CN110331107A - 一种地衣芽孢杆菌制剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌制剂及制备方法。以豆腐黄浆水为培养基发酵制备发酵液，按质量比4wt%的蔗糖，10wt%淀粉以及86wt%的地衣芽孢杆菌BL14发酵液，通过冷冻干燥获得。该菌制剂中菌BL14的存活率高达94.69%，在人工模拟胃液和胰液环境中37℃处理4h后，菌存活率保留19.35%和84.94%，内切葡聚糖酶活力保存率分别为27.50%和77.46%，检测到的菌落数分别为3.3*10⁷（cfu/ml）和13.3*10⁷（cfu/ml）。该菌制剂对猪饲料、鸡饲料和牛饲料有显著的糖化作用，添加至猪、鸡和牛等畜禽饲料中，有望提高畜禽对饲料的吸收利用效率。

Description

一种地衣芽孢杆菌制剂及制备方法

技术领域

本发明属于菌制剂技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌制剂及制备方法。

背景技术

地衣芽孢杆菌能够产生多种生物活性物质，包括多糖、蛋白质、非肽类物质和一些小分子活性物质。可调整菌群失调达到治疗目的，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖，通过调整菌群失调达到治疗腹泻腹痛的目的能改善肠道健康、提高宿主免疫力和抗氧化活性指标，促进动物生长、提高动物生产性能。2008年公布的《饲料添加剂品种目录》中，地衣芽孢杆菌被批准为饲用微生物添加剂，被认为是较为理想的工业生产菌株。

豆腐黄浆水，是豆腐在生产过程中形成的豆腐沥水，其产生量是大豆干重的3-5倍。豆腐黄浆水固形物含量约占1%，主要由可溶性蛋白质、低聚糖、维生素、脂类、微量元素等组成。豆腐黄浆水是豆腐废水的主要组成部分，对豆腐黄浆水进行开发利用，则可以减少其对环境的污染，帮助企业节约处理污水产生的高成本的同时，产生出附加的有价值的产品。

本发明以豆腐黄浆水为发酵原料，生产出地衣芽孢杆菌制发酵液，通过最佳芽孢形成率发酵工艺参数筛选、保护剂和载体、加入量以及干燥工艺筛选，获得地衣芽孢杆菌制剂及制备工艺，为地衣芽孢杆菌制剂更好的应用于畜禽养殖，提高饲料中纤维素的糖化过程，提高畜禽对饲料的吸收利用效率提供帮助。

发明内容

本发明的目的在于提供一种地衣芽孢杆菌制剂及制备方法。本发明的地衣芽孢杆菌制剂制成粉末，其中地衣芽孢杆菌菌存活率高，为该菌制剂更好的应用于畜禽饲料，提高饲料中纤维素的糖化作用，提高畜禽对饲料的吸收利用效率提供帮助。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种地衣芽孢杆菌制剂，原料包括：地衣芽孢杆菌BL14发酵液，蔗糖、淀粉；按重量百分数计包括：地衣芽孢杆菌制剂发酵液86%、蔗糖 4%、淀粉 10%。

一种地衣芽孢杆菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）地衣芽孢杆菌BL14母液的制备：将20%甘油保存的地衣芽孢杆菌BL14按 1wt%的接种量接种入基础培养基中（蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、氯化钠5 g/L、pH7.0，121℃高压灭菌25min）,37℃ 160r/min恒温培养24h，得菌BL14母液。

（2）地衣芽孢杆菌制剂发酵液的制备：以豆腐黄浆水为培养基，加浓度为10wt%的NaOH溶液调节豆腐黄浆水的pH值至7.0，121℃高压灭菌30min，按 1wt%的接种量接种地衣芽孢杆菌制剂BL14母液，160r/min，35℃恒温培养48h，使其达到最高值，获得芽孢形成率大于80%的地衣芽孢杆菌制剂BL14发酵液；

