CN110312801A

CN110312801A - 用于真核细胞中rna分子的细胞类型特异性翻译的系统和方法

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Publication number: CN110312801A
Application number: CN201880012606.3A
Authority: CN
Inventors: 黑里贝特·波伦; 波恩德·霍夫曼
Original assignee: Arena Biology Co
Current assignee: Arena Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-02-20
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2019-10-08
Anticipated expiration: 2038-02-09
Also published as: AU2018222453A1; JP2020513194A; US20200063131A1; IL268785A; EP3583215A1; KR20190120207A; EA201991828A1; CA3054096A1; DE102017103383A1; WO2018149740A1; CN110312801B; JP7153033B2

Abstract

本发明提供了在真核靶细胞中靶向翻译目标多肽的方法和RNA构建体以及其在治疗性临床应用中的用途。

Description

用于真核细胞中RNA分子的细胞类型特异性翻译的系统和方法

发明领域

本发明涉及在真核靶细胞中靶向翻译目标多肽的方法和RNA构建体，并且涉及其在治疗性临床应用中的用途。

发明背景

某些分子如在癌症治疗中的医学和药理学相关蛋白或影响细胞活力的肽的定向引入，是现代细胞生物学中最大的迫切需求之一，但也是该领域中尚未令人满意地解决的难点。

已经使用各种技术来以定向的方式在诸如人类的复杂生物体中释放和激活目标分子。这里有两种不同的方法特别令人感兴趣。

基于诸如脂质体的载体系统(D.Papahadjopoulos,M.Moscarello,E.H.Eylar,T.Isac,Biochim.Biophys.Acta.1975,401,p.317)，分子(例如癌症治疗剂)与这些载体系统缀合或嵌入其中。随后，将如此功能化的载体系统引入体内，其中所述引入可包括整个身体或仅包括生物体的某些部分。在这种情况下，合适地提供载体系统使得天然身体条件不影响载体系统和目标分子之间的稳定性，因此去除了所述分子的释放。当前外部因素可以使载体系统不稳定，从而诱导所结合的分子的释放和活性。作为释放的外部因素，使用某些身体部位的局部加热(热疗法)和光诱导或pH诱导载体系统和分子之间特定键的裂解。所有这些系统的原理概述请参见Qiuand Park，Advanced Drug Delivery Reviews 53(2001)pp.321-339Environment-sensitive hydrogels for drug delivery)和Shamay等，Biomaterials,Light induced drug delivery into cancer cells 2011 32:pp.1377-86。然而，在所有这些方法中特别有问题的是功能性分子必须以高浓度引入整个体内，这通常会导致副作用和非特异性释放。此外，该方法以特定位点但非细胞类特异性方式操作，因此除了预期的癌细胞外，例如细胞抑制剂还损害周围组织，或者也在身体中从释放位点快速散开。此时也必须使用高剂量。

作为分子靶向释放的第二种方法，通常使用这样的系统，其中目标分子直接或再通过载体系统与对特定细胞类型的某些表面分子具有高度特异性的配体缀合。癌细胞的高表达表面受体如GPRC或叶酸受体如此与配体结合(Lappano R,Maggiolini M.,Nat RevDrug Discov.2011,10:pp.47-60,G protein-coupled receptors:novel targets fordrug discovery in cancer；Sudimack J,Lee RJ.,Adv Drug Deliv Rev.2000,41:pp.147-62.Targeted drug delivery via the folate receptor)。在配体与表面受体结合后，结合的分子可以直接表现出它们的活性(例如，放射性药物或MRI造影剂)，或者在经吞噬作用摄入细胞后可以表现出它们的功能(例如化学治疗剂或DNA载体)。然而，该方法也具有明显缺点，其又涉及整个身体系统中相对高的总浓度，还必须特别关注大多数表面受体对单个细胞类型或疾病模式没有绝对特异性的事实，因此与这些受体的缀合可能与健康组织中增加的副作用有关。另外，多种特异性受体在缀合后不诱导对结合的载体系统的吞噬摄取，因此这些载体系统保留在细胞外部。

用于靶向转移到限定的细胞类型/组织中的最大数量的生物技术、药理学和医学相关分子通常是在DNA水平编码的肽或蛋白质。在引入这些DNA分子后，这些分子被转运到细胞核中，然后通过高度保守的机制，最初转录(转录)为RNA分子，经转录后修饰，然后转运出细胞核后在细胞质内通过高度保守的机制(翻译)以氨基酸序列进行重新描述。在所有真核生物和细胞类型中转录和翻译机制在基本机制方面都是相同的。这意味着，尽管效率不同，编码肽的每个DNA序列在各细胞中产生相同的初级产物，该初级产物可以随后被进一步修饰。转录和翻译的整个过程称为表达。一些RNA分子保持未被翻译并具有单独的功能。

如果DNA片段的编码区依赖于细胞类型特异性或组织特异性启动子和增强子序列以及分化和成熟程度来调控，则DNA序列的选择性靶向表达是可能的。这类序列调控转录器的结合，从而仅在限定的环境条件下导致其活化。然而，对于这种类型的DNA构建体的靶向表达是不利的，1)DNA构建体只有在极其困难的情况下才能非常高效且均匀地被引入至生物体或组织内的所有细胞中，2)用于后续转录的DNA构建体总是被转运到细胞核并与天然遗传物质相互作用，结果可能出现突变和随后的疾病(例如癌症)，以及3)器官特异性启动子区域通常非常大，因此不适合用于从外部引入的DNA构建体。

作为使用DNA构建体表达基于氨基酸的分子的替代方案，可以通过将RNA分子直接引入至细胞或细胞组织来绕过核转录步骤。不同研究组的工作已表明(综述文章参见：VanTendeloo VF,Ponsaerts P,Berneman ZN.mRNA-based gene transfer as a tool forgene and cell therapy.Curr Opin Mol Ther.2007；9:pp.423-431)RNA分子的引入高效且快速地发生，而不会在细胞中产生显著的应激水平。引入的RNA分子保留在细胞的细胞质中，因此不能与细胞核内的基因组产生负作用。使用保守的翻译过程，引入的mRNA分子和内源(天然)存在的mRNA分子被转化为蛋白或肽。为此目的，需要mRNA分子内的某些序列基序，详情可参见教科书(例如Alberts et al.,Molecular Biology of the Cell,2011,Wiley-Blackwell)，在图1中以简化形式显示。在这种情况下，mRNA分子通常包含以下单元：

1.帽：帽结构是真核细胞中mRNA分子的化学变化，它显著增加RNA的稳定性，对于RNA从细胞核转运到细胞质以及随后由核糖体翻译mRNA很重要。这通常涉及修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在基因转录期间通过罕见的5'-5'磷酸二酯键与RNA的头部连接。

