CN110337492A - 适用于清洁剂组合物中的纤维素酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型纤维素酶、该新型纤维素酶在各种应用如清洁剂组合物中的用途及包含该新型纤维素酶的组合物。

Description

适用于清洁剂组合物中的纤维素酶
技术领域
本发明涉及新型纤维素酶、该新型纤维素酶在各种应用如清洁剂组合物中的用途及包含该新型纤维素酶的组合物。
背景技术
纤维素酶用于各种应用，并且对于清洁应用的良好性能(如清洁剂组合物的性能)特别重要。
本领域已知有各种纤维素酶，但是，随着消费者期望高清洁性能而同时生产成本和最终产品的成本应保持较低，功能需求不断增加。此外，环境方面的重要性和销售审批的要求不断提高。到目前为止，织物的白度通常通过施用漂白剂如含氯组合物来实现。这不仅导致织物的损害，而且还增加了成本和对环境有害。这些现有技术的酶例如在US 2005070003 A1中公开。
因此，本发明的发明人致力于开发适用于清洁剂组合物中的新型纤维素酶，其相对于本领域已知的纤维素酶显示出显著改善的性质。对于本发明的发明人来说特别重要的是，织物的白度由于改进的ARD(抗再沉积；术语“抗再沉积”和相应的方法在实施例中定义)效应而提高，同时织物的损害或退化被最小化或甚至可以避免。
发明内容
本发明的发明人现在惊奇地发现，这一任务可以通过包含催化结构域基序[STA]-T-R-Y-[FYW]-D-x(5)-[CA]和与SEQ ID NO：3具有至少80％的序列同一性的碳水化合物结合结构域(carbohydrate binding domain)或包含标签基序V-[PSC]-[DQEN]-S-G-G-P-G-P-G-P-G-P-G-P的碳水化合物结合结构域的纤维素酶来完成。
本发明的纤维素酶不仅显示出优异的清洁性能和显著提高的织物白度，而且还显示出突出的去球(de-pilling)效果。迄今为止，清洁剂和特别地洗衣组合物通常含有纤维素酶混合物(即用于白度的纤维素酶和用于去球的另外的纤维素酶)。这增加了清洁剂的酶含量、每剂的成本和在洗涤循环结束时清洗掉的酶的量。此外，不同的纤维素酶可能具有不同的稳定性和活性要求，以及最佳情况下使得配制和洗涤说明更加困难。
此外，本发明的纤维素酶即使在如40℃、35℃或甚至低于35℃，优选低于25℃和最多20℃，及低于20℃的低温下也显示出优异的白度(ARD)和去球效果。
本发明纤维素酶的另外的优点是本发明纤维素酶的高表达率，从而进一步降低了生产成本。
在本发明中，术语“纤维素酶”应理解为指催化纤维素水解(其是纤维素和相关多糖的分解)的任何酶。在本发明中，术语“纤维素酶”还指这些酶的任何天然存在的混合物或复合物，其依次地或协同地起作用以降解纤维素材料。本发明的纤维素酶可以是真菌、细菌或原生动物来源的。术语“纤维素酶”特别地指能够将纤维素分解成单糖如β-葡萄糖或较短的多糖和低聚糖的任何酶。
术语“去球”是指纤维素酶去除织物中或织物上的棉绒和松散表面纤维的能力。该过程也称为“去毛球”、“生物抛光”和“生物整理(biofinishing)”，并使织物表面平滑，这随之改善其柔软性和外观。纤维素酶处理还有助于防止随后形成使衣服看起来老旧的纤维起球。在去球过程中，希望的是使由于纤维素酶的水解作用引起的织物强度的损失最小化。
本发明的纤维素酶包含催化结构域基序[STA]-T-R-Y-[FYW]-D-x(5)-[CA]。本申请中所称的任何基序或修饰使用本领域技术人员公知的氨基酸单字母代码定义。
氨基酸编码如下：
G甘氨酸，P脯氨酸，A丙氨酸，V缬氨酸，L亮氨酸，I异亮氨酸，M甲硫氨酸，C半胱氨酸，F苯丙氨酸，Y酪氨酸，W色氨酸，H组氨酸，K赖氨酸，R精氨酸，Q谷氨酰胺，N天冬酰胺，E谷氨酸，D天冬氨酸，S丝氨酸，T苏氨酸。
方括号中的氨基酸应理解为相应位置的可选替代。“x”表示相应位置可以从所有存在的氨基酸中选择。括号中的数字(在此定义中称为变量“z”)(例如该催化结构域基序中包含的5)表示括号前面的项(“项”表示氨基酸或任何基序如[ACT])重复z次(例如A(5)表示氨基酸A重复5次)。在存在两个指明的数字的情况中，例如(5,10)，括号前面的项(如上所定义)可以重复5到10次。
在本发明的优选实施方案中，催化结构域基序是T-T-R-Y-[FYW]-D-x(5)-[CA]。
在本发明的特别优选的实施方案中，催化结构域基序是T-T-R-Y-W-D-x(5)-C，其中催化结构域基序T-T-R-Y-W-D-C-C-K-P-S-C(也称为SEQ ID NO:9)是最优选的。
本发明的纤维素酶还包含碳水化合物结合结构域，其与SEQ ID NO：3具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少92％，还优选至少95％，特别优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性，或者碳水化合物结合标签基序V-[PSC]-[DQEN]-S-G-G-P-G-P-G-P-G-P-G-P，其中V-P-D-S-G-G-P-G-P-G-P-G-P-G-P的碳水化合物结合结构域标签是最优选的。
在本发明中，术语“碳水化合物结合结构域标签”是指包含基序V-[PSC]-[DQEN]-S-G-G-P-G-P-G-P-G-P-G-P的任何序列，其可以直接连接到纤维素酶催化结构域，或通过接头，优选如本文定义的接头连接。