（3）按质量百分比为步骤（1）制得的发酵液86%，蔗糖4%，淀粉10%，将三种原料混合均匀，采用-80℃预冷冻，温度-50℃，真空度23帕冷冻干燥工艺干燥48h，得地衣芽孢杆菌制剂。

一种地衣芽孢杆菌制剂在畜禽饲料中的应用。

本发明的有益效果在于：

通过发酵时间和发酵温度筛选，获得在35℃恒温培养72h后，地衣芽孢杆菌制剂BL14的芽孢形成率最佳，通过对不同保护剂及载体的筛选，获得加入量为4%的蔗糖保护剂和10%淀粉载体对地衣芽孢杆菌制剂BL14有很好的保护作用，通过不同的干燥工艺筛选，获得冷冻干燥工艺对枯草芽孢杆菌存活率保护效果最好，该菌制剂经人工模拟胃液和胰液后，菌落数每毫升依然保留有高达10⁷活菌数。该菌制剂可显著促进猪饲料、牛饲料和鸡饲料中纤维素向多糖的转化，有利于提高畜禽对饲料的吸收利用效率，可应用于畜禽养殖领域，具有极好的应用价值。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

所用蔗糖和淀粉为市场上购买获得，所用的黄浆水为豆腐加工厂在豆腐加工过程中废弃的豆腐沥水，本发明中的地衣芽孢杆菌制剂BL14为实验室自有菌种，具体实施技术如下。

实施例1 最佳芽孢形成率的获得

1.1 发酵时间对菌产芽孢的影响

地衣芽孢杆菌BL14母液的制备：将20%甘油保存的地衣芽孢杆菌BL14，按1wt%的接种量接种入基础培养基中（：蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、氯化钠5 g/L、pH7.0，121℃高压灭菌25min）,37℃ 160r/min恒温培养24h，得菌BL14母液。

将地衣芽孢杆菌BL14发酵母液根据1wt%的接种量置于豆腐黄浆水培养基中，160r/min，37℃恒温培养，分别于培养12、24、36、48、72、96h时取样，采用孔雀绿染色法对产生的芽孢进行计数，根据芽孢（绿色）和营养细胞（红色）计算芽孢产生率，计算公式为：芽孢产生率=芽孢数/(芽孢数+营养细胞数）*100%，结果见1。菌BL14在发酵至48h时，芽孢产生率最高，达到70.99%。

表1 不同培养时间芽孢形成率（%）

1.2不同温度条件下地衣芽孢杆菌BL14的芽孢形成率

制备菌BL14母液，按1wt%的接种量接种于豆腐黄浆水培养基中，分别置于20、25、30、35和40（℃）温度条件下培养，160r/min培养，菌BL14在发酵至48h时，取样检测芽孢数，结果见表2。可知，菌BL14在发酵温度为35℃时芽孢形成率最佳，为82.01%。

表2 不同培养温度条件下芽孢形成率 （%）

实施例2 保护剂筛选

2.1最佳保护剂种类的筛选

以豆腐黄浆水为培养基发酵按实施例1的最佳条件制备BL14发酵液，在100ml的发酵液中分别加入10 wt%甘油，10 wt%脱脂奶粉，10wt %海藻糖，10wt %麦芽糊精，10 wt%蔗糖，0.5 wt%海藻酸钠，在25℃下常温烘干，将干燥后的各样品重新定容至100ml，取1ml加入9mL生理盐水，稀释至不同倍数，平板涂布，测定菌落数，以烘干前为对照，计算存活率，存活率=（烘干样品定容后1ml样液的活菌数/发酵液加入保护剂前1ml样液的活菌数）*100%。结果见表3：从表中可知，蔗糖对地衣芽孢杆菌BL14保护效果最佳，经过常温烘干后，菌的存活率可达91.1±2.5%，显著高于其他处理。

表3.不同保护剂对菌的存活率影响

2.2 最佳保护剂加入浓度筛选

以蔗糖为保护剂，在100mL的BL14发酵菌液中加入2wt%-12wt %量的蔗糖，常温烘干后，将烘干样品用100mL的生理盐水稀释，取100ul稀释至-6，-8次方，取100ul涂布计数，菌落数以log₁₀（cfu/ml）计，结果见表4。从表中可知，蔗糖加入量为4wt%时，菌BL14烘干获得的菌落数最大。

