CN110327131A - 大气颗粒物毒性效应的组织代谢网络研究方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大气颗粒物毒性效应的组织代谢网络研究方法，其包括如下步骤：S1、采集研究地区的大气颗粒物，配制成大气颗粒物悬浊液；S2、将所述大气颗粒物悬浊液气管滴注到受试动物体内，模拟人体大气颗粒物暴露；S3、实验周期结束后，采集受试动物的肝脏、肺以及血清；S4、通过液相色谱质谱联用平台对肝脏、肺以及血清进行代谢组分析，分别确定肝脏、肺和血清的标记代谢物；S5、通过对所述相关性分析和网络分析，确定关键代谢网络，同时利用网络节点中心度评估确定关键标记代谢物。本发明利用网络分析，通过网络模型确定多组织间关键代谢标志物，为不同表型下多组织代谢数据中关键标记代谢物鉴定提供方法，提高代谢标志物鉴定准确性。

Description

大气颗粒物毒性效应的组织代谢网络研究方法

技术领域

本发明涉及大气颗粒物毒性研究领域，特别涉及一种大气颗粒物全身毒性代谢组学评估模型。

背景技术

随着工业化进程不断推进，大气颗粒物(特别是PM 2.5)污染已经成为了备受关注的环境问题。在中国，随着城镇化发展，城市中的汽车尾气、燃煤锅炉供暖、火力发电等大气颗粒物主要污染源越来越多影响着城市居民的健康状态。已有相关流行病学研究表明，大气颗粒物(特别是PM 2.5)暴露与人体肺的功能异常、心血管系统紊乱以及引发炎症状态，与大气颗粒物污染的疾病包括动脉粥状硬化、内皮功能紊乱、阻塞性肺病 (COPD)以及肺功能下降，甚至有部分研究表明大气颗粒物暴露能通过血脑屏障影响人体大脑活动。

但是基于人群的流行病学研究虽然直接针对人体本身进行研究，但是因为研究基质的局限性，大部分研究只能针对人尿液或者血液进行研究，其结果具有一定局限性。动物暴露实验作为研究大气颗粒物毒性一个重要途径，因为动物实验特性能，使得我们能够研究包括肺、肝脏等多个靶器官，目前被广泛应用于大气颗粒物对肺功能毒性效应评估。虽然已有研究利用代谢组学、蛋白组学、转录组学等系统生物学手段分析大气颗粒物暴露对单一靶器官的毒性效应，但是大气颗粒物暴露往往是对有机体产生整体的损害，而尚未有相关代谢组学模型评估大气颗粒暴露引起全身毒性效应的关键标记代谢物。

发明内容

为了直观了解大气颗粒物(尤其是PM2.5)暴露的全身毒性，研究空气污染对人体多个靶器官的毒害作用，获取大气污染全身毒性的关键代谢标记物，本发明以动物作为实验模型，建立一种评估大气颗粒物暴露对有机体关键代谢稳态异常节点的综合分析模型。本发明的主要思路是通过真实环境大气颗粒物气管滴注动物模拟大气颗粒物暴露对人体的毒性效应。通过暴露后动物的肝脏、肺以及血液中代谢标志物的筛选，确认各个样品中受大气颗粒物暴露条件下的差异代谢物，然后通过网络模型构建各组织差异代谢物之间的相关性，确定关键代谢网络以及代谢节点，采用网络节点中心度评估确认大气颗粒物暴露引起的全身毒性效应的主要标记代谢物。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种大气颗粒物全身毒性效应代谢标志物的评估方法，其包括如下步骤：

S1、采集研究地区的大气颗粒物，配制成大气颗粒物悬浊液；

S2、将所述大气颗粒物悬浊液气管滴注到受试动物体内，模拟人体大气颗粒物暴露；

S3、实验周期结束后，采集受试动物的肝脏、肺以及血清；

S4、通过液相色谱质谱联用平台对肝脏、肺以及血清进行代谢组分析，分别确定肝脏、肺和血清的标记代谢物；

S5、通过对所述相关性分析和网络分析，确定关键代谢网络，同时利用网络节点中心度评估确定关键标记代谢物。

作为优选方案，所述大气颗粒物的采集方法为：采用大气颗粒物采样器，将PM2.5颗粒物截留在滤膜上，进行收集。

作为优选方案，所述大气颗粒物悬浊液的制备方法为：将所述大气颗粒物在超声条件下分散于缓冲溶液中，即可，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或生理盐水。