两个氨基酸序列之间的序列同一性使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，如在EMBOSS包(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选5.0.0或更高版本的Needle程序中实施的。使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)置换矩阵。标记“最长同一性”(使用-nobrief选项获得)的Needle的输出用作百分同一性并计算如下:(相同残基X100)/(比对长度–比对中空位的总数)。
在特别优选的实施方案中，本发明的纤维素酶包括含有与SEQ ID NO：1具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少92％，还优选至少95％，特别优选至少98％且最优选至少99％的序列同一性的序列。
在优选的实施方案中，本发明的纤维素酶还包含接头。术语“接头”是指本领域技术人员已知适合连接或“联接”催化结构域和碳水化合物结合结构域或碳水化合物结合结构域标签的任何序列。“接头”或“间隔物”是在性质上用于分隔单一蛋白质中的多个结构域而产生的短氨基酸序列。在不干扰每个结构域的功能的情况下，其起到禁止催化结构域与碳水化合物结合结构域或碳水化合物结合结构域标签之间的不需要的相互作用的功能。一些接头已经令人惊讶地发现有助于本发明的纤维素酶的性能并且提高ARD(抗再沉积)和去球效果，并且本发明的发明人甚至能够鉴定接头基序。
在优选的实施方案中，接头与SEQ ID NO：5具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少92％，还优选至少95％，特别优选至少98％和最优选至少99％的序列同一性。因此，进一步优选接头包含[AGSVT](5,65)的氨基酸序列。
在另一优选实施方案中，接头具有与SEQ ID NO：7的至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少92％，还优选至少95％，特别优选至少98％和最优选至少99％的序列同一性。因此，进一步优选接头包含([SG]-P)(5,10)的氨基酸序列。
在特别优选的实施方案中，本发明的纤维素酶选自具有与SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17的至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少92％，还优选至少95％，特别优选至少98％和最优选至少99％的序列同一性的任何序列。
本发明的纤维素酶可以通过本领域技术人员已知为适合于本发明目的的任何方法制备。优选的是通过合适的宿主细胞表达本发明的纤维素酶。术语“宿主细胞”是指适合于用包含本发明纤维素酶的核酸序列的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”还包括亲本细胞的任何后代，其由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同。宿主细胞优选选自真菌、酵母和细菌。在本发明中，宿主细胞优选是酵母细胞如念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)；毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)，其中乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、卡氏酵母(Kaccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克氏酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、解脂耶氏酵母(YarrowiaIipolytica)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是优选的。
术语“表达”包括涉及产生本发明纤维素酶的任何步骤，例如但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
在另一方面中，本发明涉及如本申请中定义的本发明纤维素酶在纺织品、饲料、食品、生物质水解、植物油精制、清洁剂及纸浆和纸加工应用中的用途。在优选的实施方案中，本发明的纤维素酶用作生物整理剂，例如去球剂或脱毛剂；生物石磨剂(biostoningagent)；织物护理剂如颜色澄清剂(color clarification agent)、抗变灰剂、软化剂、抗起球剂；洗衣剂如抗再沉积剂(anti-redeposition agent)、去污剂；制麦和酿造剂(maltingand brewing agent)，如过滤剂、颜色提取剂(color extraction agent)；烘焙试剂，如质构剂(texture agent)；饲料试剂如粘度降低剂；水果加工试剂如抗氧化剂释放剂(releaseantioxidants agent)、压制剂(pressing agent)、颜色提取剂、果汁澄清剂；植物油提取剂；纸浆和纸加工试剂，如脱墨剂、纤维增亮剂、助滤剂(drainage agent)和/或漂白剂。
诸如清洁和洗衣应用中的用途的纺织品应用是优选的。因此特别优选使用本发明的纤维素酶作为用于洗衣和清洁应用的组合物(如清洁剂组合物)的组分。