2.未翻译的5'区域：代表排列在编码序列上游的核苷酸序列。该区域始于转录起始点并在直接翻译起始密码子之前终止。在该序列内，可能存在调节序列，其例如通过二级结构影响mRNA的稳定性，或作为蛋白的结合位点。另外，通常存在核糖体结合位点。

3.编码序列：所述编码序列包含由mRNA产生的蛋白的信息。所述序列直接以翻译起始密码子开始，并以翻译终止密码子终止。所述编码序列的核苷酸序列由所编码蛋白的氨基酸序列在三联体密码背景内预先确定。根据所使用的三联体，mRNA的表达率和稳定性会受影响。

4.3'非翻译区：代表与编码直接位于翻译终止密码子后面的蛋白的区域相邻的区域。它包括直至多腺苷酸化开始的整个区域。在非翻译的3'区域内，还可以存在调控序列，其对RNA的多聚腺苷酸化及其稳定性和转运也特别重要。

5.poly(A)尾：基于由poly(A)聚合酶对mRNA的转录后修饰，通过将腺嘌呤核苷酸连接到mRNA的3'末端来进行多腺苷酸化。poly(A)尾的长度对mRNA的稳定性以及蛋白与该序列结合并且帽(CAP)与poly(A)尾部相互作用的事实起重要作用。

然而，使用外部引入的RNA分子的缺点会影响某些应用，因为：i)RNA分子通常具有有限的寿命，因此蛋白的形成仅在有限的时间段内发生。ii)由于翻译的基本机制在所有真核细胞和现有细胞类型中保持相同，因此此前无法实现靶向，即被引入至整个生物体的mRNA分子的组织或细胞类型特异性表达。

最近的研究结果(Quabium and Krupp,Synthetic mRNAs for manipulatingcellular phenotypes:综述(2015)New Biotechnology,32:pp.229-235)现在允许在不同水平对mRNA分子进行高效的化学修饰以进行调控，以及(如有必要)可显著延长第i)点所述的寿命。这类修饰包括：

a)使用基于天然存在的帽m7G5'pppN的化学修饰的帽序列。这方面的实例参见Jamielity et al.Synthetic mRNA cap analogs with a modified triphosphatebridge-synthesis,applications and prospects(2010)New.J.Chem 34:pp.829-844。一方面，这种修饰通过有效地结合翻译器的亚基来提高翻译效率。另一方面，它们改善了mRNA分子的稳定性，可能是因为核酸酶可以从5'端侧不太有效地与mRNA结合的事实。

b)使用稳定的5'和3'非翻译区。通常，通过使用合适的核苷酸序列可以显著影响稳定性。结合配体的附着和通过碱基配对形成二级结构是稳定化的主要原因。

c)使用化学修饰的核苷酸。这种核苷酸如5-甲基胞苷或假尿苷，主要影响内切核酸酶的结合，从而防止mRNA分子的快速降解。

d)在非翻译3'区域中使用有效的多腺苷酸化序列，以获得尽可能长的多腺苷酸化。

本发明的目的尤其是提供允许在特定细胞类型中进行mRNA的限定表达的方法和RNA构建体。

发明概述

本发明涉及使用复合RNA和信使RNA(mRNA)分子，其被保护免于降解，用于细胞选择性表达具有细胞内活性或可分泌的RNA片段、肽或蛋白。

本发明第一个方面涉及在真核靶细胞中靶向翻译目标多肽的方法，其特征在于，将RNA构建体引入细胞中，所述RNA构建体在5’至3’方向具有至少下列元件：

(a)反编码元件(a)，其与所述靶细胞表达的基因的mRNA的至少一部分互补；

(b)闭锁元件(b)，其与3'位置处的翻译起始因子元件(d)的至少一部分相互作用；

(c)稳定元件(c)；

(d)翻译起始因子元件(d)；

(e)编码所述目标多肽的序列(e)，

在非靶真核细胞中通过闭锁元件(b)与翻译起始元件(d)的碱基配对阻止目标多肽的翻译，并且在真核靶细胞中由于通过反编码元件与靶细胞表达的mRNA相互作用诱导的RNA构建体加工而发生所编码多肽的翻译。

本发明另一个方面涉及在真核靶细胞中靶向翻译即目标多肽的任意长度的氨基酸序列的方法，其特征在于，将RNA构建体引入细胞中，所述RNA构建体在5’至3’方向具有至少下列元件：

(b)闭锁元件(b)，其与3'位置处的翻译起始因子元件(d)的至少一部分互补，或以另一种方式可逆地改变其在3'位置处的翻译起始因子元件(d)的至少一部分的功能；

(c)稳定元件(c)；

(d)翻译起始因子元件(d)；

(e)编码所述目标多肽的序列(e)，

在非靶真核细胞中通过闭锁元件(b)与翻译起始因子元件(d)的碱基配对或其他相互作用阻止目标多肽的翻译，并且在真核靶细胞中由于通过反编码元件与靶细胞特异性表达的mRNA相互作用诱导的RNA构建体加工(降解)而发生所编码多肽的翻译。所述加工被稳定元件(c)中断，这导致翻译起始因子元件(d)的激活。

本发明另一个方面涉及在真核靶细胞中靶向翻译目标多肽的RNA构建体，所述RNA构建体在5’至3’方向具有至少下列元件：

(a)反编码元件(a)，其与所述靶细胞表达的DNA部分的RNA的至少一部分互补或诱导细胞类型特异性降解；

(b)闭锁元件(b)，其与3'位置处的翻译起始因子元件(d)的至少一部分互补或以其他方式抑制3'位置处的翻译起始因子元件(d)的至少一部分；

(c)稳定元件(c)，其将RNA的细胞类型特异性降解限制于其一部分；

(d)翻译起始因子元件(d)，其功能独立于5'帽并且仅在靶细胞中有活性；

(e)编码所述目标多肽的序列(e)；

在非靶真核细胞中通过闭锁元件(b)与翻译起始元件(d)的碱基配对或其他相互作用阻止目标多肽的翻译，并且在真核靶细胞中由于反编码元件(a)与靶细胞表达的RNA相互作用而发生RNA构建体的特定加工，因此激活翻译起始因子元件(d)而翻译所编码的多肽。

本发明进一步的方面是本文所述方法和RNA构建体在治疗性临床应用、肿瘤形成、潜在的免疫失调和代谢失调中的用途。此外，本文所述的方法和RNA构建体适合用于基因编辑的细胞类型特异性表达所必需的组件，因此适合用于治疗生殖系疾病。除了这些典型应用之外，哺乳动物的成体干细胞(iPS、专能、全能或多能)及其衍生组织也可在体外用作靶细胞。然后，由这些细胞产生的组织或单细胞可以在人体内和药物开发中使用。

