CN110326702A - 一种玉米糖肽的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种玉米糖肽的制备方法及其产品和应用，属于食品药品生产技术领域。所述玉米糖肽的制备方法包括玉米肽粉的制备以及玉米肽和氨基糖的糖基化反应；所述玉米肽粉的制备原料为富含支链氨基酸的玉米蛋白；所述玉米肽和氨基糖在谷氨酰胺转氨酶的催化下发生糖基化反应，最终制备得到玉米糖肽。本发明提供的玉米糖肽制备方法简单，制备得到的玉米糖肽对酒精性肝损伤具有拮抗和保护作用，可应用于相关食品、药品、保健品的制备。
Description
技术领域
本发明属于食品药品生产技术领域，具体涉及一种玉米糖肽的制备方法及其产品和应用。
背景技术
很多人在各种社交场合上以各种理由饮酒。敬酒、劝酒或碍于面子饮酒，常常会导致人饮酒过量。长期饮酒可使人产生酒瘾，造成嗜酒。长期嗜酒对肝脏损伤较大。酒精摄入后，迅速被胃肠道吸收入血，绝大部分在肝脏进行代谢，仅2％～10％由肾、肺排泄。酒对肝细胞有明显的毒害作用，长期酗酒可发生酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化，甚至癌变。
临床上治疗酒精性肝损伤的西医治疗药物通常会增加肝脏负担。中医药具有副作用小、安全有效的特点，更能被大众接受，但目前临床上虽有多种治疗酒精性肝损伤的中药制剂，但组份中药食同源的原料药物较少，经常服用，仍存在副作用，并且见效慢，疗效低，不能令人满意。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种能有效拮抗酒精性肝损伤的玉米糖肽及其制备方法和应用。
本发明提供了一种玉米糖肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)水解玉米蛋白悬浊液，固液分离，干燥液相，制备得到玉米肽粉；
(2)将所述玉米肽粉与水混合配制成2～15％质量体积浓度的玉米肽溶液；
(3)向所述玉米肽溶液中加入氨基糖，得到反应底液；所述氨基糖的添加量为所述玉米肽粉质量的2～5倍；
(4)向所述反应底液中加入谷氨酰胺转氨酶，使玉米肽和氨基糖发生糖基化反应，反应结束后得到玉米糖肽；所述谷氨酰胺转氨酶的添加量为：每1g玉米肽粉添加40～80U谷氨酰胺转氨酶。
优选的，所述步骤(1)中水解用酶包括Alcalase碱性蛋白酶、Protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味蛋白酶中的一种或多种。
优选的，当所述水解用酶为Alcalase碱性蛋白酶时，所述水解的温度为55～65℃，所述水解的pH值保持8.2～8.8，所述水解的时间为1～3h。
进一步优选的，所述pH值的保持通过滴加0.4～0.6mol/L的NaOH溶液实现。
优选的，所述步骤(1)水解后还包括一次灭酶，所述一次灭酶的温度为90～105℃，所述一次灭酶的时间为10～20min。
优选的，所述步骤(1)固液分离的方法为离心，所述离心的转速为3000～5000r/min，离心的时间为10～20min。
优选的，所述步骤(4)糖基化反应结束后，还包括离心反应液，所述离心后取上清液，对上清液进行纳滤的步骤；所述纳滤能截断分子量≤300Da的分子。
优选的，所述纳滤的压力为15～25Bar，温度为18～22℃，纳滤后的溶液体积为纳滤前溶液体积的1/3～2/3。
优选的，所述步骤(4)中糖基化反应的温度为42～46℃，糖基化反应的pH值保持7.8～8.2，糖基化反应的时间为5～10h。
进一步优选的，所述pH值的保持通过滴加3～5mol/L的NaOH溶液实现。
优选的，所述糖基化反应后还包括二次灭酶，所述二次灭酶的温度为80～90℃，所述二次灭酶的时间为3～8min。
本发明提供了上述制备方法制备得到的含玉米糖肽产品，所述产品中蛋白质的质量浓度为70％-80％，所述蛋白质包括玉米糖肽和玉米肽；所述玉米糖肽中每1g玉米肽上结合的氨基葡萄糖量为100～150mg。
本发明还提供了上述玉米糖肽或者含玉米糖肽产品在制备拮抗酒精性肝损伤保健食品、药品或保健品中的应用。
有益效果：本发明提供了一种玉米糖肽的制备方法，包括如下步骤：(1)水解玉米蛋白，固液分离，干燥液相，制备得到玉米肽粉；(2)将所述玉米肽粉与水混合配制成2～15％质量体积浓度的玉米肽溶液；(3)向所述玉米肽溶液中加入氨基糖，得到反应底液；所述氨基糖的添加量为所述玉米肽粉质量的2～5倍；(4)向所述反应底液中加入谷氨酰胺转氨酶，使玉米肽和氨基糖发生糖基化反应，反应结束后得到含有玉米糖肽的最终反应液；所述谷氨酰胺转氨酶的添加量为：每1g玉米肽粉添加40～80U谷氨酰胺转氨酶。本发明提供的玉米糖肽制备方法简单，制备得到的玉米糖肽对酒精性肝损伤具有拮抗和保护作用，可应用于相关食品、药品、保健品的制备，不存在毒副作用。