作为优选方案，步骤S3的具体操做方法为：对于肝脏或肺，将受试动物的肝脏、肺或血清至于体积比为1：1的甲醇/水体系中，进行微珠破碎，离心获取含有分子量为 100～1000Da的小分子代谢物的澄清溶液；对于血清样品，采用甲醇作为蛋白质沉淀有机相体系，将血清样品与甲醛按照体积比1:3混合，通过离心除去蛋白，上清液用于后续代谢组学分析。

作为优选方案，步骤S4中，使用高效液相色谱串联高分辨质谱平台进行代谢组学分析，采用反向色谱方法对样品代谢物进行分离，质谱离子源分别采用正负两种模式，利用一级质谱以及二级质谱信息测定确认代谢物分子信息。

作为优选方案，所述差异代谢物确定采用以下方法：

a、采用OPLS-DA进行不同表型下差异代谢轮廓可视化分析，利用OPLS-DA重要性分析确认潜在差异代谢物；

b、在OPLS-DA确认差异代谢物基础上，利用非参数检验Mann-Whitney U对潜在差异代谢物进行均值检验，同时，采用均值变化倍数分析确认潜在差异代谢物在组间的变化状态，将潜在差异代谢物中均值检验具有统计学意义并且具有1.5～2.0倍的代谢物作为各个组织的标记代谢物。

作为优选方案，步骤S5中，使用Spearman等级相关性模型确定各组织标记代谢物的相关系数，利用网络分析模型构建标记代谢物网络。

作为优选方案，所述关键代谢标志物鉴定采用如下步骤：

a、通过设定相关性系数阈值去除代谢弱相关节点连线，确定具有显著统计学意义的节点连线；

b、采用OpenOrd模型核心节点聚类，同时根据连接度参数去除无连线代谢标记物节点；

c、计算代谢网络节点的平均加权度，去除低于平均加权度的代谢节点；

d、通过ForceAtlas模型构建核心代谢网络拓扑图；

f、对核心代谢网络进行模块化分析，确定多组织代谢标记物交互网络，并确定关键代谢标志物。

本发明关键点在于利用多组织高通量代谢组学数据构建有机体全身代谢网络，通过网络分析确定关键代谢网络节点，进而提供了评估动物大气颗粒物全身毒性的可行方案。与此前方法不同，本发明连接了多组织代谢组学数据，通过整体代谢网络方式构建核心代谢网络，从单一层面代谢组学研究拓展到有机体整体代谢变化研究。本发明的核心保护点在于提供融合多组织代谢组学数据的方法，同时提供了其代谢重要性权重分析的手段，为不同表型下有机体整体代谢变化以及核心代谢标记物确定提供了有效的方法。

需要说明的是，上述研究方法不仅局限于估动物大气颗粒物全身毒性，若需要研究其他表型下(疾病或者环境因素影响)生命有机体(动物、植物以及人体样品)整体代谢轮廓差异分析以及标记代谢物的鉴定均可以采用本发明提供的研究方法。

因此，本发明具有如下有益效果：

1.本发明基于传统代谢组学方法开发，其分析方法可能推广至多种代谢组学平台。

2.本发明利用网络模型，融合多样品代谢组学信息，提高了代谢组学数据的解释有机体不同表型下代谢变化的准确性。

3.本发明通过网络模型构建多组织间代谢组学数据结合的通用方法，其为不同样品的组学数据(蛋白组学、基因组学以及转录组学)的结合，以及不同组学数据之间的结合提供了潜在的处理方案。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是实施例1各组织样品代谢物OPLS-DA得分图以及火山图差异分析。其中A、 C和E分别为肺、肝和血清代谢组OPLS-DA得分图，而B、D以及F是潜在差异代谢物的火山图分析，其中将p值(FDR校正)小于0.05，FC大于1.5或小于-1.5的潜在差异代谢物设定为其相应组织的标记代谢物。