表4.最佳保护剂加入量筛选

实施例3 载体筛选

3.1最适载体种类筛选

以豆腐黄浆水为培养基，在实施例1的最佳条件下发酵制备BL14发酵液，在100ml的发酵液中分别加入10wt%麦耚，10wt%米糠，10wt%稻壳，10wt%豆粕，10wt%淀粉，在25℃下常温烘干，将干燥后的各样品重新定容至100ml，取1ml加入9mL生理盐水，稀释至不同倍数，平板涂布，测定菌落数，以烘干前为对照，计算存活率。从表5可知，米糠，稻壳和淀粉对作为载体对地衣芽孢杆菌BL14保护效果较好，三者间不存在显著差异，但以淀粉为载体时，菌的存活率可达92.4±0.9%，因此选淀粉为菌BL14的载体。

表5.不同载体对菌存活率的影响

3.2最适载体加入量筛选

以淀粉为保护剂，在100mL的BL14发酵菌液中加入2wt %-10wt %量的淀粉，常温烘干后，将烘干样品用50mL的生理盐水稀释，取100ul稀释至-6，-8次方，取100ul涂布计数，菌落数以log10（cfu/ml）计，结果见表6。从表中可知，淀粉以加入量为10wt%时，菌BL14烘干获得的菌落数最大。

表6.最佳载体加入量筛选

实施例4 成品制备工艺

以豆腐黄浆水为培养基，在实施例1最佳条件下发酵制备BL14发酵液，在100ml菌BL14中分别加入4wt%蔗糖和10wt%粉淀，混合均匀后，采用以下干燥工艺进行烘干，其中常温烘干：25度，烘干72小时。喷雾干燥：进口温度85度，出口温度60度。冷冻干燥：-80度预冷冻，温度-50度，真空度23帕，干燥48h。60度烘干：60度，烘干24小时,干燥结果见表7。从表7可知，干燥条件较好的工艺为常温干燥和冷冻干燥，由于常温干燥容易使样品出现结块，干燥不均衡等问题，固采用冷冻干燥最最佳干燥工艺。

表7.不同干燥条件对菌保护效果的影响

实施例5 成品成活率计算

分别加最佳保护剂、载体和最佳保护剂和载体的混合物以最佳加入量加入发酵菌液中，冷冻干燥，以未加保护剂和载体的发酵原液为对照。在100ml发酵液中单独加入4wt%蔗糖和10wt%淀粉，以及加入4wt%蔗糖和10wt%淀粉混合物后，冷冻干燥，将干燥后的各样品重新定容至100ml，取1ml加入9mL生理盐水，稀释不同倍数后进行菌落计数。结果见表8，与原液相比，加入保护剂和载体存活率显著提高，统计显示加入的三处理间未见有显著差异，单独加入4wt%蔗糖和10wt%淀粉，以及加入蔗糖和淀粉保护剂混合物保护后，与未加相比，存活率显著提高，统计显示加入的三处理间未见有显著差异，加入蔗糖+淀粉的混合物后菌BL14的存活率可高达94.49%，菌落数达9.8*10⁸（cfu/ml)。

