選択した。 HuluFISHプローブの場合、Primer3由来のすべてのプローブは、染色に使用される条件下でRのDECIPHERパッケージとのハイブリダイゼーション効率についてさらに計算された。そして、ハイブリダイゼーション効率が0.9(最大1)を超えるようにプローブをフィルターにかけ、その後、重複しないHuluFISHプローブを前述のように選択した。アダプターシーケンスは、UNAfoldによって強力な二次構造のためにランダムに生成および制御された。パスした配列は、15 bp以下の完全一致で、ローカルのマウスとヒトの転写産物データベース(アンサンブルリリース87(ensemble release 87))に対してブラスト(blast)された。
本発明の標識方法は「HuluFISH」と表示される。
HuluFISHプローブミックスは、ハイブリダイゼーションバッファー(2 x SSC(生理食塩水−クエン酸ナトリウム)、10%硫酸デキストラン、10%ホルムアミド、1 mg/mL tRNA(Roche、10109541001)、2mMリボヌクレオシドバナジル 複合体(NEB、S1402S)、0.2 mg / mL BSA)中の各単一オリゴについて10 nMに調整された。Biosearch Technology から購入したGapdh-Quasar570プローブを再懸濁し、メーカーの指示に従って染色を実施した。ハイブリダイゼーションは、サンプルをパラフィルムに伏せて、30℃の水浴で一晩実施した。カバーガラス上の細胞またはガラススライド上の組織切片を、洗浄バッファー(2 x SSC、10%ホルムアミド、0.1%Tween-20)で37℃で6 x 10分間洗浄した。最後の洗浄工程では、核染色用の0.5μg/mL DAPI(4',6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)が含まれた。サンプルをProLong Gold Antifade(ThermoFisher、P10144)にマウントし、一晩硬化させた。サンプルは、405nm、488nm、および561nmのチャネル用200 ms、950 ms、および5000msでの広視野顕微鏡(Zeiss Cell Observer)、または各チャネルで最大のレーザー出力を使用して、Airyscan(Zeiss LSM800、405、488、561、および647 nmレーザーを装備)での共焦点顕微鏡のいずれかで撮像された。サンプルは、Zeissソフトウェアが提供する最適な設定のAiryscanテクノロジーでスキャンされた。
ImageJで手動で規定された核の輪郭を除き、すべての画像分析はRで実行され、大多数はパッケージEBImageに基づく。すべての強度しきい値は、Zeiss Airyscanから生成された任意の単位に基づくため、以下の説明では特定しない。FISHドットの識別は、2D局所最大値の識別およびアライメントに依存した。最初に各フレームについて、低しきい値を超える2D最大値が特定された。各2D極大値は、アライメントのために隣接するZスライスへの投影が考慮され:0.08 um以内に収まるものは、同じFISHドットに割り当てられた。識別されたFISHドットの最大強度(擬似3D最大)を持つピクセルは、さらなる分析のために抽出された。
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Label-carrier-oligonucleotides 標識−担体−オリゴヌクレオチド
Probe sequence-oligonucleotide プローブ 配列−オリゴヌクレオチド
Label or other moiety 標識または他の部位
adaptor-oligonucleotide アダプター−オリゴヌクレオチド
ligation ライゲーション
in situ staining in situ 染色
Adaptor stabilized HuluFISH probes アダプター安定化HuluFISHプローブ
Fixed cell 固定された細胞
Merge 統合
Log2 Expression Log2 発現
Claims (13)
- 標識またはその他の方法で修飾されたオリゴヌクレオチドプローブの製造方法であって、該方法は、以下の工程:
a.(i)標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブ配列および(ii)第1アダプターヌクレオチド配列に相補的な所定のタグヌクレオチド配列を含む、プローブ−配列−オリゴヌクレオチドを提供する工程、
b.標識−担体−オリゴヌクレオチドが第2アダプターヌクレオチド配列に相補的な所定のタグヌクレオチド配列を有する、少なくとも1つの標識部分、または他の機能部分を含む、標識−担体−オリゴヌクレオチドを提供する工程、
c.直接配列において第1および第2アダプターヌクレオチド配列を含む、アダプター−オリゴヌクレオチドを提供する工程、
d.複合体を形成するために、ハイブリダイズする条件下で、プローブ−配列−オリゴヌクレオチド、標識−担体−オリゴヌクレオチド、およびアダプター−オリゴヌクレオチドを接触させる工程であって、複合体において、遊離(非ブロック)−OH基が遊離(非ブロック)リン酸基に空間的に近接している、工程、