图2是实施例1中多组织联合核心代谢网络。其中黑色节点为关键代谢标志物。

图3是关键代谢标志物组合ROC分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1：

本实例设计基于小鼠真实环境PM2.5暴露下全身毒性效应评估以及关键代谢标志物筛选，具体暴露如下步骤：

一、小鼠实际环境PM2.5暴露实验

采用大气细颗粒物采样器，将PM2.5颗粒物截留在滤膜上，获得的颗粒物样品与缓冲溶液(磷酸盐缓冲液或生理盐水)超声制备成一定浓度的悬浊液用于气管滴注，PM2.5 悬浊液浓度根据中国空气质量标准以及小鼠平均体重进行换算。小鼠经过一段时间适应性喂养后通过气管滴注方式暴露大气颗粒物。

二、小鼠组织代谢组样品前处理

急性暴露后，经过一个实验周期后，取小鼠肺器官以及肝脏器官，经过生理盐水洗净后放入超低温冰箱保存。取一定量组织置于1:1甲醇/水提取溶剂中，低温保存数小时，通过微珠破碎仪破碎组织样品，并低温高速离心15分钟，取上清液于真空浓缩仪浓缩并加入提取液1/10体积甲醇水溶液复溶待上机检测。

三、小鼠血清代谢组样品前处理

急性暴露后，经过一个实验周期后，取小鼠全血，室温静置并常温离心。取上清液于离心管中，加入血清体积3倍的甲醇溶液沉淀蛋白。低温离心15分钟，取于真空浓缩仪浓缩并加入提取液1/5体积甲醇水溶液复溶待上机检测。

四、小鼠样品代谢组检测

采用液相色谱质谱联用平台获取小鼠各个组织代谢信息，使用美国沃特世公司超高效液相色谱联用美国赛默飞Q Exactive质谱，采用反向色谱方法分离代谢小分子，分别采用正负两种ESI扫描模式，其扫描范围设定为100-1000Da。同时一级质谱母离子同时进行二级质谱信息鉴定，其中碰撞能CE设定为25V、35V以及45V。获取质谱信息通过赛默飞Compound Discovery软件进行保留时间校正、质谱特征峰离子信息提取以及缺失值填充，同时获得样品相关的离子信息表，以及根据一级二级质谱信息确定的 mzCLOUD得分信息。

通过每个样品等量提取并混合为质控样品(QC)。代谢组学测试前通过QC样品评估仪器稳定性，并且在测试队列中等距离穿插QC样品。在获取离子信息表基础上通过 QC-RLSC模型，根据QC样品信息对仪器衰减造成的峰变化进行校正。

五、各组织代谢标记物鉴定

根据暴露组与对照组，通过多维判别式模型(OPLS-DA)筛选潜在差异代谢物。样品代谢离子信息通过求和归一化获得单一样品中各个代谢物的相对丰度，并且通过 Paretoscaling对校正数据中心化处理。通过SIMCA-P软件构建OPLS-DA模型，利用得分图将不同组代谢轮廓进行可视化分析(如图1)，并且利用VIP确定潜在差异代谢物。设定重要性分析(VIP)阈值，选取不同表型下各个组织的潜在差异代谢物。

在此基础上，通过非参数检验Mann-Whitney U对潜在差异代谢物进行均值检验。同时，采用均值变化倍数(Fold Change，FC)分析确认潜在差异代谢物在组间的变化状态。将潜在差异代谢物中均值检验具有统计学意义并且具有一定变化倍数的代谢物作为各个组织的标记代谢物(图1)。

六、关键代谢网络确定

基于上述标记代谢物，采用Spearman等级相关性模型确定各组织标记代谢物的相关系数，利用网络分析模型构建标记代谢物网络。

其关键代谢标志物鉴定采用如下步骤：

a.通过设定相关性系数阈值(β>0.7)去除代谢弱相关节点连线，确定具有显著统计学意义的节点连线。

b.采用OpenOrd模型核心节点聚类，同时根据连接度参数去除无连线代谢标记物节点。

c.计算代谢网络节点的平均加权度，去除低于平均加权度的代谢节点。

d.通过ForceAtlas模型构建核心代谢网络拓扑图。

f.对核心代谢网络进行模块化分析，采用标准解析度(α＝1)确定多组织代谢标记物交互网络(图2)，其中图2黑色节点构建网络包含了多个组织的代谢标志物，其构建的区域网络是组织交互的关键代谢网络模块，模块内节点为关键代谢标志物。