在另一方面中，本发明涉及包含至少一种本发明的纤维素酶的组合物。在优选的实施方案中，该组合物包含至少一种表面活性剂、助洗剂、共助洗剂、抗再沉积剂、分散剂、光亮剂、漂白剂、染料、酶、螯合剂、聚合物、pH缓冲剂、填充剂、絮凝剂、织物软化剂、泡沫促进剂、香料、起泡抑制剂、杀菌剂、杀真菌剂、酶抑制剂、稳定剂、增溶剂、抗氧化剂、抗腐蚀剂、补色染料(shading dye)和/或颜料。在特别优选的实施方案中，本发明的组合物是用于纺织品或纺织品材料的清洁剂组合物或者是非织物清洁剂组合物。
本发明的清洁剂组合物可以是任何方便的形式，例如条、均一片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个隔室的小袋、常规粉末或粉饼、颗粒、糊剂、凝胶或者常规、稠密或浓缩的液体。
小袋可以配置为单隔室或多隔室的。它可以是本领域技术人员已知为适合于本发明目的并且防止组合物在水接触之前从小袋释放的任何形式、形状和材料。小袋优选由包围内体积的水溶性薄膜制成。内体积可以分成小袋的隔室。优选的薄膜是聚合物材料，优选形成薄膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物是选择的聚丙烯酸酯及水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
液体或凝胶清洁剂可以是含水的，优选含有至少20重量％和至多95重量％的水，例如至多约70重量％的水，至多约65重量％的水，至多约55重量％的水，至多约45重量％的水，至多约35重量％的水，其中水含量为2至40重量％是优选的。其他类型的液体包括水性液体或凝胶中的链烷醇、胺、二醇、醚和多元醇。水性液体或凝胶清洁剂可含有0至30重量％的有机溶剂。液体或凝胶清洁剂也可以是非水性的。
术语“纺织品”是指纺织织物，以及适于转化为或用作纱线、机织、针织和非纺织物的短纤维和长丝。该术语包括由天然纤维和合成(例如，人造的)纤维制成的纱线。术语“纺织材料”是纤维、纱线中间体、纱线、织物和由织物制成的产品(例如，服装和其他制品)的总称。
术语“非织物清洁剂组合物”包括非纺织品表面清洁剂组合物，包括但不限于用于硬表面清洁的组合物，如餐具清洁剂组合物、口腔清洁剂组合物、假牙清洁剂组合物和个人清洁组合物。
用于洗衣液中的组合物可相对于组合物的重量包含0.0001至10重量％，优选0.0005至8重量％，例如0.001至5重量％，优选0.002至2重量％，特别优选0.003至1重量％的本发明纤维素酶，其中0.0005至0.5重量％，例如0.0005至0.05重量％的范围也是优选的。
本发明的纤维素酶可以使用常规稳定剂稳定化，例如多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，肽醛或酮。
在优选的实施方案中，组合物包含补色染料。优选地，补色染料是蓝色或紫色补色染料，虽然其他色调也在本发明的范围内。使用蓝色或紫色补色染料可以增强白度和/或清洁度的感觉。
合适的补色染料描述于WO2011/047987中，其内容通过引用整体并入本文。
优选地，补色染料是与聚合物共价结合的活性染料。更优选地，聚合物是聚亚胺，任选地但优选地其中聚亚胺被2-羟基丙-1-基基团取代。
补色染料可以优选包含下式的发色团：
其中----代表连接点。
示例性的和优选的补色染料是UB40，其具有以下结构：
在一些情况中，补色染料优选是直接染料，例如吖嗪染料。
合适的吖嗪染料描述于WO 2008/017570中，其内容通过引用整体并入本文。
在一些情况中，染料优选为AV50，其具有以下结构：
补色染料优选以0.0001至1重量％，更优选0.0001至0.1重量％，甚至更优选0.0001至0.01重量％，最优选0.0005至0.001重量％的量存在于组合物中。
在优选的实施方案中，组合物包含0.1至80重量％，优选1至70重量％，更优选2至60重量％，特别优选4至40重量％，甚至更优选5至35重量％，最优选6至33重量％的表面活性剂。
合适的表面活性剂可以选自Schwartz&Perry的"Surface Active Agents"Vol.1,Schwartz,Perry&Berch的Interscience 1949,Vol.2,Interscience 1958，由Manufacturing Confectioners Company出版的当前版本的"McCutcheon's Emulsifiersand Detergents"或"Tenside-Taschenbuch",H.Stache,2nd Edn.,Carl Hauser Verlag,1981或Helmut W.Stache编辑的Anionic Surfactants:Organic Chemistry(MarcelDekker 1996)中描述的表面活性剂。
在优选的实施方案中，本发明的组合物包含至少一种阴离子清洁剂化合物(或阴离子表面活性剂)，优选选自具有含约8至约22个碳原子的烷基的有机硫酸酯和磺酸酯的水溶性碱金属盐，术语烷基用于包括高级烷基基团的烷基部分。
合适的合成阴离子清洁剂化合物的实例是烷基硫酸钠和钾，特别是通过硫酸化高级C8-C18醇(例如从牛脂或椰油，烷基醚羧酸产生的)得到的那些；烷基C9-C20苯磺酸钠和钾，特别是直链仲烷基C10-C15苯磺酸钠；和烷基甘油醚硫酸钠，尤其是衍生自牛油或椰油的高级醇和衍生自石油的合成醇的那些醚，且优选选自直链烷基苯磺酸盐；烷基硫酸盐；烷基醚硫酸盐；烷基醚羧酸盐；皂；烷基(优选甲基)酯磺酸盐，及其混合物。特别优选的是烷基醚硫酸盐，例如具有平均1至3EO(乙氧基化物)单元的C12-C14正烷基醚硫酸盐。十二烷基醚硫酸钠是特别优选的(SLES)。优选地直链烷基苯磺酸盐是C11-C15烷基苯磺酸钠。优选地，烷基硫酸盐是直链或支链的C12-C18烷基硫酸钠。十二烷基硫酸钠是特别优选的(SDS，也称为伯烷基硫酸盐)。