附图简述

图1是mRNA分子的示意图。mRNA的所有部分可具有用于分子稳定性的调控功能。

图2是本发明的RNA构建体的一个实施方案的示意图，用于在器官范围或生物体范围内引入mRNA分子后在特定细胞类型中选择性表达靶序列。

图3是本发明的RNA构建体的另一个实施方案的示意图，用于在特定细胞类型中选择性表达靶序列，其中1＝CAP/修饰，2＝5'UTR，3＝反编码片段，4＝接头序列_IRES闭锁序列_接头序列，5＝稳定元件，6＝IHRES，7＝目标序列，8和9＝3'UTR和poly(A)。

图4A)是本发明RNA构建体在元件3和细胞类型特异性RNA之间通过反编码相互作用处理之前和之后的一个实施方案的示意图。当与靶RNA结合时，反编码序列元件通过已建立的机制导致基序1-4的降解。

B)显示来自HCV(HCV IRES 1b)的示例性功能性IRES序列(6)的计算的二级结构。

图5显示了初级IRES核酸序列(HCV IRES 1b)；图4中的位置6：SEQ ID NO:1。相关的功能性二级结构如图4所示。

图6A)是本发明RNA构建体在元件3和细胞类型特异性RNA之间通过反编码相互作用处理之前和之后的一个实施方案的示意图。当与靶RNA结合时，反编码序列元件通过已建立的机制降解基序1-4。

B)是来自HCV(HCV IRES 1b)的具有3个稳定元件(5)的示例性IRES序列(6)的二级结构的示意图。

图7显示了具有3个稳定元件(图6中的位置5)的初级IRES序列(图6中的位置6)：SEQ ID NO:2。相关的功能性二级结构如图6所示。

图8A)是本发明RNA构建体在元件3和细胞类型特异性RNA之间通过反编码相互作用处理之前和之后的一个实施方案的示意图。当与靶RNA结合时，反编码序列元件通过已建立的机制降解基序1-4。

B)是来自HCV(HCV IRES 1b)的具有3个稳定元件(5)和接头序列(4a)的示例性IRES序列(6)的二级结构的示意图。

图9显示了具有3个稳定元件(图8中的位置5，加下划线)和接头序列(图8中的位置4a，加框)的初级IRES序列(图8中的位置6)：SEQ ID NO:3。相关的功能性二级结构如图8所示。

图10A)是本发明RNA构建体在元件3和细胞类型特异性RNA之间通过反编码相互作用处理之前和之后的一个实施方案的示意图。当与靶RNA结合时，反编码序列元件通过已建立的机制降解基序1-4。

B)是来自HCV(HCV IRES 1b)的具有3个稳定元件(5)、接头序列(4a)和闭锁序列(4b)的示例性IRES序列(6)的二级结构的示意图。

图11显示了具有3个稳定元件(图10中的位置5，加下划线)、接头序列(图8中的位置4a，加框)和闭锁序列(4b，粗体)的初级IRES序列(图10中的位置6)：SEQ ID NO:4。相关的二级结构如图10所示。

图12显示了用于在限定的细胞类型中选择性表达靶序列的功能系统的核苷酸序列实例。

图13显示了功能系统的核苷酸序列实例，其具有用于在限定的细胞类型中选择性表达靶序列的可替换的反义序列。

图14显示了功能系统的核苷酸序列的实例，其具有用于在限定的细胞类型中选择性表达靶序列的替代的反义序列和替代的闭锁序列。

图15显示了细胞类型依赖性闭锁序列-IRES控制的GFP选择性表达的显微图像。

图16显示了用于定量评估靶基因选择性表达的功能系统的表。

下面基于实施例并参考附图更详细地描述本发明，但不限制本发明的总体构思。

发明详述

描述了用于细胞内具有活性或可分泌的RNA片段、肽或蛋白的细胞选择性表达的复合RNA和信使RNA(mRNA)分子的使用，所述复合RNA和信使RNA(mRNA)分子被保护免于降解。RNA分子的基本结构包括稳定结构、调控区和编码目的序列的功能区。调控结构充当目标序列表达的组成型抑制剂。抑制仅当特异性结合诱导调控部分的选择性降解时被去除，从而允许表达目的序列。

本发明包括用于构建合适的RNA序列的方法和系统，使用该方法和系统，在引入任何细胞类型后，可以仅在限定的细胞类型中诱导靶序列或由其产生的基于氨基酸的结构的功能，并在所有其他细胞类型中阻止这种情况发生。

为了解决在引入整个生物体或其部分后mRNA分子在某些细胞类型中的限定表达的问题，在本专利申请的上下文中组合了不同的序列基序，使得目标序列的功能性翻译仅能在期望的细胞类型中发生，而在其他细胞类型中是不可能的。通过调整序列基序，可以调整或完全逆转激活和失活之间的细胞类型依赖性相互作用。通常，该系统被安排成使得5'区域中的上游序列调控该系统的稳定性，同时抑制或总体调控3'区域中的目标序列基序。3'区域内的受抑制序列特别是内部核糖体进入位点(IRES)序列，其可以用作二级翻译起点。通过mRNA分子内的碱基配对的抑制被长久保持，直到合适的靶细胞中的mRNA遇到细胞类型特异性的内源mRNA分子，所述mRNA分子与引入的mRNA的5'区域中的序列形成反义活性碱基配对，从而诱导引入的mRNA的前部区域降解。这消除了IRES的抑制，并允许靶序列的表达。根据图2中所示，详细描述形成了细胞类型特异性可调控的mRNA分子，其在下面更详细地解释。在这种情况下，根据需要，也可以去除单个序列基序，按顺序交换，用其他基序替换，或用其他基序补充。

图2是用于在器官范围或生物体范围内引入mRNA分子后，在特定细胞类型中选择性表达靶序列的mRNA分子的示意图。

1)任选地使用CAP序列。该序列可以是天然的7-甲基鸟苷(m7G)帽，或者也可以含有化学或其他修饰。CAP序列用于调控初级序列的稳定性和翻译效率。对于某些应用，如开发具有低稳定性的RNA分子或RNA片段，也可以省去CAP序列。

2)使用5'非翻译序列。该序列主要用于调控引入的mRNA稳定性(半寿期)。核苷酸序列可以是合成的、天然的或来自已知基因的序列。根据所需的稳定性，可以将额外的序列单独或组合地整合到该区域中，其调控稳定性和翻译速率。实例是G-四链体(同时具有低翻译速率和高mRNA稳定性)或内切核酸酶的结合位点(mRNA稳定性的降低)。5'非翻译序列的长度可以自由选择，并且根据需要可以为零。

