CN110306289A

CN110306289A - 一种含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110306289A
Application number: CN201910679820.0A
Authority: CN
Inventors: 张永军; 冯蓓; 周广东; 王宗鑫
Original assignee: First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2019-10-08
Also published as: CN111560709A

Abstract

本发明提供了一种含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜，由阿西替尼、明胶和聚己内酯组成。本发明还提供了上述含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜的制备方法，按照质量比称取阿西替尼、明胶和聚己内酯，将阿西替尼、明胶和聚己内酯加入含有乙酸的三氟乙醇溶液中，搅拌均匀，静置，直至溶液变透明，得到含阿西替尼的明胶聚己内酯电纺液；抽取上述电纺液，固定在高压静电纺丝装置上，以铝箔为接受装置，调节电纺参数后进行电纺；电纺完毕，将电纺膜真空干燥后，得到含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜。本发明方法制得的含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜可以有效防止骨髓间充质干细胞再生软骨在皮下发生骨化。

Description

一种含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物材料领域，涉及一种纳米纤维电纺膜，具体来说是一种含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜及其制备方法和应用。

背景技术

软骨再生能力差，其缺损的修复一直是临床治疗的难题。组织工程技术为软骨缺损的修复提供了新途径，但是种子细胞的来源限制了它的应用。使用软骨细胞作为种子细胞，额外增加了取材部位的损伤。另外，软骨细胞在体外扩增过程中容易发生肥大化，逐渐丧失软骨细胞表型。

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSC）是一类优势明显的种子细胞，取材方便，创伤小，体外扩增能力强，在一定条件下可被诱导成良好的再生软骨。BMSC再生软骨在关节环境中，可以形成良好的软骨组织，得到了广泛应用；但在皮下环境中（如耳、鼻、气管处），BMSC再生软骨很容易发生血管化和骨化，丧失软骨表型和结构。这种现象严重阻碍了BMSC再生软骨用于修复皮下的软骨缺损（如耳、鼻、气管的软骨缺损），成为临床转化的瓶颈。

目前研究者们采用各种方法来抑制BMSC再生软骨的骨化：（1）Fu Wei等人[FuWei， et al. Electrospun gelatin/polycaprolactone nanofibrous membranescombined with a coculture of bone marrow stromal cells and chondrocytes forcartilage engineering. Int J Nanomedicine， 2015， (10): 2089-2099]将BMSC和软骨细胞混合培养来构建软骨组织。软骨细胞可以通过旁分泌的方式诱导BMSC软骨化。但要经历二次手术；软骨取材部位受损，创伤大。（2）Liu Kai等人[Liu Kai， et al. Thedependence of in vivo stable ectopic chondrogenesis by human mesenchymal stemcells on chondrogenic differentiation in vitro. Biomaterials， 2008， 29: 2183-2192]延长体外软骨化诱导时间，来提高软骨成熟度。成熟软骨可通过自分泌的方式产生足够的促软骨化因子，对抗骨化。但是体外诱导周期过长，会增加经济成本和移植等待时间，不利于临床转化。

发育生物学的研究表明，软骨骨化的关键是血管化。皮下环境中血管丰富，促血管化物质较多。促血管化物质，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor， VEGF）可诱导血管内皮细胞入侵再生软骨组织并形成血管，从而使成骨细胞、破骨细胞向软骨组织的基质内转移，进而骨化。因此，如何抵抗血管化成为预防BMSC再生软骨在皮下发生骨化的关键。如果支架材料负载抗血管化物质，与BMSC结合形成三维结构的细胞-材料复合物经体外诱导成软骨组织后植入皮下，可能会阻止血管入侵，进而防止再生软骨发生骨化。

明胶/聚己内酯（Polycaprolactone， PCL）纳米纤维电纺膜，是利用高压静电纺丝技术制备的一种纤维膜，纤维直径达到纳米级，制作方法简便，成本低。明胶/PCL纳米纤维电纺膜可以作为药物载体，载药量高，比表面积大。同时它的超细纤维能仿生细胞外基质的组成和结构，生物相容性高，可以与软骨细胞悬液结合，通过“三明治方法”构建三维结构的再生软骨（张文杰等人的发明：一种组织工程软骨的构建方法），实现平面到立体的转变。然而该发明还无法使用BMSC作为种子细胞构建在皮下不骨化的软骨。关于抗血管化物质的选择，大分子蛋白质（如软骨调节素-1、内皮抑素等）在体液环境中不稳定，容易失活。