在优选的实施方案中，在组合物中存在两种或更多种阴离子清洁剂化合物，例如直链烷基苯磺酸盐以及烷基醚硫酸盐。
在特别优选的实施方案中，阴离子清洁剂化合物选自直链烷基苯磺酸盐；烷基硫酸盐；烷基醚硫酸盐；及其混合物。
组合物可包含阴离子和/或非离子清洁剂化合物(表面活性剂)。
在优选的实施方案中，组合物包含至少一种非离子清洁剂化合物(或表面活性剂)，优选选自具有脂族疏水基团和活性氢原子的化合物(例如脂族醇)、酸或酰胺，尤其是单独或与环氧丙烷一起的环氧乙烷的反应产物。具体的非离子清洁剂化合物是脂族C8-C18直链或支链伯或仲醇与环氧乙烷的缩合产物。
优选地，烷基乙氧基化非离子表面活性剂是C8-C18伯醇，其具有7EO至9EO单元的平均乙氧基化。
如果存在非离子表面活性剂，则最优选地，非离子表面活性剂是醇乙氧基化物，更优选具有平均3-10摩尔环氧乙烷的C10-C18醇乙氧基化物，最优选具有平均5-9摩尔的环氧乙烷的C12-C15醇乙氧基化物。
在特别优选的实施方案中，本发明的组合物包含表面活性剂组合物，其包含4至40重量％，更优选5至35重量％，最优选6至33重量％的包含阴离子表面活性剂(优选包含直链烷基苯磺酸盐)和非离子表面活性剂的表面活性剂。在该优选的表面活性剂混合物中，最优选非离子表面活性剂与阴离子表面活性剂的重量分数<0.5，例如0.1至<0.5。这意味着优选的是清洁剂组合物中阴离子表面活性剂的含量大于非离子表面活性剂的含量。
在优选的实施方案中，本发明的组合物优选包含香料。优选地，香料包含以下的至少一种香韵(note)(化合物)：α-异甲基紫罗兰酮、水杨酸苄酯；香茅醇；香豆素；己基肉桂醛；芳樟醇；戊酸，2-甲基-，乙基酯；辛醛；醋酸苄酯；1,6-辛二烯-3-醇，3,7-二甲基-，3-乙酸酯；环己醇，2-(1,1-二甲基乙基)-，1-乙酸酯；Δ-大马酮；β-紫罗兰酮；醋酸三环癸烯酯；十二醛；己基肉桂醛；环十五内酯；苯乙酸，2-苯基乙基酯；水杨酸戊酯；β-石竹烯；十一碳烯酸乙酯；香叶基邻氨基苯甲酸酯；α-鸢尾酮；β-苯基乙基苯甲酸酯；α-檀香醇；雪松醇；醋酸柏木酯；甲酸柏木酯；水杨酸环己酯；γ-十二内酯；和β-苯乙基苯基乙酸酯。
在优选的实施方案中，本发明的组合物优选包含荧光剂(光亮剂)。荧光剂是众所周知的，并且许多这样的荧光剂可商购获得。通常，这些荧光剂以其碱金属盐例如钠盐的形式提供和使用。
优选的荧光剂种类是：二苯乙烯基联苯化合物，例如，Tinopal(商标)CBS-X，二胺二苯乙烯二磺酸化合物，例如，Tinopal DMS pure Xtra和Blankophor(商标)HRH，及吡唑啉化合物，例如，Blankophor SN。
优选的荧光剂是：2-(4-苯乙烯基-3-磺基苯基)-2H-萘酚[1,2-d]三唑钠、4,4'-双{[(4-苯胺基-6-(N-甲基-N-2-羟乙基)氨基-1,3,5-三嗪-2-基)]氨基}二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠、4,4'-双{[(4-苯胺基-6-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)]氨基}二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠和4,4'-双(2-磺基苯乙烯基)联苯二钠。
组合物中使用的一种或多种荧光剂的总量优选为0.0001至0.5重量％，更优选0.005至2重量％，最优选0.05至0.25重量％。
在优选的实施方案中，本发明的组合物优选包含至少一种另外的酶。如果存在，则本发明的洗衣组合物中每种酶的含量为0.0001重量％至0.1重量％，优选0.005至0.1重量％。另外的酶优选选自蛋白酶、α-淀粉酶、其他纤维素酶(除如提交的权利要求中所限定的本发明所指定的那些之外的纤维素酶)、脂肪酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶或其混合物。
在特别优选的实施方案中，所述至少一种另外的酶选自蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶。
在优选的实施方案中，本发明的组合物优选包含至少一种助洗剂，其优选选自钙螯合剂材料、沉淀材料、钙离子交换材料及其混合物。
优选的钙螯合剂助洗剂材料包括碱金属聚磷酸盐，如三聚磷酸钠，和有机螯合剂，如乙二胺四乙酸。
优选的沉淀助洗剂材料包括正磷酸钠和碳酸钠。
优选的钙离子交换助洗剂材料包括各种类型的水不溶性结晶或无定形硅铝酸盐，其中沸石是众所周知的代表，例如，沸石A、沸石B(也称为沸石P)、沸石C、沸石X、沸石Y以及如EP-A-0,384,070中所述的P型沸石。
在优选的实施方案中，本发明的组合物优选包含0.001至65重量％，优选0.01至50重量％，进一步优选0.1至35重量％，最优选0.5至30重量％的助洗剂或络合剂如乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基琥珀酸或链烯基琥珀酸或者次氮基三乙酸。
优选地，洗衣清洁制剂是非磷酸盐构建的洗衣清洁剂制剂，即含有小于1重量％，优选小于0.8重量％，进一步优选小于0.5重量％的磷酸盐，其中0.001至5重量％和0.001至1重量％的范围也是优选的。