附图说明
图1为本发明实施例1所述玉米糖肽的生产工艺流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种玉米糖肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)水解玉米蛋白悬浊液，固液分离，干燥液相，得到玉米肽粉；
(2)将所述玉米肽粉与水混合配制成2～15％质量体积浓度的玉米肽溶液；
(3)向所述玉米肽溶液中加入氨基糖，得到反应底液；所述氨基糖的添加量为所述玉米肽粉质量的2～5倍；
(4)向所述反应底液中加入谷氨酰胺转氨酶，使玉米肽和氨基糖发生糖基化反应，反应结束后得到玉米糖肽；所述谷氨酰胺转氨酶的添加量为：每1g玉米肽粉添加40～80U谷氨酰胺转氨酶。
本发明以玉米蛋白为原料制备玉米肽粉，玉米蛋白富含支链氨基酸，以其为原料制备得到的玉米肽粉具有潜在的护肝活性。在本发明中，所述玉米蛋白优选为玉米醇溶蛋白。本发明对所述玉米蛋白的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明实施例中，所述玉米蛋白购买自Sigma公司。
本发明先水解玉米蛋白。在本发明中，所述水解操作首先配制玉米蛋白的水悬浊液，所述水悬浊液中玉米蛋白的质量体积浓度优选为5～15％，更优选为10％。在本发明中，所述水解用酶优选使用Alcalase碱性蛋白酶、Protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味蛋白酶中的一种或多种，更优选使用Alcalase碱性蛋白酶。在添加Alcalase碱性蛋白酶前，本发明优选将玉米蛋白水悬浊液加热至水解温度，调节玉米蛋白水悬浊液的pH值为水解pH值。在本发明中，所述水解温度优选为55～65℃，更优选为60℃。所述水解pH值优选为8.2～8.8，更优选为8.5。在本发明中，所述水解pH值优选通过滴加NaOH溶液实现，所述NaOH溶液的浓度优选为0.4～0.6mol/L，更优选为0.5mol/L。在本发明中，所述Alcalase碱性蛋白酶添加的质量浓度优选为1％～5％，更优选为3％。本发明对所述Alcalase碱性蛋白酶的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明的实施例中，所述Alcalase碱性蛋白酶购买自丹麦诺维信公司。在本发明中，所述水解的时间优选为1～3h，更优选为2h。
水解结束后，本发明优选对水解液进行灭酶操作。在本发明中，所述灭酶的温度优选为90～105℃，更优选为100℃。所述灭酶的时间优选为10～20min，更优选为15min。
水解后，玉米蛋白充分水解为玉米肽并溶解在水解液中。本发明对水解液进行固液分离处理，干燥滤液，得到玉米肽粉。在本发明中，所述固液分离的方法优选为离心，所述干燥的方法优选为冷冻干燥。在本发明中，所述离心的转速优选为3000～5000r/min，更优选为4000r/min。所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。所述冷冻干燥的温度优选为-70～-90℃，更优选为-80℃。所述冷冻干燥的时间优选为36～60h，更优选为48h。按照本发明提供的方法制备得到的玉米肽粉的支链氨基酸和芳香族氨基酸比值高，分子量集中在500-1000Da范围内，具有护肝和易消化吸收的特点。
得到玉米肽粉后，本发明将所述玉米肽粉与水混合配制成玉米肽溶液。在本发明中，所述玉米肽溶液的质量体积浓度为2～15％，优选为3～10％，更优选为3.5～5％。配制得到玉米肽溶液后，本发明向所述玉米肽溶液中加入氨基糖，得到糖基化反应底液。在本发明中，所述氨基糖优选为D-氨基葡萄糖盐酸盐。所述氨基糖的添加量优选为所述玉米肽粉质量的2～5倍，更优选为所述玉米肽粉质量的2.5～3.5倍，更优选为所述玉米肽粉质量的3倍。得到糖基化反应底液后，本发明向所述反应底液中加入谷氨酰胺转氨酶，使玉米肽和氨基糖发生糖基化反应。在本发明中，所述谷氨酰胺转氨酶的添加量与玉米肽粉的质量比为40～80U：1g，优选为50～60U：1g，更优选为55U：1g。所述糖基化反应的温度优选为42～46℃，更优选为44℃。所述糖基化反应的pH值优选为7.8～8.2，更优选为8.0。在本发明中，所述糖基化反应的pH值优选通过滴加NaOH溶液实现，所述NaOH溶液的浓度优选为3～5mol/L，更优选为4mol/L。本发明对所述氨基糖和所述谷氨酰胺转氨酶的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明的实施例中，所述氨基糖购买自上海生工生物有限公司。所述谷氨酰胺转氨酶购买自泰兴市一鸣生物制药有限公司。