上述的这些研究结果表明，目前防止BMSC再生软骨的在皮下骨化的方法对身体损伤大，体外组织培养周期长，成本高；目前单纯的电纺膜还无法使用BMSC作为种子细胞构建在皮下不骨化的软骨；负载抗血管化药物的电纺膜可能抵抗骨化，但如果药物是大分子蛋白质，后者在体内的活性难以保持。

Axitinib（阿西替尼）是一种小分子吲唑衍生物，化学结构稳定，分子式：C₂₂H₁₈N₄OS，分子量：386.47。阿西替尼于2012年1月获美国食品和药物管理局（FDA）批准上市，2015年4月获中国食药监局(CFDA)批准上市，用于治疗晚期肾细胞癌患者。阿西替尼具有显著的抗血管化活性，它可选择性地抑制血管内皮生长因子受体的活性，从而减少肿瘤血管生成，抑制肿瘤的生长。阿西替尼不具有累积毒性，治疗过程中的绝大多数副反应为轻度或中度，患者具有良好的耐受性。

发明内容

本发明提供了一种含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜及其制备方法和应用，所述的这种含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜及其制备方法和应用要解决现有技术中的单纯的电纺膜还无法使用BMSC作为种子细胞构建在皮下不骨化的软骨的技术问题。

本发明提供了一种含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜，由阿西替尼、明胶和聚己内酯组成，所述的阿西替尼、明胶和聚己内酯的质量比为0.025：0.1~0.3：0.2~0.5。

进一步的，所述的阿西替尼、明胶和聚己内酯的质量比为0.025：0.2：0.3。

本发明还提供了上述含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜的制备方法，包括如下步骤：

（1）按照质量比称取阿西替尼、明胶和聚己内酯，将阿西替尼、明胶和PCL（聚己内酯）加入含有乙酸的三氟乙醇溶液中，搅拌均匀，静置，直至溶液变透明，得到含阿西替尼的明胶聚己内酯电纺液；

（2）抽取上述电纺液，固定在高压静电纺丝装置上，以铝箔为接受装置，调节电纺参数后进行电纺；

（3）电纺完毕，将电纺膜真空干燥后，得到含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜。

进一步的，所述的含有乙酸的三氟乙醇溶液中，乙酸和三氟乙醇的体积比为0.5~2：1000。

本发明还提供了含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜在制备防止骨髓间充质干细胞再生软骨在皮下发生骨化的药物中的用途。

本发明还提供了阿西替尼在制备防止骨髓间充质干细胞再生软骨在皮下发生骨化的药物中的用途。

本发明将小分子药物Axitinib（一种VEGF受体抑制剂）加入到电纺液中，通过混纺技术得到一种载抗血管化物质的电纺膜。本发明中，电纺膜既作为抵抗骨化药物的载体，也作为细胞支架材料，优势互补。本发明使用明胶/PCL电纺膜成功负载具有抗血管化作用的药物Axitinib，从而使得构建的BMSC再生软骨在皮下不会发生骨化，保证了再生软骨的稳定性。

本发明采用的药物Axitinib是美国和中国批准应用于临床的抗肿瘤药物，安全性高； Axitinib容易在电纺液中溶解，可纺性高，制作简便，成本低；Axitinib为小分子药物，化学性质稳定，克服了大分子蛋白质的易失活缺点；本发明制作的电纺膜与BMSC悬液结合，通过“三明治方法”构建三维结构的BMSC-电纺膜复合物，诱导成软骨组织后植入皮下。在皮下能够抵抗骨化，相对于以往抗骨化的方法，操作简便，成本低，对身体创伤小，治疗周期短。

本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。

（1）本发明方法操作简单，成本低，耗时短，只需向原有电纺液中加入少量Axitinib进行电纺就能制作完成。Axitinib是临床用药，安全性较高；易溶于电纺液中，有较好的可纺性。