3)在5'非翻译序列之后，真正的调控盒启动人工引入的mRNA分子的细胞类型特异性表达。起始点是引入的mRNA内的反义或RNAi活性反编码序列，其针对在所期望的细胞类型中特异性表达的基因。如果将mRNA构建体引入其中未转录细胞类型特异性基因的细胞中，则不发生相互作用。然而，如果存在这种有义mRNA，则在有义链和反义链之间存在碱基配对，结果诱导有义链和反义链随后降解。降解本身由所有细胞中的保守蛋白复合物引发和实施，特别是酶复合物RISC(RNA诱导的沉默复合物)和核糖核酸酶Dicer和Drosha起重要作用(Sontheimer EJ(2005)“Assembly and function of RNA silencing complexes.”Nature Reviews Molecular Cell Biology.6:pp.127-138)。取决于周围的序列，降解可能涉及整个引入的mRNA链或受其他序列的限制。

基于对几乎每种细胞类型或组织的现代转录组或蛋白质组分析，细胞类型特异性或组织特异性蛋白质表达方式是众所周知的现有技术，并且可以容易地作为预选的基础(参见例如，Ko et al.PNAS,2013,110:pp.3095-3100，或Whitfield et al.PNAS,2003,100:pp.12319-12324)。

为了识别具有最大可能的反义功能的合适反编码元件(3)，可以考虑不同的参数。参见，例如：Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,Yalcin A,Weber K,TuschlT.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in culturedmammalian cells.Nature.2001May 24；411(6836):pp.494-8；Elbashir SM,Lendeckel W,Tuschl T.RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs.GenesDev.2001Jan 15；15(2):pp.188-200；Reynolds A,Leake D,Boese Q,Scaringe S,Marshall WS,Khvorova A.Rational siRNA design for RNA interference.NatBiotechnol.2004Mar；22(3):pp.326-30。

根据本发明，在这种情况下以下参数应该起作用：

·反编码序列，优选在起始密码子下游50至100nt；

·搜索序列基序AA(N₁₉)TT或NA(N₂₁)，或NAR(N₁₇)YNN，其中N＝任何核苷酸，R＝嘌呤，且Y＝嘧啶；

·反编码序列，优选G+C含量为35-60％；

·避免连续使用四个或更多相同的核苷酸；

·避免与其他基因具有高度同源性的序列基序。

4)反义/RNAi活性序列之后是能够与构建体的3'区域中的IRES或IRES样序列产生碱基配对或以其他方式相互作用的序列，从而起到IRES闭锁序列的作用。由于IRES序列自身也能够作为不依赖于CAP的翻译启动子主要仅通过特异构建的二级结构发挥作用，IRES闭锁序列和IRES序列之间的额外碱基配对改变了这些序列，使得只要IRES闭锁序列存在IRES依赖性翻译起始就不会发生。IRES闭锁发生在引入的mRNA的全长处。由于mRNA长度的限定诱导变化仅在特异性反义/RNAi序列与有义mRNA结合时发生，因此IRES活性在不具有合适的有义mRNA的所有细胞中被去除。然而，特定细胞类型中这种有义mRNA的存在导致反义结合，从而诱导引入的mRNA降解，结果IRES闭锁序列的序列受到影响并因此丧失其针对IRES序列二级结构形成的闭锁作用。IRES闭锁序列的特征在于其：i)含有IRES序列的反编码部分，与ii)IRES序列的一个或多个序列部分结合，iii)可以包含IRES序列反编码部分之间的间隔序列，所述间隔序列可包含长度和核苷酸组成不同的组合，iv)优选结合IRES的茎序列或环序列以改变其二级结构，v)所述序列相对于自身通常不产生反义或RNAi活性的IRES反编码核苷酸具有可变的长度。在这种情况下，借助于闭锁序列，IRES的二级结构的改变可以最小化，以便有效地使IRES的功能失活，并允许在闭锁序列降解时重新折叠IRES序列。为了最大可能地结合IRES闭锁序列和IRES，IRES闭锁序列的序列可以被长度可能不同的接头序列的前后序列基序包围。

5)为了在有义和反义/RNAi mRNA基序结合后，将引入的mRNA的完全降解限制在其特定区域，必须掺入mRNA序列基序，其中断由于结合配体或二级结构引起的降解。此类序列基序可包括发夹环或茎环。它们可以用于在5'和3'方向上有义-反义配对的单个或多个比对。使用通常通过二级结构或结合配体来稳定的序列基序，与靶细胞中具有有义配对的特异性反义/RNAi盒组合，导致mRNA降解的中断，从而导致位于该序列的3'方向的RNA基序的稳定化。这时，稳定的二级结构接着在稳定性方面承担CAP的功能，但不涉及翻译起始。在没有发生有义-反义配对的细胞中，mRNA的总长度得以保留，并且环结构保持而不具有有意义的功能。稳定的mRNA二级结构可以与具有或不具有连接序列(接头)的相邻序列基序连接。

6)由于翻译起始所必需的CAP序列在靶细胞中被切除，因此必须将CAP非依赖性核糖体结合位点整合到稳定的mRNA二级结构后面的序列中，以启动肽或蛋白形成。为此目的，在3'方向掺入IRES或类似的翻译起始序列，由于其发展的二级结构该序列通常允许直接结合核糖体亚基。IRES序列可以是细胞的、病毒的或合成的。由于IRES闭锁序列与相同全长mRNA构建体中的IRES序列匹配，闭锁序列阻止了通过碱基配对启动翻译所必需的IRES二级结构的形成，因此IRES序列在非靶细胞中是无活性的，并且与其一起存在完整的mRNA。相反，在靶细胞中，IRES闭锁序列的降解通过有义-反义/RNAi相互作用而发生，其中通过能量驱动的过程形成功能性IRES二级结构，并且可以用于后续编码序列的翻译。IRES序列可以在有或没有接头序列的情况下与周围的序列基序结合。或者，可以使用被认为不是IRES但仍可充当翻译启动子的核苷酸序列。

7)可以在使用的IRES或IRES样结构的3'位置引入编码序列，其通过翻译转录成肽或蛋白。这些序列基序的翻译仅在其中IRES序列有活性的细胞中发生，即在其中内源有义序列也转录成引入的mRNA内的反义/RNAi基序的靶细胞中。待翻译的RNA序列可编码任何所期望的氨基酸序列，因此，例如形成治疗活性肽和蛋白、毒素、抗体、白细胞介素或表面受体。

8)在限定的可翻译阅读框之后，在3'方向上还需要序列，这反过来确保全长mRNA和在靶细胞中截短的mRNA的稳定性。这些序列包括3'非翻译区和poly(A)尾，尾部也是几乎每种内源mRNA的特征。根据需要，可以使用内源或合成的序列基序。根据mRNA构建体的所需稳定性，这可以通过适当选择序列基序以靶向方式进行调节。在这种情况下，i)在基序内形成的二级结构，ii)用于稳定/去稳定因子的可能结合位点，和iii)poly(A)尾的长度，是特别重要的。

