CN110302211A

CN110302211A - 三氧化二砷联合抗坏血酸在治疗结肠癌中的应用

Info

Publication number: CN110302211A
Application number: CN201910585498.5A
Authority: CN
Inventors: 杨宝峰; 初文峰; 刘宇
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Engineering University; Harbin Medical University
Priority date: 2019-07-01
Filing date: 2019-07-01
Publication date: 2019-10-08

Abstract

本发明公开了三氧化二砷联合抗坏血酸在治疗结肠癌中的应用。本发明将三氧化二砷和抗坏血酸进行合理配组，使二者的药理作用具有协同作用，达到“增效减毒”的目的，使低浓度的三氧化二砷即可发挥抗结肠癌的效果，减轻三氧化二砷使用过程中的毒副作用。本发明的提出为结肠癌的治疗提供了一种新的，有效的技术手段，在结肠癌治疗领域将具有广阔的应用前景。

Description

三氧化二砷联合抗坏血酸在治疗结肠癌中的应用

技术领域

本发明涉及一种治疗结肠癌的药物，特别涉及三氧化二砷联合抗坏血酸在治疗结肠癌中的应用，本发明属于医药技术领域。

背景技术

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，全球结直肠癌发病一直在飙升。近些年，逐年多发的结直肠癌一跃成为发病率位居世界第三的恶性肿瘤，我国结直肠癌的发病率呈明显上升趋势。目前，全球最新的癌症流行数据公布，全球范围内2012年结直肠癌新发病例约为136万，为第3位最常见恶性肿瘤；全球结直肠癌死亡69.4万例，占所有癌症死亡病例的8.5％。结直肠癌在男性中为第3位常见癌症(746,000例，占10％)、在女性中为第2位(614,000例，占9.2％)。我国大肠癌患者平均5年生存率仅为40％左右，而欧美发达国家高达61％，专家认为，不规范治疗是导致我国大肠癌生存率低的重要原因。由于对癌症的认识不够，患者在治疗过程中往往存在着“过量与不足”的严重误区。不少结肠癌患者长期服用各种偏方，这种过度用药、过度治疗的现象严重干扰正规的抗癌治疗。因此，目前急需一种治疗结肠癌的药物以解癌症患者的燃眉之急。

二氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)又名“砒霜”或“鹤顶红”，一直以来都是中医理论“以毒攻毒”思想的完美诠释。20世纪70年代，哈尔滨医科大学附属第一医院学者张亭栋教授创造性地将ATO用于治疗早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)。如今，ATO已成为全球治疗难治性或复发性APL的金标准，在国内外学者的共同努力下，ATO的疾病治疗谱越来越广。研究表明，三氧化二砷对恶性淋巴瘤、神经母细胞瘤及各种实体瘤(如肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、大肠癌、胰腺癌、膀胱癌、子宫癌、乳腺癌、口腔癌等)都有明显作用；另外大剂量的ATO可以改善多发性骨髓瘤(MDS)晚期病人的症状，对老年人MDS仍然可以获得很好的疗效，可达到30％～40％的完全缓解；近期又发现ATO可诱导黑色素瘤细胞凋亡；中国国家食品药品监督管理局已批准ATO用于晚期肝癌的治疗。但是，ATO抗实体瘤的效果远不如治疗APL的临床效果，需要更高剂量才能抑制实体瘤的生长，单独应用ATO治疗实体瘤的疗效有限，且ATO本身的致癌性及毒性也不容忽视。

ATO在实体肿瘤的应用受到了很大的限制，主要是由于肿瘤细胞对ATO的敏感性较差，其取得实体肿瘤效应的剂量远大于血液系统恶性肿瘤，而高剂量的ATO会引起肝、心、肾毒性，甚至猝死；高剂量带来的毒性成为了ATO治疗实体瘤的主要障碍。李江涛等用ATO注射液作用肝癌细胞株Bel7402发现2μM浓度组以抑制肝癌细胞的增殖为主，但在形态及生化方面未见凋亡改变；10μM浓度组抑制率最大，作用96h后抑制率高达83.9％，10μM浓度组作用10h就可见形态学改变，48h可发现凋亡峰，细胞周期阻滞在S-G2-M期，指出低浓度ATO(0.25～2.0μM)可以在体外抑制肝癌细胞增殖，但未进入实质凋亡；高浓度10μM可诱导肝癌细胞凋亡。顾琴龙等以低浓度ATO(0.5μM)处理人胃癌细胞株SGC7901和MKN45，发现癌细胞增殖减缓，至16代后停止增殖，48h后G/G0期细胞比例增加，S期细胞比例减少；因此认为低浓度ATO，可诱导胃癌细胞株分化，但不能完全逆转癌细胞的恶性生物学特性。申请者所在科室的一项研究也指出，ATO对实体瘤细胞具有双重作用，低浓度的ATO促进肿瘤的发生和发展，高浓度的ATO促进肿瘤细胞的凋亡。与对照组相比，分别以1μM或10μM的ATO处理人乳腺癌MCF-7细胞72h，细胞活力分别下降7.69和78.30％；0.1μM的ATO处理同样时间，细胞活力增加6％；ATO在1～10μM浓度范围内，以浓度依赖的方式降低A549细胞活性，0.1μM的ATO不能影响人肺癌A549细胞的活性。