e.ライゲーション条件下でリガーゼを使用して、3’−OH基と5’−リン酸基の間に共有結合を形成するために複合体を反応させ、標識された、または修飾されたオリゴヌクレオチドプローブを形成させる工程、
f.任意で、アダプター−オリゴヌクレオチドを除去する工程、を含む方法。 - プローブ−配列−オリゴヌクレオチドにおいて、プローブ配列は所定のタグヌクレオチド配列の5’であり、および
アダプター−オリゴヌクレオチドにおいて、第1および第2アダプターヌクレオチド配列は、直接配列において3’から5’方向にあり、および
工程(d)の複合体においてプローブ−配列−オリゴヌクレオチドの遊離3’OH基は、標識−担体−オリゴヌクレオチドの遊離(非ブロック)リン酸基に空間的に近接している、請求項1に記載の標識またはその他の方法で修飾されたオリゴヌクレオチドプローブの製造方法。 - プローブ−配列−オリゴヌクレオチドにおいて、プローブ配列は所定のタグヌクレオチド配列の3’であり、および
アダプター−オリゴヌクレオチドにおいて、第1および第2アダプターヌクレオチド配列は、直接配列において5’から3’方向にあり、および
工程(d)の複合体においてプローブ−配列−オリゴヌクレオチドの遊離(非ブロック)リン酸基は、標識−担体−オリゴヌクレオチドの遊離3’OH基に空間的に近接している、請求項1に記載の標識またはその他の方法で修飾されたオリゴヌクレオチドプローブの製造方法。 - 工程(b)において 、第1、第2、任意で第3以上の、標識−担体−オリゴヌクレオチドを提供することを含むものであり、第1の標識−担体−オリゴヌクレオチドは、第2のアダプターヌクレオチド配列に相補的な所定のタグヌクレオチド配列を有し、第2の標識−担体−オリゴヌクレオチドは、第3のアダプターヌクレオチド配列に相補的な所定のタグヌクレオチド配列を有し、任意で、第3以上の標識−担体−オリゴヌクレオチドは、第4以上のアダプターヌクレオチド配列に相補的な所定のタグヌクレオチド配列を有するものであって、および、工程(c)においてアダプター−オリゴヌクレオチドは、直接配列に、第1、第2、第3、任意で第4以上のアダプターヌクレオチド配列を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の標識またはその他の方法で修飾されたオリゴヌクレオチドプローブの製造方法。
- それぞれのアダプターヌクレオチド配列は異なるヌクレオチド配列を含む、請求項4に記載の方法。
- それぞれの標識−担体−オリゴヌクレオチドは異なって標識されるか、そうでなければ修飾される、請求項4または5に記載の方法。
- 標識−担体−オリゴヌクレオチドは、2つまたはそれ以上、好ましくは3つ、4つまたは5つの標識部分を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 2つまたはそれ以上、好ましくは3つ、4つまたは5つの標識部分は少なくとも2つ以上の異なる標識部分、または他の機能部分を含む、請求項7に記載の方法。
- プローブ−配列−オリゴヌクレオチドと標識−担体−オリゴヌクレオチドのライゲーション産物を精製する工程を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- プローブ−配列−オリゴヌクレオチドは、20〜300ヌクレオチドの長さを有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の少なくとも2つの蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを生成することであって、該少なくとも2つの蛍光オリゴヌクレオチドプローブが、1つの標的核酸に結合することができることを含む、単一分子蛍光insitu ハイブリダイゼーション(smFISH)プローブライブラリを生成する方法。
- 少なくとも2つの蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも10、好ましくは少なくとも30、より好ましくは30〜150、最も好ましくは約100の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブであって、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれは、1つの標的核酸に結合することができる、請求項11に記載の方法。
- 第1、および第2、任意で第3以上の標識−担体−オリゴヌクレオチドを含むキットであって、該第1標識−担体−オリゴヌクレオチドは、第2アダプターヌクレオチド配列に相補的な所定のタグヌクレオチド配列を有し、該第2標識−担体−オリゴヌクレオチドは、第3アダプターヌクレオチド配列に相補的な所定のタグヌクレオチド配列を有し、任意で、該第3以上標識−担体−オリゴヌクレオチドは、第4以上アダプターヌクレオチド配列に相補的な所定のタグヌクレオチド配列を有し、およびアダプター−オリゴヌクレオチドは第1、第2、第3、任意で第4以上のアダプターヌクレオチド配列を直接配列で含み、第1のアダプターヌクレオチド配列は、プローブ−配列−オリゴヌクレオチド(またはオリゴヌクレオチドプローブ)の所定のタグヌクレオチド配列に相補的である、キット。
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