糖基化反应结束后，本发明优选对所述含有玉米糖肽的最终反应液进行灭酶操作，在本发明中，所述灭酶的温度优选为80～90℃，更优选为85℃。所述灭酶的时间优选为3～8min，更优选为5min。
糖基化反应结束后，本发明优选包括离心反应液的步骤，所述离心后取上清液，对上清液进行纳滤。在本发明中，所述离心的转速优选为3000～5000r/min，更优选为4000r/min。所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。离心后得到上清液，再对所述上清液进行纳滤。在本发明中，所述纳滤优选采用纳滤膜，所述纳滤膜能截断分子量≤300Da的分子。在本发明中，所述纳滤的压力优选为15～25Bar，更优选为20Bar；所述纳滤的温度优选为18～22℃，更优选为20℃。所述纳滤后的溶液体积减小，其体积优选为纳滤前溶液体积的1/3～2/3，更优选为纳滤前溶液体积的1/2。经纳滤后的玉米糖肽较纳滤前，电导率降低15％以上，含糖量降低7％以上，达到脱盐及除去未反应氨基糖的目的。
本发明提供了上述制备方法制备得到的含玉米糖肽产品。在本发明中，所述产品中蛋白质的质量浓度为70％-80％。所述蛋白质包括玉米糖肽和玉米肽；所述玉米糖肽中每1g玉米肽上结合的氨基葡萄糖量为100～150mg。
本发明还提供了上述制备方法制备得到的玉米糖肽或者含玉米糖肽产品在制备拮抗酒精性肝损伤保健食品、药品或保健品中的应用。实验证明，本发明提供的玉米糖肽对酒精性肝损伤具有显著的拮抗和保护作用，与酒精模型组相比，服用玉米糖肽的大鼠肝脏指数、血清中ALT和AST的活力以及肝脏中ROS的含量均显著降低，而肝脏中SOD和CAT活性均显著增加。
下面结合实施例对本发明提供的一种玉米糖肽的制备方法及其产品和应用作进一步的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
玉米糖肽的制备：
1，玉米肽的制备：Alcalase碱性蛋白酶水解：取10g玉米醇溶蛋白放于150mL烧杯中，加入100mL蒸馏水，搅拌均匀，配制成底物浓度10％(w/v)的悬浊液，加入大小合适的转子后，将烧杯放入60℃水浴磁力搅拌器中央，将pH计电极插入悬浊液中，用移液枪少量多次加入0.5mol/LNaOH调pH至8.5，维持3min不变后加入0.3gAlcalase碱性蛋白酶，开始酶解反应，酶解过程中通过不断滴加0.5mol/LNaOH使pH维持在8.5，酶解2h后取出立即放入沸水浴中灭酶15min，冷却至室温后经4000r/min离心15min，取上淸液分装到小盒中，放于-80℃冰箱中冻结，冷冻干燥48h后获得玉米肽粉。
2，氨基葡萄糖盐酸盐糖基化修饰玉米肽
(1)将制备的玉米肽粉配制成底物浓度为3.5％的玉米肽溶液，按玉米肽：D-氨基葡萄糖盐酸盐＝1:3(w/w)添加D-氨基葡萄糖盐酸盐，用2mol/LNaOH调pH值至8.0。
(2)按加酶量为55U/g蛋白加入谷氨酰胺转氨酶，封膜放入44℃恒温水浴振荡器，开始糖基化修饰反应。每隔1h取出，用4mol/L NaOH调pH至8.0。
(3)糖基化反应7h后，立即于85℃水浴中灭酶5min。
(4)冷却至室温，用截断分子质量为300Da的纳滤膜进行脱盐脱糖处理，纳滤的参数为溶液体积4.5L、操作压力20Bar、温度20℃、体积浓缩至1/2(在此条件下，玉米糖肽的电导率和糖含量分别降低16.87％和7.58％)，得到玉米糖肽。
实施例2
玉米糖肽的护肝活性：
取SD大鼠50只，随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组、酒精模型组、3个玉米糖肽组，分别为玉米糖肽250mg/kg·BW组、玉米糖肽500mg/kg·BW组和玉米糖肽1g/kg·BW组。适应性饲养一周后，开始造模。经口灌胃玉米糖肽30min后，玉米糖肽组和酒精模型组按0.8mL/100g·BW剂量给大鼠灌胃50°北大仓大部优白酒，购买自黑龙江省北大仓集团有限公司，第二周将剂量调整为1.0mL/100g·BW，第三周将剂量调整为1.0mL/100g·BW，第四周将剂量调整为1.5mL/100g·BW，灌胃周期为28d。正常对照组按相同剂量灌胃生理盐水。在末次采食12h后，处死大鼠，取血及脏器分析相关指标。