在优选的实施方案中，本发明的组合物优选包含一种或多种聚合物。实例聚合物是聚乙烯亚胺、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、羧甲基纤维素、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和月桂基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。优选的聚合物是聚乙烯亚胺。
本发明还涉及洗涤白色织物的方法，该方法包括使织物与包含如本申请中限定的组合物的水溶液接触。在优选的实施方案中，织物与水溶液的接触在60℃或更低，50℃或更低，40℃或更低，30℃或更低，优选25℃或更低，最优选22℃或更低的温度下进行。
如本文所述，本发明组合物中的纤维素酶在较高温度下可以是稳定的，但在较低温度下显示出良好的活性。较低温度的洗涤可能是优选的，因为它们更环保、更经济并且通常较少可能损坏织物和饰边。
具体实施方式
实施例
现在通过以下实施例和附图描述本发明。实施例和附图仅用于说明目的，而不应理解为限制本发明。
附图列表
图1显示实施例4的结果：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11的dL*值的比较。
图2显示实施例5的结果：应用不同的纤维素酶变体导致不同的L+值，表明本发明的纤维素酶SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO 17的不同ARD效应。
图3显示实施例6的结果：SEQ ID NO：11与相比的对于地毯污垢(carpet soil)的ARD洗涤活性。
图4显示实施例8的结果：在20℃下应用浓度0.625mg/L的SEQ ID NO：11导致4.5的dL*值。
图5显示实施例9的结果：SEQ ID NO：11的最佳温度。
图6显示实施例10的结果：SEQ ID NO：11的最佳pH。
图7显示实施例11的结果：SEQ ID NO：11的热稳定性。
图8显示实施例12的结果：SEQ ID NO：11、和/或AV50的dL*值的比较。
图9显示了实施例13的结果：多次机洗研究中白度效应的持久性。
实施例1：巴斯德毕赤酵母中纤维素酶的纤维素酶表达
对于蛋白质(以下方法是指例如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：1)的表达，首先将相应的基因(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：16)克隆到标准载体中。因此，用具有限制性位点的引物作为突出端通过PCR扩增这两个基因。根据供应商手册连接用KpnI和XbaI消化的PCR产物和载体(pGAPZαA，pPICZαA；InvitrogenTM)。得到的载体列于表1中。
表1:质粒名称和描述
质粒名称 描述
pGAP-SEQ ID NO:1 具有SEQ ID NO:1的pGAPZαA
pAOX-SEQ ID NO:1 具有SEQ ID NO:1的pPICZαA
pGAP-SEQ ID NO:15 具有SEQ ID NO:15的pGAPZαA
pAOX-SEQ ID NO:15 具有SEQ ID NO:15的pPICZαA
在用BglI线性化后，根据供应商手册将载体转化到X-33菌株(InvitrogenTM)中。对于每种质粒，筛选96个转化体用于在深孔板中的高蛋白质产生。从每个转化体系列，在300ml摇瓶中培养最好的5-10个克隆(50ml YP基础培养基，含1％甘油；27℃，250rpm，80％湿度；40小时、48小时、66小时和72小时后2ml投量(shots)的甘油或甲醇；96小时后收获)用于进行验证。最后用Azo-CMC Assay(Megazyme，Ireland)测定蛋白质的活性。
实施例2:通过目标条带的凝胶定量测定酶浓度
使用外部蛋白质校准曲线，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15和SEQ ID NO：17发酵上清液通过自有的SDS凝胶定量方法定量。将酶样品应用于SDS凝胶，其随后用Sypro Ruby(Thermo Fisher：S12000)染色。在标准Bio-Rad凝胶记录仪器上记录凝胶图像。使用ImageLab软件(Bio-Rad)进行图像分析。使用在相同SDS凝胶上的外部蛋白质校准曲线(例如BSA；牛血清白蛋白)，通过目标蛋白质的特异性SDS凝胶条带的信号积分来确定蛋白质浓度。
实施例3:使用比酶活性在发酵上清液中的纤维素酶定量
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11通过Ni-NTA纯化，以及然后使用Superdex 75 10/300GL柱的尺寸排阻色谱纯化至均质。蛋白质序列通过完整质量测定(intact massdetermination)和N-末端测序实验地确定。均质样品的蛋白质定量使用从实验确定的蛋白质序列计算的摩尔消光系数通过具有UV280信号检测的HPLC进行。简而言之，HPLC运行如下进行。将蛋白质应用于末端加盖的Nucleosil C4柱，并通过缓冲液A(90％水，10％乙腈，0.1％TFA)和缓冲液B(100％乙腈，0.1％TFA)的线性梯度洗脱。峰值UV280信号进行积分以计算蛋白质浓度。使用改良的96孔启用(enabled)Cellazyme C测定(Megazyme)测量纯化的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11样品或粗蛋白上清液的体积酶活性(volumetric enzymeactivity)。使用尺寸排阻色谱纯化的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11的比活性和摩尔活性来计算粗发酵上清液中的目标蛋白浓度。