基于该系统，首次实现靶序列的选择性调节表达，即使将mRNA分子引入整个生物体时也是如此。

可以以各种方式将本发明的RNA构建体引入靶细胞中。它们可以通过转染、膜融合、电穿孔或作为逆转录病毒载体进入细胞。例如，WO02/44321公开了将外源靶基因导入细胞中。

在本发明一个具体实施方案中，反编码元件(a)与由靶细胞表达的mRNA的相互作用导致闭锁元件(b)的降解或失活，从而可发生目标多肽的翻译。在进一步的实施方案中，稳定元件(c)mRNA的降解被阻止。

在本发明进一步优选的实施方案中，反编码元件(a)具有下列一个或多个特征，并且在引入靶细胞后具有以下功能：

(i)与靶细胞特异性的RNA序列连接；

(ii)形成可自由调节长度的双链RNA杂合体；

(iii)在双链RNA杂合体区域诱导引入的RNA构建体的细胞降解。

在本发明进一步优选的实施方案中，闭锁元件(b)具有下列一个或多个特征：

(i)翻译起始因子元件(d)的功能被抑制；

(ii)所述闭锁元件可在适当条件下被降解或失活；

(iii)对所述翻译起始因子元件的抑制功能在闭锁元件失活或降解后是可逆的；

(iv)所述闭锁元件通过在所述翻译起始因子元件的序列中或附近进行碱基配对来执行其功能，从而改变其二级结构；

(v)所述闭锁元件通过使其他分子直接或间接抑制所述翻译起始因子元件来执行其功能。

在本发明进一步优选的实施方案中，稳定元件(c)具有下列一个或多个特征：

(i)核苷酸序列，其阻止外切核酸酶和/或内切核酸酶在3'方向上降解RNA；

(ii)核苷酸序列，其特征在于，其形成稳定的二级结构如茎环；

(iii)核苷酸序列，其特征在于，稳定元件如肽或蛋白与RNA结合；

(iv)核苷酸序列，其特征在于，分子与RNA结合并对RNA 5'末端进行化学稳定修饰。

在本发明进一步优选的实施方案中，翻译起始因子元件(d)具有下列一个或多个特征：

(i)细胞类型依赖性、选择性抑制翻译起始功能；

(ii)仅在调节盒的组件(元件a和b)降解或失活时具有功能；

(iii)仅在靶细胞中具有功能，而翻译起始因子元件在所有其他细胞类型中失活；

(iv)无论初始RNA构建体的5'区域中的帽结构如何，均可诱导翻译；

(v)通过直接或间接结合核糖体亚基或完整核糖体(例如IRES序列)来诱导翻译；

(vi)在去除闭锁元件的抑制后，通过形成或释放特定二级结构来诱导翻译；

(vii)在去除闭锁元件的抑制后，通过连接特定分子或化学修饰来诱导翻译。

在本发明特别优选的实施方案中，所述RNA构建体具有反编码的和IRES依赖性表达调控的组合。

闭锁元件的降解可以，例如通过反义或siRNA依赖性mRNA降解系统发生。文献中称为“RNA干扰”(RNAi)的现象是基于这样的事实：细胞中的短RNA分子(siRNA、小干扰RNA)可以与信使RNA(mRNA)相互作用(文献：Fire A.,Xu S.,Montgomery M.K.,Kostas S.A.,Driver S.E.,Mello C.C.,Nature Feb 19,1998；391(6669):pp.744-745)。由于酶控制的复杂机制(例如通过DICER和RISC复合物)，存在mRNA的降解。除了siRNA之外，还发现了其他小RNA种类，如“微小RNA”(miRNA)或“短发夹RNA”(shRNA)，它们也可以通过相关机制抑制蛋白表达。

由闭锁元件的降解和/或失活诱导的RNA构建体在靶细胞中的翻译起始，是涉及多种因子的协同相互作用的复杂过程(Pain,V.M.,1996,Eur.J.Biochem.236,pp.747-771)。对于大多数mRNA，第一步是在其5'末端或附近将核糖体40S亚基募集到RNA(图1)。通过帽结合复合物eIF4F，40S与mRNA的结合变得更容易。因子eIF4F由三个亚基组成：RNA解旋酶eIF4A、帽结合蛋白eIF4E和多重适配蛋白eIF4G，其作为复合物中的蛋白框架和eIF4E、eIF4a、eIF3的结合位点，并具有poly(A)结合蛋白。

用各种RNA病毒感染细胞导致选择性抑制宿主mRNA的翻译而不是病毒的翻译。例如，用脊髓灰质炎病毒(一种细胞质RNA病毒)感染细胞导致多种翻译起始因子的修饰。特别是，病毒编码的蛋白酶对两种形式的eIF4G、eIF4GI和eIF4GII的蛋白水解(Gradi etal.1998,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95,pp.11089-11094)导致对大多数具有帽的细胞mRNA的翻译抑制。相反，在5'UTR中含有特异性序列(该序列包含450个核苷酸并且可以在缺少完整eIF4F的情况下募集40S亚基)作为IRES的脊髓灰质炎病毒mRNA的翻译不被抑制(Jang etal.1988J.Virol.62,pp.2363-2643)。已经在小核糖核酸病毒、黄病毒、瘟病毒、逆转录病毒、慢病毒和昆虫病毒RNA以及动物细胞RNA中发现了IRES元件。已知IRES序列基序的综述代表了科学知识的现状(作为综述参见http://www.iresite.org(截至2.1.2017))。含有IRES的动物mRNA可以通过它们的5'帽端和它们的IRES元件募集核糖体亚基。结果，在依赖于帽的翻译减少的条件下，例如在病毒感染期间，在细胞周期的G2/M期，凋亡或应激条件下，翻译是可能的(Johannes et al.(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,pp.13118-13123；Cornelis et al.(2000),molecular Cell 5,pp.597-605；Pyronnet et al.(2000),molecular Cell 5,pp.607-616；Stein et al.,1998,Mol.and Cell.Biol.18,pp.3112-3119；Holcik et al.,2000,Oncogene19,pp.4174-4177；Stoneley et al.,2000,mol.and Cell.Biol.20,pp.1162-1169)。在降低浓度的帽结合复合物eIF4F下，高达3％的动物细胞mRNA被翻译(Johannes et al.,1999)。

对于本发明的RNA构建体，可以使用多个不同的IRES元件作为翻译起始因子元件。例如，现有技术描述了用于在动物细胞中(US 6 060 273；US 6 114 146；US 5 358 856；US6 096 505；US 171 821；US 5 766 903)、植物细胞中(WO 98/54342)，以及更普遍地，在真核细胞中(US 171 821；US 5766 903；US 5 925 565；US 6 114 146)，进行线性多顺反子mRNA中外源基因的帽不依赖性表达的IRES元件。