七、关键代谢标志物判别能力评估

为了说明所确定关键代谢标志物的判别能力，采用组合ROC分析方法，如图3所示，筛选关键代谢标记物组合因子的判别能力强(AUC>0.9)。图表1所示，单一指标 ROC分析也表明所本案例所确定关键代谢标志物都具有较强的判别能力(AUC>0.9)。

表1、关键代谢物AUC分析

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (8)

1.一种大气颗粒物全身毒性效应代谢标志物的评估方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、采集研究地区的大气颗粒物，配制成大气颗粒物悬浊液；

S2、将所述大气颗粒物悬浊液气管滴注到受试动物体内，模拟人体大气颗粒物暴露；

S3、实验周期结束后，采集受试动物的肝脏、肺以及血清；

S4、通过液相色谱质谱联用平台对肝脏、肺以及血清进行代谢组分析，分别确定肝脏、肺和血清的标记代谢物；

S5、通过对所述相关性分析和网络分析，确定关键代谢网络，同时利用网络节点中心度评估确定关键标记代谢物。

2.如权利要求1所述的大气颗粒物全身毒性效应代谢标志物的评估方法，其特征在于，所述大气颗粒物的采集方法为：采用大气颗粒物采样器，将PM2.5颗粒物截留在滤膜上，进行收集。

3.如权利要求1所述的大气颗粒物全身毒性效应代谢标志物的评估方法，其特征在于，所述大气颗粒物悬浊液的制备方法为：将所述大气颗粒物在超声条件下分散于缓冲溶液中，即可，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或生理盐水。

4.如权利要求1所述的大气颗粒物全身毒性效应代谢标志物的评估方法，其特征在于，步骤S3的具体操做方法为：对于肝脏或肺，将受试动物的肝脏、肺或血清至于体积比为1：1的甲醇/水体系中，进行微珠破碎，离心获取含有分子量为100~1000Da的小分子代谢物的澄清溶液；对于血清样品，采用甲醇作为蛋白质沉淀有机相体系，将血清样品与甲醛按照体积比1:3混合，通过离心除去蛋白，上清液用于后续代谢组学分析。

5.如权利要求1所述的大气颗粒物全身毒性效应代谢标志物的评估方法，其特征在于，步骤S4中，使用高效液相色谱串联高分辨质谱平台进行代谢组学分析，采用反向色谱方法对样品代谢物进行分离，质谱离子源分别采用正负两种模式，利用一级质谱以及二级质谱信息测定确认代谢物分子信息。

6.如权利要求1所述的大气颗粒物全身毒性效应代谢标志物的评估方法，其特征在于，所述差异代谢物确定采用以下方法：

a、采用OPLS-DA进行不同表型下差异代谢轮廓可视化分析，利用OPLS-DA重要性分析确认潜在差异代谢物；

b、在OPLS-DA确认差异代谢物基础上，利用非参数检验Mann-Whitney U对潜在差异代谢物进行均值检验，同时，采用均值变化倍数分析确认潜在差异代谢物在组间的变化状态，将潜在差异代谢物中均值检验具有统计学意义并且具有1.5~2.0倍的代谢物作为各个组织的标记代谢物。

7.如权利要求1所述的大气颗粒物全身毒性效应代谢标志物的评估方法，其特征在于，步骤S5中，使用Spearman等级相关性模型确定各组织标记代谢物的相关系数，利用网络分析模型构建标记代谢物网络。

8.如权利要求1所述的大气颗粒物全身毒性效应代谢标志物的评估方法，其特征在于，所述关键代谢标志物鉴定采用如下步骤：

a、通过设定相关性系数阈值去除代谢弱相关节点连线，确定具有显著统计学意义的节点连线；

b、采用OpenOrd模型核心节点聚类，同时根据连接度参数去除无连线代谢标记物节点；

c、计算代谢网络节点的平均加权度，去除低于平均加权度的代谢节点；

d、通过ForceAtlas模型构建核心代谢网络拓扑图；

f、对核心代谢网络进行模块化分析，确定多组织代谢标记物交互网络，并确定关键代谢标志物。