实施例4:纤维素酶的ARD(抗再沉积)洗涤活性
纤维素酶的活性在Tergotometer尺度的ARD洗涤试验中测试。将白色棉布样品(T460-40，测试材料中心B.V.3133KT Vlaardingen，荷兰)在40℃下在800mL中洗涤4次20分钟。洗涤液由在具有限定的法国硬度27，Ca:Mg 2:1的水中1.5g/L剂量的清洁剂AATCC WOB93组成。向每个洗涤循环中加入8个用炭黑和橄榄油玷污的新棉布样品(8×10cm；101swissatest Testmaterialien AG，9015St Gallen，瑞士)作为污垢载荷(soilballast)。通过添加棉织物80A和10A(wfk Testgewebe GmbH，41379Brüggen，德国)作为载荷将液-布比率设置为25。白色棉布样品的L*a*b*值使用具有D65,10°的分光光度计(ColorFlex EZ，Hunterlab)在空气中干燥编织品后记录。在测量之前使用提供的白色标准品校准仪器。dL*值通过从用纤维素酶处理的棉布样品的L*减去没有酶的空白对照的L*来计算。dL*反映了织物的白度，因此较高的dL*表明酶的较高ARD效应。酶作为活性酶蛋白(AEP)的mg加料。基于比酶活性计算每种制剂的AEP含量。如实施例3中所述进行蛋白质定量。酶制剂的剂量是每升洗涤液0.625mg活性酶蛋白，且对照样品不含酶。
结果显示在图1中。与SEQ ID NO：1(2.94)相比，应用具有相同蛋白质浓度的酶对于SEQ ID NO：11产生更高的dL*值(3.85)，表明SEQ ID NO：11的提高的ARD效应。
实施例5:纤维素酶变体的ARD(抗再沉积)洗涤活性
纤维素酶活性在Tergotometer尺度的ARD洗涤试验中测试。将白色棉布样品(T460-40，测试材料中心B.V.3133KT Vlaardingen，荷兰)在40℃下在800mL中洗涤4次20分钟。洗涤液由具有测定的法国硬度27，Ca:Mg 2:1的水中1.5g/L剂量的清洁剂AATCC WOB93组成。向每个洗涤循环中加入8个用炭黑和橄榄油玷污的新棉布样品(8×10cm；101swissatest Testmaterialien AG，9015St Gallen，瑞士)作为污垢载荷。通过添加棉织物80A和10A(wfk Testgewebe GmbH，41379Brüggen，德国)作为载荷将液-布比率设置为25。白色棉布样品的L*a*b*值使用具有D65,10°的分光光度计(ColorFlex EZ，Hunterlab)在空气中干燥纺织品后记录。在测量之前使用提供的白色标准品校准仪器。dL*值通过从用纤维素酶处理的棉布样品的L*减去没有酶的空白对照的L*来计算。dL*反映了织物的白度，因此较高的dL*表明酶的较高ARD效应。酶作为活性酶蛋白(AEP)的mg加料。基于SDS-PAGE(其应用于蛋白质定量(实施例2))计算每种制剂的AEP含量。酶制剂的剂量是每升洗涤液1.5mg活性酶蛋白，且对照样品不含酶。
结果显示在图2中。应用不同的纤维素变体导致不同的L+值，表明纤维素变体的不同ARD效应。
实施例6:酶用于地毯污垢的ARD(抗再沉积)洗涤活性
纤维素酶活性在Tergotometer尺度的ARD洗涤试验中测试。将白色棉布样品(T460-40，测试材料中心B.V.3133KT Vlaardingen，荷兰)在35℃下在800mL中洗涤7次20分钟。洗涤液由具有设定为26的法国硬度，Ca:Mg 2:1的水中2g/L剂量的清洁剂AATCCliqD组成。通过添加棉织物80A和10A(wfk Testgewebe GmbH，41379Brüggen，德国)作为载荷将液-布比率设置为29。作为污垢，10g/L地毯污垢wfk 09W(wfk Testgewebe GmbH,41379,Brüggen,德国)在每个洗涤循环中添加到洗涤液中。
酶以0.625mg/L的浓度(AEP；活性蛋白；实施例2)加料。白色棉布样品的L*a*b*值使用具有D65,10°的分光光度计(ColorFlex EZ，Hunterlab)在空气中干燥纺织品后记录。在每次测量之前，每天用所提供的白色标准品(Hunterlab)校准仪器。通过从用纤维素酶处理的棉布样品的L*减去没有酶的空白对照的L*来计算dL*值。dL*给出织物的白度，较高的dL*因此指示酶的较高ARD效应。
结果显示在图3中。与在无酶处理的情况下洗涤的织物相比，SEQ ID NO：11显示具有～2的dL*的正ARD效应。另一方面，5000L对地毯污垢平均显示出最小的负ARD洗涤效应。
实施例7:纤维素酶与液体清洁剂应用的Launder-O-meter测试测试如WO 2016066896中所公开的进行。如实施例1中所述，在巴斯德毕赤酵母中产生纤维素酶(SEQ IDNO：11)，并用AATCCliq清洁剂在40℃下测试它们的性能。监测器(monitor)E-253用于呈现代表用过的棉纺织品的去球效果。将测试织物切成包含各种颜色(黑色、红色、绿色、蓝色)的全宽度条纹的样品(约29cm×15-16.5cm，两个样品的总重量约24g)。
纤维素酶处理如下在Atlas LP-2Launder-O-meter(SDS Atlas，Rock Hill，SC29732，USA)中进行。Launder-O-meter首先预热至40℃。随后，将60g钢球(直径0.6cm)及240ml洗涤液和稀释的酶(<1.0ml)加入1.2升容器中。之后，将一个E-253样品放入容器中，并将Launder-O-meter在40℃下运行60分钟。