例如，IRES元件的二级结构保持不受影响，因此只有通过选择合适的闭锁元件(b)才能发挥作用并改变(＝失活)。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述RNA构建体具有一个或多个下列任选的特征：

(i)5'帽序列，以增加整个mRNA构建体的稳定性；

(ii)5'非翻译区，以便能够调节整个mRNA构建体的稳定性并抑制5'帽诱导的翻译(例如掺入四链体序列)；

(iii)3'非翻译区，以增加靶细胞中整个mRNA构建体和加工的mRNA部分片段的稳定性；

(iv)poly(A)区，以增加靶细胞中整个mRNA构建体和加工的mRNA部分片段的稳定性；

(v)权利要求1至8的整个mRNA构建体的所有元件可含有元件本身内或单个元件之间任意长度的接头序列。接头序列可以是无功能的，并且用于单个元件的纯空间分离，或用于将附加功能整合到系统中。

实施例：

1.)用于在限定的细胞类型中选择性表达靶序列的功能系统的核苷酸序列(图12)

通过标准分子生物学程序(PCR、连接和转化)，将人基因组的角蛋白13基因的短序列(以上用短的角蛋白(KERATIN)标记)作为反义与所谓的环(LOOP)序列连接。环序列包括有助于该构建体灵活性的接头序列、闭锁序列和形成稳定二级结构(环)的核苷酸序列。虽然闭锁序列能够通过碱基配对与IRES的序列部分相互作用，从而改变其二级结构，但环的二级结构导致外核酸酶活性的中断(参见Chapman et al.,eLife,2014,3:e01892)。随后的序列部分代表脑心肌炎病毒的IRES(Bochkov andPalmenberg,BioTechniques,2006,41:pp.283-292)和绿色荧光蛋白(eGFP)的编码序列。如果省略闭锁序列，则IRES允许翻译后续序列—在这种情况下，这里是为了易于检测而选择eGFP的。仅当所选细胞类型中存在反义序列(短的角蛋白)的互补有义序列用于结合时，才省略闭锁序列。

2.)用于在限定的细胞类型中选择性表达靶序列的具有替代的反义序列的功能系统的核苷酸序列(图13)

通过标准分子生物学程序(PCR、连接和转化)，将人基因组的角蛋白13基因的长序列(以上用角蛋白标记)作为反义与所谓的环序列连接。环序列包括有助于构建体灵活性的接头序列、闭锁序列和形成稳定二级结构(环)的核苷酸序列。虽然闭锁序列能够通过碱基配对与IRES的序列部分相互作用，从而改变其二级结构，但环的二级结构导致外核酸酶活性的中断(参见Chapman et al.,eLife,2014,3:e01892)。随后的序列部分代表脑心肌炎病毒的IRES(Bochkov and Palmenberg,BioTechniques,2006,41:pp.283-292)和绿色荧光蛋白(eGFP)的编码序列。如果省略闭锁序列，则IRES允许翻译后续序列—在这种情况下，这里是为了易于检测而选择eGFP的。仅当所选细胞类型中存在反义序列(角蛋白)的互补有义序列用于结合时，才省略闭锁序列。

3.)用于在限定的细胞类型中选择性表达靶序列的具有替代的反义序列和替代的闭锁序列的功能系统的核苷酸序列(图14)

通过标准分子生物学程序(PCR、连接和转化)，将人基因组的角蛋白13基因的长序列(以上用角蛋白标注)作为反义与所谓的环序列连接。环序列包括有助于构建体灵活性的接头序列、闭锁序列和形成稳定二级结构(环)的核苷酸序列。虽然闭锁序列能够通过碱基配对与IRES的序列部分相互作用，从而改变其二级结构，但环的二级结构导致外核酸酶活性的中断(参见Chapman et al.,eLife,2014,3:e01892)。随后的序列部分代表脑心肌炎病毒的IRES(Bochkov and Palmenberg,BioTechniques,2006,41:pp.283-292)和绿色荧光蛋白(eGFP)的编码序列。如果省略闭锁序列，则IRES允许翻译后续序列—在这种情况下，这里是为了易于检测而选择eGFP。仅当所选细胞类型中存在反义序列(角蛋白)的互补有义序列用于结合时，才省略闭锁序列。

4.)细胞类型依赖性、闭锁序列IRES控制的、GFP的选择性表达(图15)

用GFP表达质粒作为阳性对照，处理具有(WT)和不具有(敲除角蛋白13突变体＝KO)角蛋白13mRNA的小鼠表皮细胞(角质形成细胞)。24小时后，使用光学显微镜(灰色)和荧光显微镜(绿色)检查细胞。作为传递的结果，在两种细胞系中都可以看到GFP的均一高表达。

通过使用图1(克隆174)和图2(克隆215)中产生的构建体，GFP的表达在表达角蛋白13mRNA的那些细胞中高度优选地发生，并且在角蛋白13基因缺失的细胞中几乎不发生。这种结果是合理的，因为在缺少角蛋白13mRNA的情况下，所产生的mRNA构建体内的阻断序列与IRES序列相互作用，并且通过改变IRES二级结构，抑制其功能并因此抑制GFP表达。相反，在存在角蛋白13mRNA(WT)的情况下，所产生的mRNA构建体通过有义-反义相互作用降解直到环，其结果是闭锁序列消失。结果，启动了IRES的功能，并表达了GFP。

5.)用于选择性表达靶基因的功能系统的定量评估(图16)

如图4所述，野生型和角蛋白13突变细胞均装载有不同的功能系统。24小时后，通过流式细胞术在所有细胞中测量所选靶蛋白GFP的表达水平。每次测量评估至少5000个细胞。WT和角蛋白13-/-突变之间的所有差异都非常显著。

序列表

<110> 阿瑞纳生物公司

<120> 用于真核细胞中RNA分子的细胞类型特异性翻译的系统和方法

<130>

<150> DE102017103383.1

<151> 2017-02-20

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 402

<212> DNA

<213> 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)

<400> 1

gccagccccc gattgggggc gacactccac catagatcac tcccctgtga ggaactactg 60

tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac 120

cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag 180

gacgaccggg tcctttcttg gatcaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc 240

gcgagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg 300

gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catgagcacg aatcctaaac 360

ctcaaagaaa aaccaaacgt aacaccaacc gccgcccaca gg 402

<210> 2

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<221> gene

<222> ()..()

<223> 具有3个稳定元件的IRES序列(图6中位置6)