血液室温放置24h后，3000r/min离心10min，收集血清测定丙氨酸氨基转移酶活性(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶活性(AST)。肝脏与0.9％生理盐水按1:10(g/mL)比例混合，冰浴匀浆成10％的肝匀浆液，用于测定超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢(CAT)活力和活性氧(ROS)含量。ALT、AST、SOD、CAT和ROS的测定均采用上海将来实业股份有限公司的试剂盒测定，测定方法遵照试剂盒的说明书进行。实验结果如表1所示。
表1玉米糖肽对大鼠血清及肝指标的影响
结果表明：与酒精模型组相比，在玉米糖肽剂量为1g/kg·BW时，玉米糖肽使大鼠的肝脏指数、ALT、AST和ROS水平分别降低14.15％、47.40％、43.88％和27.14％，而SOD和CAT活力分别增加69.29％和67.74％，说明玉米糖肽对酒精肝损伤发挥了保护作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种玉米糖肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)水解玉米蛋白悬浊液，固液分离，干燥液相，得到玉米肽粉；
(2)将所述玉米肽粉与水混合配制成2～15％质量体积浓度的玉米肽溶液；
(3)向所述玉米肽溶液中加入氨基糖，得到反应底液；所述氨基糖的添加量为所述玉米肽粉质量的2～5倍；
(4)向所述反应底液中加入谷氨酰胺转氨酶，使玉米肽和氨基糖发生糖基化反应，反应结束后得到玉米糖肽；所述谷氨酰胺转氨酶的添加量为：每1g玉米肽粉添加40～80U谷氨酰胺转氨酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中水解用酶包括Alcalase碱性蛋白酶、Protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味蛋白酶中的一种或多种，所述水解的温度为55～65℃，所述水解的pH值保持8.2～8.8，所述水解的时间为1～3h；所述pH值的保持通过滴加0.4～0.6mol/L的NaOH溶液实现；所述水解后还包括一次灭酶，所述一次灭酶的温度为90～105℃，所述一次灭酶的时间为10～20min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)固液分离的方法为离心，所述离心的转速为3000～5000r/min，离心的时间为10～20min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)糖基化反应结束后，还包括离心反应液的步骤，所述离心后取上清液，对上清液进行纳滤；所述纳滤能截断分子量≤300Da的分子。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述纳滤的压力为15～25Bar，温度为18～22℃，纳滤后的溶液体积为纳滤前溶液体积的1/3～2/3。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中糖基化反应的温度为42～46℃，糖基化反应的pH值保持7.8～8.2，糖基化反应的时间为5～10h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述pH值的保持通过滴加3～5mol/L的NaOH溶液实现。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述糖基化反应后还包括二次灭酶，所述二次灭酶的温度为80～90℃，所述二次灭酶的时间为3～8min。
9.权利要求1～8任意一项所述制备方法制备得到的含玉米糖肽产品，其特征在于，所述产品中蛋白质的质量浓度为70％-80％，所述蛋白质包括玉米糖肽和玉米肽；所述玉米糖肽中每1g玉米肽上结合的氨基葡萄糖量为100～150mg。
10.权利要求1～8任意一项所述制备方法制备得到的玉米糖肽或者权利要求9所述的含玉米糖肽产品在制备拮抗酒精性肝损伤保健食品、药品或保健品中的应用。
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