将酶作为活性酶蛋白(AEP)的mg加料。基于应用于蛋白质定量的SDS-PAGE(实施例2)计算每种制剂的AEP含量。酶制剂的剂量为每升洗涤液0.4mg活性酶蛋白，而对照样品不包含酶。洗涤液含有5g AATCCliq/升合成自来水(16°dH)。如WO 2016 066896所述在实施例4中制备具有16°dH的硬度的合成自来水的制剂。在Launder-O-meter中的纤维素酶处理之后，首先在流水(约20℃环境温度)下单独冲洗样品和然后在旋转干燥器(THOMAS，Neunkirchen；型号：776SEL 202)中干燥5分钟。
通过使用分光光度计(ColorFlex EZ，Hunterlab)测量作为反射率值的颜色，使用L*a*b*色度空间坐标来评估清洁剂应用中的纤维素酶性能。在5个洗涤循环后测量监测器每4条测试的颜色。与没有纤维素酶的处理相比的亮度(L*)降低(即暗度增加)用作纤维素酶作用的指示。当通过纤维素酶除去形成毛球并使织物具有变灰外观的从纱线突出的表面纤维和小纤维时，织物的亮度降低，并且织物的表面看起来更暗并且颜色变得更亮(WO2016 066896)。
根据WO 2016 066896在实施例4中计算纤维素酶性能。监测器上所有4个测试条的L*值的总和表现为负的(-2.50)。如上所述，负L*值表示去除从形成毛球、给予织物变灰的外观的纱线突出的纤维和小纤维。通过视觉评估也证实了分光光度计结果。
实施例8:20℃下纤维素酶的ARD(抗再沉积)洗涤活性
在20℃下在Tergotometer尺度的ARD洗涤试验中测试SEQ ID NO：11的活性。将白色棉布样品(WK05，wfk Testgewebe GmbH，41379Brüggen，Germany)在20℃下在800mL中洗涤20分钟。洗涤液由在具有限定的法国硬度26，Ca：Mg 2:1的水中0.72g/L剂量的清洁剂IKEA12组成。向每个洗涤循环加入0.04g/L。
IKEA 12的组成
成分 Wt.％
去离子水 至100
TEA 1.95
NaOH 1.28
Gulf Farabi LAS(直链烷基苯磺酸盐) 11.33
Texapon N701(1EO)(非离子表面活性剂) 7.17
Proxel GXL(1,2-苯并异噻唑啉-3-酮) 0.02
Neolone 950(甲基异噻唑酮) 0.01
NaCl 1.00
通过添加纺织棉织物作为载荷将液-布比率设定为33。在25℃，10％湿度下干燥织物过夜后，在具有D65,10°的分光光度计(ColorFlex EZ，Hunterlab)中记录白色棉布样品的L*a*b*值。在测量之前使用提供的白色标准品校准仪器。通过从用纤维素酶处理的棉布样品的L*中减去没有酶的空白对照的L*来计算dL*值。dL*反映织物的白度，因此较高的dL*表明酶的较高ARD效应。将酶作为活性酶蛋白(AEP)的mg加料。基于实施例2中描述的方法计算每种制剂的AEP含量。酶制剂的剂量是每升洗涤液0.625mg活性酶蛋白，且对照样品不包含酶。
结果显示在图4中。以0.625mg/L的浓度应用SEQ ID NO：11导致4.5的dL*值。
实施例9:SEQ ID NO:11的最佳温度的确定
为了确定最佳温度，将在100mM乙酸钠缓冲液(pH 5)中的100μL酶溶液与100μL1％羧甲基纤维素水溶液混合，并在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和99℃下孵育10分钟，摇动。通过将反应混合物在95℃下孵育5分钟来终止反应。通过使用对羟基苯甲酰肼测定法测量释放的还原端来测定活性。
对于还原末端测定，将在0.5M HCl中的5％(w/v)对羟基苯甲酰肼原液在0.5MNaOH中1：3稀释以得到对羟基苯甲酰肼工作溶液。将50μL样品与150μL工作溶液混合，并将反应在95℃下孵育5分钟。在冷却至4℃后，测定410nm处的吸光度，并使用葡萄糖校准曲线计算释放的还原末端。
结果显示，SEQ ID NO：11保证了在与清洁和洗涤应用相关的所有温度下的活性。即使在低温下，也保持超过20％的活性。
实施例10:SEQ ID NO:11的最佳pH的测定
为了测定最佳pH，将酶原液稀释于分别调节至pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的120mM Britton-Robinson通用缓冲液中。将100μL的这些稀释液与100μL 1％羧甲基纤维素水溶液混合，并在70℃下孵育10分钟，振摇。通过将反应混合物在95℃下孵育5分钟来终止反应。如实施例9中所述，通过使用对羟基苯甲酰肼测定法测量释放的还原端来测定活性。
结果显示SEQ ID NO：11保证了在宽pH范围内的活性，并且在高/碱性pH值(高达pH9)(这与洗涤和清洁应用相关)下仍显示出非常好的活性。
实施例11:SEQ ID NO:11的最佳温度和pH及热稳定性的测定为了测定温度稳定性，在100mM乙酸钠缓冲液pH 5中的100μL酶溶液在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和99℃下孵育30分钟。将溶液冷却至4℃。随后，加入100μL的1％羧甲基纤维素水溶液，并将样品在50℃下孵育10分钟。通过加入40μL 1M碳酸钠溶液终止反应。如实施例9中所述，通过使用对羟基苯甲酰肼测定法测量释放的还原末端来测定活性。
结果表明，SEQ ID NO：11保证了优异的温度稳定性，显示出在宽温度范围内的活性。
实施例12:SEQ ID NO:11、和/或AV50关于dL*的比较和协同效应的证明
Tergotometer洗涤研究