因此，寻找ATO新的用药方案，增强其抗实体瘤效果，同时减少其毒性和副作用是当务之急，ATO与其他药物联合使用，以达到增加药效降低其本身毒性作用具有潜在的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种配比合理，并能安全有效治疗结肠癌的药物。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种用于治疗结肠癌的药物组合物，所述的药物组合物由三氧化二砷以及抗坏血酸组成。

其中，优选的，三氧化二砷以及抗坏血酸的摩尔浓度比为1：400～3000。

进一步的，本发明还提出了所述的药物组合物在制备治疗结肠癌的药物中的应用。

更进一步的，本发明还提出了一种用于治疗结肠癌的药物制剂，其是将所述的药物组合物中加入药学上接受辅料，按照常规药物制剂的制备方法制成各种药物制剂。

其中，优选的，所述的药物制剂为注射液。

其中，优选的，所述的药物制剂通过以下方法制备得到：在注射用水中加入医用三氧化二砷，加热，使之溶解成亚砷酸；按照氧化二砷以及抗坏血酸的摩尔浓度比为1：400～3000加入抗坏血酸，加入氯化钠，经过滤、罐装、加盖、灭菌后即可制成含抗坏血酸和亚砷酸的用于治疗结肠癌的注射液。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明将三氧化二砷和抗坏血酸进行合理配组，使二者的药理作用具有协同作用，达到“增效减毒”的目的，使低浓度的三氧化二砷即可发挥抗结肠癌的效果，减轻三氧化二砷使用过程中的毒副作用。

附图说明

图1为分别利用(A)不同浓度的ATO(0.5～10μM)，(B)不同浓度的AA(0.25～3mM)，(C)ATO和AA共同处理人结肠癌Lovo细胞24h后，MTT法检测细胞活力的结果；

图2为加入(A)3mM、(B)2mM、(C)1.5mM、(D)1mM和(E)0.5mM的AA，同时加入不同浓度的ATO(0.5～10μM)，共同处理人结肠癌Lovo细胞24h后，MTT法检测细胞活力的结果；

图3为加入(A)2μM、(B)1.5μM、(C)1μM的ATO，同时加入不同浓度的AA(0.25～3mM)，共同处理人结肠癌Lovo细胞24h后，MTT法检测细胞活力的结果；

图4为分别利用(A)不同浓度的ATO(0.5～10μM)，(B)不同浓度的AA(0.25～6mM)处理人结肠癌sw620细胞24h后，MTT法检测细胞活力的结果；

图5为加入(A)2.5μM、(B)2μM、(C)1μM的ATO，同时加入不同浓度的AA(0.25～3mM)，共同处理人结肠癌sw620细胞24h后，MTT法检测细胞活力的结果；加入(D)2mM AA和不同浓度ATO(0.1～2.5μM)，共同处理人结肠癌sw620细胞24h后，MTT法检测细胞活力的结果；

图6为电镜检测经ATO和AA处理后，sw620细胞亚结构。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1用于治疗结肠癌的药物制剂(注射液)的制备

1)取三氧化二砷10g(0.05mol)、氯化钠8g、注射用水1000mL。

2)先将1000mL注射用水加热煮沸，加入三氧化二砷10g继续煮沸30分钟，当完全溶解后加入5.59kg(31.7mol)抗坏血酸、8g氯化钠，同时补加入注射用水至1000mL，过滤、罐装、加盖、灭菌等工序即可制成。其它项目应符合中华人民共和国药典2000版注射液项目有关要求。

实施例2用于治疗结肠癌的药物制剂(注射液)的制备

1)取三氧化二砷10g(0.05mol)、氯化钠8g、注射用水1000mL。

2)先将1000mL注射用水加热煮沸，加入三氧化二砷10g继续煮沸30分钟，当完全溶解后加入21.93kg(124.5mol)抗坏血酸、8g氯化钠，同时补加入注射用水至1000mL，过滤、罐装、加盖、灭菌等工序即可制成。其它项目应符合中华人民共和国药典2000版注射液项目有关要求。

实施例3用于治疗结肠癌的药物制剂(注射液)的制备

1)取三氧化二砷10g(0.05mol)、氯化钠8g、注射用水1000mL。

2)先将1000mL注射用水加热煮沸，加入三氧化二砷10g继续煮沸30分钟，当完全溶解后加入13.2kg(75mol)抗坏血酸、8g氯化钠，同时补加入注射用水至1000mL，过滤、罐装、加盖、灭菌等工序即可制成。其它项目应符合中华人民共和国药典2000版注射液项目有关要求。

实施例4三氧化二砷(ATO)和抗坏血酸组合物的药理实验作用研究

实验细胞：

结肠癌Lovo细胞系美国菌种保藏中心(ATCC)