（2）本发明方法制得的载Axitinib的明胶/PCL纳米纤维电纺膜纤维表面光滑，直径小，很好地保持了纳米级纤维的生物相容性。

（3）本发明方法制得的载Axitinib的明胶/PCL纳米纤维电纺膜力学和缓释性能良好。

（4）本发明方法制得的载Axitinib的明胶/PCL纳米纤维电纺膜可以有效防止BMSC再生软骨在皮下发生骨化。

（5）本发明方法制得的载Axitinib的明胶/PCL纳米纤维电纺膜，作为一种防止骨化的生物医用材料，可望实现工业化生产。

附图说明

图1为不加和加Axitinib的明胶/PCL电纺液静置12小时后的图片（A），都为透明均质溶液。载Axitinib组及不载Axitinib组电纺膜大体观（分别为B、C），两组都呈白色薄片状。载Axitinib组及不载Axitinib组电纺膜的扫描电镜照片（分别为D、E），两组纤维表面光滑。载Axitinib组及不载Axitinib组电纺膜的拉伸曲线（F），加入Axitinib后力学性能提高。

图2为载Axitinib电纺膜的体外累积释放曲线，显示电纺膜中的药物可持续稳定释放8周以上。

图3显示了载与不载Axitinib的明胶/PCL电纺膜的生物相容性无差异。

图4显示通过“三明治方法”，利用BMSC和载与不载Axitinib电纺膜，成功制作出BMSC-电纺膜复合物（分别为A、a）。初步诱导成软骨组织后植入裸鼠皮下，8周后取材，B、C、D、E为载Axitinib组，b、c、d、e为不载Axitinib组；B、b为样本大体观，C、c为Masson染色，D、d为Masson染色照片的局部放大，E、e为Micro-CT扫描图像。

具体实施方式

实施例 1

（1）称取0.2 g 明胶、0.3 g PCL、0.025 g Axitinib于5 ml三氟乙醇（含5 ul乙酸）中。少量或大量制作电纺膜，仍可按此比例。室温下搅拌12小时至完全溶解，静置12小时，溶液透明无浑浊，Axitinib与其它物质均匀混合后，得到含Axitinib（浓度0.5%，g/ml）的明胶/PCL电纺液。

（2）选用10ml 的注射器（针头内径1.2 mm），抽取上述电纺液，固定在静电纺丝装置上进行电纺，采用铝箔为接受装置，设置以下参数：电压10 kv，针头与铝箔距离15 cm，注射速率2 ml/h，温度23 ℃，相对湿度80%，纺丝5小时，得到载Axitinib的明胶/PCL电纺膜。三氟乙醇和乙酸在纺丝过程中挥发，Axitinib被固定于电纺膜中。将电纺膜放入真空干燥箱干燥处理24小时，得到成品。

不载Axitinib的明胶/PCL电纺膜的制作方法同上，只是不加入Axitinib。

（3）扫描电镜显示，纤维表面光滑，无药物颗粒裸露，药物与材料很好的融合在一起；加入Axitinib后，材料的机械强度增加；药物累积缓释曲线显示材料中的药物可以缓慢持续释放8周以上（如图2所示），BMSC再生软骨在皮下发育成熟前，载Axitinib电纺膜能为其提供抵抗血管入侵，防止骨化的保护作用。

如图1所示，不加和加Axitinib的明胶/PCL电纺液静置12小时后的图片（A），都为透明均质溶液。载Axitinib组及不载Axitinib组电纺膜大体观（分别为B、C），两组都呈白色薄片状。载Axitinib组及不载Axitinib组电纺膜的扫描电镜照片（分别为D、E），两组纤维表面光滑。载Axitinib组及不载Axitinib组电纺膜的拉伸曲线（F），加入Axitinib后力学性能提高。

实施例 2

（1）使用实施例1载与不载Axitinib的明胶/PCL电纺膜，用角膜环钻将其裁切成直径15mm的圆形膜片，紫外线照射15分钟（波长240 nm，能量30 W），将其平铺于24孔板底部。使用细胞培养液配置BMSC细胞悬液，浓度为6×10⁴ cells/ml，每孔加入0.5 ml细胞悬液，所述的细胞培养液为低糖DMEM培养基，所述的低糖DMEM培养基中还含有质量百分比浓度为10%胎牛血清，青霉素、氯霉素各100 U/ml。将24孔板置于细胞培养箱中培养。在每个时间点（第1,3,5,7天），相对应的孔内加入50 ul的CCK8溶液（购自日本同仁公司），放入细胞培养箱中孵育2小时，吸取上清液，使用分光光度计测定在490 nm处的吸光度。两组膜片在每个时间点设置3个复孔，测量结果取平均值。实验重复3次。以此测定BMSC在电纺膜上的增殖活性，评价材料的生物相容性。