洗涤过程中使用的条件如下：
温度:20℃
酶浓度:0.625ppm
产品剂量:0.72gpl IKEA12
污垢剂量:0.04gpl炭黑
补色染料剂量:0.006％AV50
洗涤时间:1x 20分钟洗涤
清洗时间:1x 10秒清洗
该实施例表明，纤维素酶SEQ ID NO：11与补色染料(AV50)的组合在白度方面提供了超过和高于由SEQ ID NO：11、和补色染料单独提供的效果的协同效应。
值得注意的是，与补色染料和的组合相比，纤维素酶SEQ ID NO：11与补色染料(AV50)的组合提供了协同益处(测量的值相对于计算的值)，其中测量的值低于计算的白度值。结果如图8所示。
实施例13:白度益处的持久性
多次机洗研究
使用的棉布监测器通过用OMO粉末洗涤20次来预老化。1次、3次、5次、10次、15次、20次、25次和30次的每个洗涤点使用3个重复。使用的污垢监测器由3x E101监测器组成。织物在一系列制剂+/-和AV50(补色染料)中洗涤以评估是否由于存在酶而对再沉积具有任何改善。用于该研究的机器是Asian TLA 45L。洗涤在40℃26FH(2:1Ca：Mg)45L洗涤液中进行，并且使用的载荷为1.5kg。
该实施例表明，与相比，对于纤维素酶SEQ ID NO：11增强的白度效应在多(30)次洗涤中持续。在针织的老化棉布上显示出效果，并且基础制剂是OMO粉末。在Δ460反射率值处显示的值从未洗涤的织物标准化，因此它们作为负值给出。较小的负值意味着洗涤的织物更接近原始未洗涤的值。图9以图形格式显示了下表中的一些选择的结果(对于OMO、OMO+和OMO+SEQ ID NO：11)。
本发明中确定的序列：
SEQ ID NO:1包含催化结构域基序[STA]-T-R-Y-[FYW]-D-x(5)-[CA]的序列
SEQ ID NO:2SEQ ID NO:1的对应核苷酸序列
SEQ ID NO:3碳水化合物结合结构域
SEQ ID NO:4SEQ ID NO:3的对应核苷酸序列
SEQ ID NO:5接头序列
SEQ ID NO:6SEQ ID NO:5的对应核苷酸序列
SEQ ID NO:7接头序列
SEQ ID NO:8SEQ ID NO:7的对应核苷酸序列
SEQ ID NO:9优选的催化结构域基序T-T-R-Y-W-D-C-C-K-P-S-C
SEQ ID NO:10SEQ ID NO:9的对应核苷酸序列
SEQ ID NO:11根据本发明的优选纤维素酶
SEQ ID NO:12SEQ ID NO:11的对应核苷酸序列
SEQ ID NO:13根据本发明的优选纤维素酶
SEQ ID NO:14SEQ ID NO:13的对应核苷酸序列
SEQ ID NO:15根据本发明的优选纤维素酶
SEQ ID NO:16SEQ ID NO:15的对应核苷酸序列
SEQ ID NO:17根据本发明的优选纤维素酶
SEQ ID NO:18SEQ ID NO:17的对应核苷酸序列
SEQ ID NO:19优选的碳水化合物结合结构域标签
SEQ ID NO:20SEQ ID NO:19的对应核苷酸序列

Claims (14)

1.包含催化结构域基序[STA]-T-R-Y-[FYW]-D-x(5)-[CA]和与SEQ ID NO：3具有至少80％的序列同一性的碳水化合物结合结构域或包含标签基序V-[PSC]-[DQEN]-S-G-G-P-G-P-G-P-G-P-G-P的碳水化合物结合结构域的纤维素酶。
2.根据权利要求1的纤维素酶，其中所述催化结构域基序是T-T-R-Y-[FYW]-D-x(5)-[CA]。
3.根据权利要求1或2的纤维素酶，其中所述催化结构域基序是T-T-R-Y-W-D-x(5)-C。
4.根据权利要求1-3任一项的纤维素酶，其中所述催化结构域基序是T-T-R-Y-W-D-C-C-K-P-S-C。
5.根据前述权利要求任一项的纤维素酶，包含与SEQ ID NO：1具有至少80％的序列同一性的序列。
6.根据前述权利要求任一项的纤维素酶，还包含接头。
7.根据权利要求6的纤维素酶，其中所述接头与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性。
8.根据权利要求6的纤维素酶，其中所述接头与SEQ ID NO：7具有至少80％的序列同一性。
9.根据权利要求6或7的纤维素酶，其中所述接头包含[AGSVT](5,65)的氨基酸序列。
10.根据权利要求8的纤维素酶，其中所述接头包含([SG]-P)(5,10)的氨基酸序列。
11.如权利要求1-10中任一项所限定的纤维素酶在纺织品、饲料、食物、生物质水解、植物油精炼、清洁剂及纸浆和纸加工应用中的用途。
12.根据权利要求11的纤维素酶的用途，其用作生物整理剂如去球剂或脱毛剂；生物石磨剂；织物护理剂如颜色澄清剂、抗变灰剂、软化剂、抗起球剂；洗衣剂如抗再沉积剂、去污剂；制麦和酿造剂如过滤剂、颜色提取剂；烘焙试剂如质构剂；饲料试剂如粘度降低剂；水果加工剂如抗氧化剂释放剂、压制剂、颜色提取剂、果汁澄清剂；植物油提取剂；纸浆和纸加工剂如脱墨剂、纤维增亮剂、助滤剂和/或漂白剂。
13.包含如权利要求1-10任一项限定的至少一种纤维素酶的组合物。
14.根据权利要求13的组合物，还包含至少一种表面活性剂、助洗剂、共助洗剂、抗再沉积剂、分散剂、光亮剂、漂白剂、染料、酶、螯合剂、聚合物、pH缓冲剂、填充剂、絮凝剂、织物软化剂、泡沫促进剂、香料、起泡抑制剂、杀菌剂、杀真菌剂、酶抑制剂、稳定剂、增溶剂、抗氧化剂、抗腐蚀剂和/或色素。
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