结肠癌sw620细胞系美国菌种保藏中心(ATCC)

实验试剂：

亚砷酸氯化钠注射液(批号：H19990191) 哈尔滨医大药业有限公司

抗坏血酸(AA，批号：SLBV2291) SIGMA公司

方法：

1.ATO与AA协同促进人结肠癌Lovo细胞凋亡

分别利用不同浓度的ATO(0.5～10μM)，不同浓度的AA(0.25～3mM)以及ATO和AA共同处理人结肠癌Lovo细胞24h后，MTT法检测细胞活力。

MTT结果证明，ATO以剂量依赖的方式介导人结肠癌Lovo细胞凋亡，与对照组相比，低浓度的ATO(0.5～4μM)不能引起Lovo细胞凋亡，10μM的ATO引起Lovo细胞活力下降至63.4％(图1A)；3mM的AA引起Lovo细胞活力下降至85.3％(P＜0.05)(图1B)，当与2μM的ATO合用时，可引起Lovo细胞活力下降至44.5％(P＜0.001)(图1C)。这一结果证明，AA与ATO协同使用时，有效促进ATO对结肠癌细胞的杀伤作用。

2.不同浓度的AA均能协同ATO促进人结肠癌Lovo细胞凋亡

为了进一步探索ATO和AA治疗结肠癌的协同作用，本研究分别在AA浓度固定为3、2、1.5、1、0.5mM时，加入不同浓度的ATO同时作用24h，结果发现两者协同抑制人结肠癌Lovo细胞活力，且呈现剂量依赖的方式(图2A-E)。

3.不同浓度的AA均能协同ATO促进人结肠癌Lovo细胞凋亡

本研究分别在ATO浓度固定为2、1.5、1μM时，加入不同浓度的AA(0.25～3mM)同时作用24h，结果发现两者协同抑制人结肠癌Lovo细胞活力，且仍呈现剂量依赖的方式(图3A-C)。

4.ATO与AA促进人结肠癌sw620细胞凋亡

分别利用不同浓度的ATO(0.5～10μM)，不同浓度的AA(0.25～6mM)处理人结肠癌sw620细胞24h后，MTT法检测细胞活力。

MTT结果证明，ATO以剂量依赖的方式介导人结肠癌sw620细胞凋亡，与对照组相比，低浓度的ATO(0.5～2.5μM)不能引起sw620细胞凋亡，10μM的ATO引起sw620细胞活力下降至75.6％(图4A)。6mM的AA引起Lovo细胞活力下降至55.3％(P＜0.05)(图4B)。

5.不同浓度的AA均能协同ATO促进人结肠癌sw620细胞凋亡

本研究分别在ATO浓度固定为2.5、2、1μM时，加入不同浓度的AA(0.25～3mM)同时作用24h，结果发现两者协同抑制人结肠癌sw620细胞活力，且仍呈现剂量依赖的方式(图5A-C)。为了进一步探索ATO和AA治疗结肠癌的协同作用，本研究固定AA浓度为2mM，加入不同浓度的ATO同时作用24h，两者协同抑制人结肠癌sw620细胞活力(图5D)。

6.AA协同ATO诱导人结肠癌sw620细胞凋亡

为了观察ATO和AA协同诱导结肠癌细胞凋亡的现象，本实验在电镜下观察了人结肠癌sw620细胞的亚细胞结构。电镜下观察发现，CTL组多见正常未凋亡细胞，细胞边缘多见纤毛，细胞呈规则圆形，胞核胞浆完整；ATO(2μM)组多见正常未凋亡细胞，存在部分早期凋亡细胞，出现细胞核固缩，细胞周围呈现凋亡小体脱落；AA(1mM)加药组多见正常未凋亡细胞；AA(1mM)和ATO(2μM)联合用药组中胞核固缩，胞浆肿胀，出现少量早期凋亡细胞，少量焦亡细胞；AA(2mM)视野中存在未凋亡细胞；AA(2mM)和ATO(2μM)联合用药组中大量细胞发生焦亡和中晚期凋亡。通过观察sw620细胞亚结构，进一步证明AA和ATO联合用药诱导细胞凋亡(图6)。

Claims

1.一种用于治疗结肠癌的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物由三氧化二砷以及抗坏血酸组成。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，三氧化二砷以及抗坏血酸的摩尔浓度比为1：400～3000。

3.权利要求1或2所述的药物组合物在制备治疗结肠癌的药物中的应用。

4.一种用于治疗结肠癌的药物制剂，其特征在于，将权利要求1或2所述的药物组合物中加入药学上接受辅料，按照常规药物制剂的制备方法制成各种药物制剂。

5.如权利要求4所述的药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂为注射液。

6.如权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，通过以下方法制备得到：在注射用水中加入医用三氧化二砷，加热，使之溶解成亚砷酸；按照三氧化二砷以及抗坏血酸的摩尔浓度比为1：400～3000加入抗坏血酸，加入氯化钠，经过滤、罐装、加盖、灭菌后即可制成含抗坏血酸和亚砷酸的用于治疗结肠癌的注射液。