<400> 2

gccagccccc gattgggggg ccagcccccg attggggggc cagcccccga ttggggggcc 60

agcccccgat tgggggcgac actccaccat agatcactcc cctgtgagga actactgtct 120

tcacgcagaa agcgtctagc catggcgtta gtatgagtgt cgtgcagcct ccaggacccc 180

ccctcccggg agagccatag tggtctgcgg aaccggtgag tacaccggaa ttgccaggac 240

gaccgggtcc tttcttggat caacccgctc aatgcctgga gatttgggcg tgcccccgcg 300

agactgctag ccgagtagtg ttgggtcgcg aaaggccttg tggtactgcc tgatagggtg 360

cttgcgagtg ccccgggagg tctcgtagac cgtgcaccat gagcacgaat cctaaacctc 420

aaagaaaaac caaacgtaac accaaccgcc gcccacagg 459

<210> 3

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<221> gene

<222> ()..()

<223> 具有3个稳定元件(图8中位置5，加下划线)和接头序列(图8中位置4a，加框)的初级IRES序列(图8中位置6)

<400> 3

ataaataaat aaaataaata aataaaataa ataaataaag ccagcccccg attggggggc 60

cagcccccga ttggggggcc agcccccgat tggggggcca gcccccgatt gggggcgaca 120

ctccaccata gatcactccc ctgtgaggaa ctactgtctt cacgcagaaa gcgtctagcc 180

atggcgttag tatgagtgtc gtgcagcctc caggaccccc cctcccggga gagccatagt 240

ggtctgcgga accggtgagt acaccggaat tgccaggacg accgggtcct ttcttggatc 300

aacccgctca atgcctggag atttgggcgt gcccccgcga gactgctagc cgagtagtgt 360

tgggtcgcga aaggccttgt ggtactgcct gatagggtgc ttgcgagtgc cccgggaggt 420

ctcgtagacc gtgcaccatg agcacgaatc ctaaacctca aagaaaaacc aaacgtaaca 480

ccaaccgccg cccacagg 498

<210> 4

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<221> gene

<222> ()..()

<223> 具有3个稳定元件(图10中位置5，加下划线)、接头序列(图8中位置4a，加框)和闭锁序列的初级IRES序列(图10中位置6)

<400> 4

cccaacacta taaataaata aaataaataa ataaaataaa taaataaagc cagcccccga 60

ttggggggcc agcccccgat tggggggcca gcccccgatt ggggggccag cccccgattg 120

ggggcgacac tccaccatag atcactcccc tgtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag 180

cgtctagcca tggcgttagt atgagtgtcg tgcagcctcc aggacccccc ctcccgggag 240

agccatagtg gtctgcggaa ccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt 300

tcttggatca acccgctcaa tgcctggaga tttgggcgtg cccccgcgag actgctagcc 360

gagtagtgtt gggtcgcgaa aggccttgtg gtactgcctg atagggtgct tgcgagtgcc 420

ccgggaggtc tcgtagaccg tgcaccatga gcacgaatcc taaacctcaa agaaaaacca 480

aacgtaacac caaccgccgc ccacagg 507

<210> 5

<211> 1619

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<221> gene

<222> ()..()

<223> 用于在限定的细胞类型中选择性表达靶序列的功能系统的核苷酸序列(角蛋白13)

<400> 5

acgcaccggt cggcctcctc ccagctggca agagccaccc ccgaaaccac ctccatagct 60

ggcagaggag ctctgcaggc ggaggctcat gaattcgtta tgttatgacc ttgctcgtca 120

agaagacagt tatgttatta aaagtcaggt cggatcaagc catagtacgg aaaaaactat 180

gctacctgtg agccccgtcc aaggacgtgc ggccgctaaa agaagtcagg ccatcacaaa 240

tgccacagct tgagtaaact gtgcagcctg tagctccacc tgagaaggtg taaaaaagtt 300

atgttatgga tcccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa ggccggtgtg 360

cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg agggcccgga 420

aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc gccaaaggaa 480

tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct tgaagacaaa 540

caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac aggtgcctct 600

gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc cagtgccacg 660

ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta ttcaacaagg 720

ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg cctcggtgca 780

catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga 840

cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata atatggccac aaccatgtct agaatggtga 900

gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg 960

taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc 1020

tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga 1080

ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg 1140

acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg 1200

acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc 1260

gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg 1320

agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca 1380

aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact 1440

accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga 1500

gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg 1560

agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taagtcgac 1619

<210> 6

<211> 2164

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<221> gene

<222> ()..()

<223> 用于在限定的细胞类型中选择性表达靶序列的具有替代的反义序列的功能系统的核苷酸序列

<400> 6

acgcaccggt tgatgtcggc ctccacgctc tggcgcaggg ccagctcatt ctcatacttg 60

agcctgaagt cgtccgcagc cagcctggca ttgtcaatct ccaggatgac ccggttgttt 120

tcaatggtgg cggtcaggat cttgtcccgg agctcttcaa tggtcttgta gtaggggctg 180

tagtcccgct cagggctagc tgggctctgc ttcaggtgcc agtcacggat cttcacctcc 240

aggtcagcgt tggcctcctc cagggcgcgc accttctcca ggtaggaagc caggcggtcg 300

ttgaggttct gcatggtgat cttctcattg ccagtgagga ggccgccatc acaagcacca 360

aagtcaacaa agccaccagc aaaaccccca ccaaagccac ctccaaggcc acctccatag 420

ccacctccaa ggccacctcc atagccacct ccaaagccac taccagcccc tccaccaaaa 480

ccacagctca cgccgcctcc atagccccca gctgatcccc cagacacaaa ccgagttgaa 540

caggtagaga caccacggcc tcctcccagc tggcaagagc cacccccgaa accacctcca 600

tagctggcag aggagctctg caggcggagg ctcatgaatt cgttatgtta tgaccttgct 660

cgtcaagaag acagttatgt tattaaaagt caggtcggat caagccatag tacggaaaaa 720

actatgctac ctgtgagccc cgtccaagga cgtgcggccg ctaaaagaag tcaggccatc 780

acaaatgcca cagcttgagt aaactgtgca gcctgtagct ccacctgaga aggtgtaaaa 840

aagttatgtt atggatcccc cccctaacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg 900

gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc 960

ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa 1020

aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag 1080

acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg 1140

cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg 1200

ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa 1260

caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg 1320

gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 1380

ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataatatg gccacaacca tgtctagaat 1440

ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg 1500

cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg 1560

caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct 1620

cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca 1680

gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt 1740

caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt 1800

gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa 1860

gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg 1920

catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga 1980

ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta 2040

cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct 2100

gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaagt 2160

cgac 2164

<210> 7

<211> 2175

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<221> gene

<222> ()..()