（2）结果如图3所示，两组吸光度并无统计学差异，表明载与不载Axitinib的明胶/PCL电纺膜的生物相容性无差异，电纺膜载Axitinib后并未明显影响其原有的生物相容性。这可能由于电纺膜的纳米级结构得到了保持；载药量合理，并未产生明显的细胞毒性。

实施例 3

（1）使用实施例1载与不载Axitinib的明胶/PCL电纺膜构建BMSC再生软骨。用角膜环钻，将电纺膜裁切成直径6 mm的圆形膜片，紫外线照射15分钟（波长240 nm，能量30 W）。将第2代BMSC用细胞培养液制备成6×10⁷ cells/ml浓度的细胞悬液。使用“三明治方法”构建具备三维结构的BMSC-电纺膜复合物，先用显微镊子在培养皿底部平铺一层电纺膜，然后在上面滴加5 ul细胞悬液，使其均匀覆盖电纺膜，再在细胞悬液上小心平铺一层电纺膜，重复以上操作，最上面一层为电纺膜，最终共叠加6层电纺膜，5层细胞悬液，每个复合物的细胞用量为3×10⁵ cells；利用BMSC和载与不载Axitinib电纺膜，成功制作出BMSC-电纺膜复合物（分别为图4A、图4a）。将其放入培养箱中培养2小时后，加入BMSC细胞培养液，所述的细胞培养液为低糖DMEM培养基，所述的低糖DMEM培养基中还含有质量百分比浓度为10%胎牛血清，碱性成纤维细胞生长因子5 ng/ml，青霉素、氯霉素各100 U/ml，放入细胞培养箱中继续培养。12小时候换为软骨诱导液，所述的软骨诱导液为高糖DMEM培养基，所述的高糖DMEM培养基中还含有质量百分比浓度为1%的牛血清白蛋白，L-谷氨酰胺300 ug/ml，抗坏血酸50ug/ml，青霉素、链霉素各100 U/ml，转化生长因子β₁10 ng／ml，类胰岛素生长因子100 ng／ml，地塞米松40 ng/ml，转铁蛋白6.25 ug/ml，体外初步诱导3周后，形成再生软骨组织，将其植入裸鼠皮下。8周后取材，进行组织学染色（Masson染色）、影像学（Micro-CT）检查。图4B、图4C、图4D、图4E为载Axitinib组，图4b、图4c、图4d、图4e为不载Axitinib组；图4B、图4b为样本大体观，图4C、图4c为Masson染色，图4D、图4d为Masson染色照片的局部放大，图4E、图4e为Micro-CT扫描图像。

（2）载Axitinib组的样本外观呈白色，不载Axitinib组呈血红色。Masson染色表明载Axitinib组的软骨陷窝明显，软骨基质丰富，无骨化区域；不载Axitinib组的组织结构遭到破坏，组织残缺有空洞，软骨基质极少，有骨化区域，并有红细胞浸润。影像学Micro-CT显示载Axitinib组无骨化区域，对照组骨化严重。

以上结果表明，载Axitinib的明胶/PCL纳米纤维电纺膜可以有效防止BMSC再生软骨在皮下发生骨化，保证软骨的稳定生长。

Claims

1.一种含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜，其特征在于：由阿西替尼、明胶和聚己内酯组成，所述的阿西替尼、明胶和聚己内酯的质量比为0.025：0.1～0.3：0.2～0.5。

2.权利要求1所述的一种含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜，其特征在于：所述的阿西替尼、明胶和聚己内酯的质量比为0.025：0.2：0.3。

3.权利要求1所述的含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)按照质量比称取阿西替尼、明胶和聚己内酯，将阿西替尼、明胶和聚己内酯加入含有乙酸的三氟乙醇溶液中，搅拌均匀，静置，直至溶液变透明，得到含阿西替尼的明胶聚己内酯电纺液；

(2)抽取上述电纺液，固定在高压静电纺丝装置上，以铝箔为接受装置，调节电纺参数后进行电纺；

(3)电纺完毕，将电纺膜真空干燥后，得到含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜。

4.根据权利要求3所述的含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜的制备方法，其特征在于：所述的含有乙酸的三氟乙醇溶液中，乙酸和三氟乙醇的体积比为0.5～2：1000。

5.权利要求1所述的含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜在制备防止骨髓间充质干细胞再生软骨在皮下发生骨化的药物中的用途。

6.阿西替尼在制备防止骨髓间充质干细胞再生软骨在皮下发生骨化的药物中的用途。