表8.几种保护剂在冷冻干燥条件下各菌存活率

实施例6. 酶菌制剂体外胃肠模拟环境存活状况分析

肠道模拟实验：分别向450mL人工胃液（KCl 6.9mmol/L、KH₂PO₄ 0.9 mmol/L、NaHCO₃ 25mmol/L、NaCl 47.2 mmol/L、MgCl₂ 0.1 mmol/L、(NH4）₂CO₃ 0.5mmol/L、CaCl₂ 0.075 mmol/L,用HCl调节pH值至3.0，临用前加入胃蛋白酶至2000U/mL）和人工肠液（KCl 6.8mmol/L、KH₂PO₄ 0.8 mmol/L、NaHCO₃ 85 mmol/L、NaCl 38.4 mmol/L、MgCl₂ 0.33 mmol/L、CaCl₂ 0.6mmol/L，用HCl调节pH值至7.0，临用前加入胰蛋白酶至 100U/mL。）中加入50g的BL14菌制剂，ZRS-8GD智能溶出实验仪器设定温度37℃，搅拌速度120转/min，分别于0h，2h，4h时取出5mL样品，待测。取1mL样品与9mL生理盐水中，稀释至10^-5，再取100uL涂布。菌落计数计算存活率，DNS法检测分析内切葡聚糖酶活力保持情况。结果见表9，从表中可知，经过人工模拟胃液处理后，菌BL14的存活率出现了明显的下降，处理2h后，存活率分别为22.29 %，菌落数分别为3.8*10⁷ cfu/ml，经过处理后内切葡聚糖酶酶活的保存率也出现了明显的下降，但下降幅度低于菌落数。经过人工模拟胰液环境后，菌BL14受胰液影响较小，处理4h后，存活率高达84.94%，菌落数达13.3*10⁷ cfu/ml，内切葡聚糖酶活性保持率为77.46%，处于较高水平。

表9.菌制剂体外模拟胃液和胰液的存活状况分析

实施例7. 酶菌制剂对高纤维物质的糖化力检测

选取猪饲料（福建省华龙集团饲料有限公司）、鸡饲料（福建省华龙集团饲料有限公司）和牛饲料（河北冀泰饲料有限公司）为糖化标的，将各饲料与水按质量比1:1的比例加水混合均匀，分别称取100g各类处理饲料接种5wt%的BL14地衣芽孢杆菌制剂，置于37℃恒温发酵，在0、2、9、12、24（h）取样检测总糖含量，每一处理三个重复，结果见表8。从表中可知：与未发酵相比，经过2h发酵后，所有饲料的总糖含量都出现了显著的上升，说明菌BL14对各饲料中的纤维素有糖化效果，添加菌制剂将有利于畜禽对饲料的吸收利用效率。总体上，菌BL14对猪饲料的碳化力在培养2h时就出现显著的差异，在之后的培养中总糖含量基本未出现显著差异，这可能与总糖被菌进一步的代谢有关；发酵后，鸡饲料在发酵2-12h总糖含量先后达到最高值，在发酵24h后，出现了显著的下降，推测总糖被菌进一步的代谢导致；牛饲料发酵后，直到发酵24h，牛饲料的总糖一直呈上升趋势，这可能与牛饲料中纤维素含量高有关。

表10 酶菌制剂的对饲料的糖化力（mg/mL）

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种地衣芽孢杆菌制剂，其特征在于：原料包括地衣芽孢杆菌BL14发酵液，蔗糖、淀粉；按重量百分数计包括：地衣芽孢杆菌制剂发酵液86%、蔗糖 4%、淀粉 10%。

2.如权利要求1所述一种地衣芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）地衣芽孢杆菌BL14母液的制备：将20%甘油保存的地衣芽孢杆菌BL14按 1wt%的接种量接种入基础培养基中，37℃ 160r/min恒温培养24h，地衣芽孢杆菌BL14母液；

（2）地衣芽孢杆菌制剂发酵液的制备：以豆腐黄浆水为培养基，加浓度为10wt%的NaOH溶液调节豆腐黄浆水的pH值至7.0，121℃高压灭菌30min，按 1wt%的接种量接种地衣芽孢杆菌制剂BL14母液，160r/min，35℃恒温培养48h，获得芽孢含量大于80 %的地衣芽孢杆菌制剂BL14发酵液；

（3）按重量百分比为步骤（1）制得的发酵液86%，蔗糖4%，淀粉10 %将三种原料混合均匀，采用-80℃预冷冻，温度-50℃，真空度23帕的冷冻干燥工艺干燥48h，得地衣芽孢杆菌制剂。

3.一种如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌制剂在畜禽饲料中的应用。