<223> 用于在限定的细胞类型中选择性表达靶序列的具有替代的反义序列和替代的闭锁序列的功能系统的核苷酸序列

<400> 7

acgcaccggt tgatgtcggc ctccacgctc tggcgcaggg ccagctcatt ctcatacttg 60

agcctgaagt cgtccgcagc cagcctggca ttgtcaatct ccaggatgac ccggttgttt 120

tcaatggtgg cggtcaggat cttgtcccgg agctcttcaa tggtcttgta gtaggggctg 180

tagtcccgct cagggctagc tgggctctgc ttcaggtgcc agtcacggat cttcacctcc 240

aggtcagcgt tggcctcctc cagggcgcgc accttctcca ggtaggaagc caggcggtcg 300

ttgaggttct gcatggtgat cttctcattg ccagtgagga ggccgccatc acaagcacca 360

aagtcaacaa agccaccagc aaaaccccca ccaaagccac ctccaaggcc acctccatag 420

ccacctccaa ggccacctcc atagccacct ccaaagccac taccagcccc tccaccaaaa 480

ccacagctca cgccgcctcc atagccccca gctgatcccc cagacacaaa ccgagttgaa 540

caggtagaga caccacggcc tcctcccagc tggcaagagc cacccccgaa accacctcca 600

tagctggcag aggagctctg caggcggagg ctcatgaatt cgttatgtta tgaactgctt 660

ccttcacgac attcaacaga ccttgttatg ttattaaaag tcaggtcgga tcaagccata 720

gtacggaaaa aactatgcta cctgtgagcc ccgtccaagg acgtgcggcc gctaaaagaa 780

gtcaggccat cacaaatgcc acagcttgag taaactgtgc agcctgtagc tccacctgag 840

aaggtgtaaa aaagttatgt tatggatccc ccccctaacg ttactggccg aagccgcttg 900

gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc 960

aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc 1020

cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa 1080

gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa ccccccacct 1140

ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca 1200

caaccccagt gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca 1260

agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat gggatctgat 1320

ctggggcctc ggtgcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa cgtctaggcc 1380

ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatat ggccacaacc 1440

atgtctagaa tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 1500

gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 1560

gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 1620

tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 1680

cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 1740

accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 1800

gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 1860

ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 1920

cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 1980

cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 2040

gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 2100

cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 2160

tacaagtaag tcgac 2175

Claims

1.在真核靶细胞中靶向翻译目标多肽的方法，其特征在于，将RNA构建体引入细胞中，所述RNA构建体在5’至3’方向具有至少下列元件：

(a)反编码元件(a)，其与靶细胞表达的基因的mRNA的至少一部分互补；

(c)稳定元件(c)；

(d)翻译起始因子元件(d)；

(e)编码所述目标多肽的序列(e)，

在非靶真核细胞中通过闭锁元件(b)与翻译起始因子元件(d)的碱基配对阻止目标多肽的翻译，并且在真核靶细胞中由于通过反编码元件与靶细胞表达的mRNA相互作用诱导的RNA构建体加工而发生所编码多肽的翻译。

2.如权利要求1所述的方法，其中反编码元件(a)与靶细胞表达的mRNA的相互作用导致闭锁元件(b)的降解或失活，从而能发生目标多肽的翻译。

3.如权利要求2所述的方法，其中mRNA在稳定元件(c)上的降解被阻止。

4.如权利要求1-3中一项或多项所述的方法，其特征在于，反编码元件(a)具有下列一个或多个特征：

(i)与靶细胞特异性的RNA序列连接；

(ii)形成可自由调节长度的双链RNA杂合体；

(iii)在双链RNA杂合体区域诱导引入的RNA构建体的细胞降解。

5.如权利要求1-4中一项或多项所述的方法，其特征在于，闭锁元件(b)具有下列一个或多个特征：

(i)翻译起始因子元件(d)的功能被抑制；

(ii)闭锁元件(b)能够在适当条件下被降解或失活；

(iii)对翻译起始因子元件(d)的抑制功能在闭锁元件失活或降解后是可逆的；

(iv)闭锁元件(b)通过在翻译起始因子元件(d)的序列中或附近进行碱基配对来执行其功能，从而改变其二级结构；

(v)闭锁元件(b)通过使其他分子直接或间接抑制翻译起始因子元件(d)来执行其功能。

6.如权利要求1-5中一项或多项所述的方法，其特征在于，稳定元件(c)具有下列一个或多个特征：

7.如权利要求1-6中一项或多项所述的方法，其特征在于，翻译起始因子元件(d)具有下列一个或多个特征：

(i)细胞类型依赖性、选择性抑制翻译起始功能；

(ii)仅在调节盒的组件(元件a和b)降解或失活时具有功能；

(iv)无论初始RNA构建体的5'区域中的帽结构(例如IRES序列)如何，均诱导翻译；

(v)通过直接或间接结合核糖体亚基或完整核糖体来诱导翻译；

(vi)在去除闭锁元件的抑制后，通过形成特定二级结构来诱导翻译；

8.如权利要求1-7中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述RNA构建体具有一个或多个下列任选的特征：

(i)5'帽序列，以增加整个mRNA构建体的稳定性；

(iii)3'非翻译区，以调节靶细胞中整个mRNA构建体和加工的mRNA部分片段的稳定性；

(iv)poly(A)区，以调节靶细胞中整个mRNA构建体和加工的mRNA部分片段的稳定性；

(v)权利要求1至8的整个mRNA构建体的所有元件在元件本身内或单个元件之间含有任意长度的接头序列。接头序列能够是无功能的，并且用于单个元件的纯空间分离，或用于将附加功能整合到系统中。

9.在真核靶细胞中靶向翻译目标多肽的RNA构建体，其中所述构建体在5’至3’方向具有至少下列元件：

(a)反编码元件(a)，其与靶细胞表达的DNA部分的RNA的至少一部分互补或诱导细胞类型特异性降解；

(d)翻译起始因子元件(d)，其独立于5'帽发挥功能并且仅在靶细胞中有活性；

(e)编码所述目标多肽的序列(e)；

在非靶真核细胞中通过闭锁元件(b)与翻译起始元件(d)的碱基配对阻止目标多肽的翻译，并且在真核靶细胞中由于反编码元件(a)与靶细胞表达的RNA相互作用发生RNA构建体的特异性加工，由此激活翻译起始因子元件而翻译所编码的多肽。

10.如权利要求9所述的RNA构建体，其特征在于下列一个或多个特征：

(i)反编码元件(a)，其具有权利要求4的一个或多个特征；

(ii)闭锁元件(b)，其具有权利要求5的一个或多个特征；

(iii)稳定元件(c)，其具有权利要求6的一个或多个特征；

(iv)翻译起始因子元件(d)，其具有权利要求7的一个或多个特征；和/或

(v)mRNA构建体，其具有权利要求8的一个或多个特征。