CN110283774B - 细胞培养基及使用其的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种不使用饲养细胞而能够提高细胞的增殖效率的细胞培养基，特别是提供一种不含血清的细胞培养基。根据本发明，可以提供一种含有生长停滞特异性蛋白质6(Growth arrest‑specific 6；GAS6)且不含血清的细胞培养基。

Description

细胞培养基及使用其的培养方法
本申请是申请日为2014年11月21日、申请号为201480063892.8、发明名称为“细胞培养基及使用其的培养方法”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及细胞培养基及细胞的培养方法。进而，本发明还涉及可以在上述培养方法中使用的饲养细胞、以及对用于培养细胞的培养基进行评价的方法。
背景技术
通过近年来的研究，人ES细胞(hESC)或人iPS细胞(hiPSC)等人多能干细胞在再生医疗领域中实用化的可能性正在增高。这些多能干细胞具有能够无限增殖的能力和分化成各种细胞的能力，作为对疑难疾病、生活习惯病等的治疗方法而备受期待。人多能干细胞显示出能在试管内分化诱导成神经细胞、心肌细胞、血液细胞或网膜细胞等多种细胞。
饲养细胞起到将用于维持培养人多能干细胞的生长因子供给于干细胞的作用。因此，一直以来，hESC、hiPSC等人多能干细胞的培养主要在源自小鼠的饲养细胞(MEF：mouseembryonic fibroblast)层上进行。作为能够维持培养人多能干细胞的活性，报告了各种人细胞瘤(非专利文献1～4)。然而，使用源自小鼠的饲养细胞的方法由于会在人多能干细胞中混入饲养细胞，因此在对生物体的安全性上存在问题。另外，对于使用源自人的饲养细胞的培养方法而言，存在培养时花费功夫制备饲养细胞的问题。
作为不使用MEF等饲养细胞而培养人多能干细胞的方法，已知事先用MEF对培养基进行驯化的方法(MEF-CM)、将MEF进行化学性固定的方法(非专利文献5)。另外，还报告了不使用异种细胞而使用成纤维细胞、胎盘细胞、骨髓细胞、子宫内膜细胞等各种源自人的细胞作为活饲养细胞的方法(非专利文献6)。进而，为了培养人多能干细胞，还可以使用含有牛血清、KNOCKOUTTM SR(Knockout Serum Replacement：通过作为替代血清使用而能够培养ES/iPS细胞的添加剂)等的培养基。但是，这些多是添加了从牛血清提取出的蛋白质而制成的培养基，存在牛海绵状脑病(BSE)等传染病、病毒导致的细胞污染的隐患。虽然有时使用源自人的血清，但是由于在使用上存在限制、制约，因此是不实用的。另外，已知用MEF对这些含有血清或血清代替物的人多能干细胞用培养基进行驯化而得到的培养基能够实现人多能干细胞的无饲养细胞培养。然而，在含有大量的源自血清的蛋白质的培养基中，难以对由MEF分泌的对人多能干细胞的增殖有益的因子进行鉴定。为了鉴定上述因子，还对用MEF-CM培养的人ES细胞中发生特异性改变的受体蛋白质进行了分析(非专利文献7)。
另外，为了不使用MEF进行培养，正在推进规定化学成分(ケミカルデファインド)培养基的开发，也能够避免混入源自牛血清的成分的问题(非专利文献8及9)。还正在进行从MEF的分泌物分析功能性蛋白质(非专利文献10)。另外，还报告了通过添加玻璃体结合蛋白：IGF1嵌合蛋白质(chimeric protein)而不使用饲养细胞地培养胚性干细胞(非专利文献11)。作为含有IGF的市售培养基，已知有STEM CELL Technologies公司的mTeSR1(注册商标)、Life Technologies公司的STEMPRO(注册商标)等。但是，对于人多能干细胞的培养而言，仍然存在无法稳定地培养、增殖性较差的课题。
另一方面，专利文献1中记载了一种作为对象的含有维生素K依赖性蛋白质的组合物的生成方法，该含有维生素K依赖性蛋白质的组合物以实质上少于未修饰时的宿主细胞的量含有内源性表达的至少一种蛋白质混入物，该方法包括：a)生成本发明中记载的宿主细胞；以及b)在生长培养基中繁殖该宿主细胞并回收作为对象的含有维生素K依赖性蛋白质的该生长培养基的工序，其中，作为维生素K依赖性蛋白质的一个例子，记载了GAS-6(段号0008和0035)。专利文献2中记载了在进行划痕试验(wound assay)时，用含有10％FCS及GAS6的培养基培养细胞(段号0059)。另外，专利文献3中记载了在培养基中含有gas6作为神经元增殖强化剂(enhancer)(段号0235)。但是，对于在无血清培养基中添加GAS6的情况没有报告。
另外，已知GAS6是受体型酪氨酸激酶的配体(非专利文献12)。受体型酪氨酸激酶中有EGFR、ERBB2，ERBB3、ERBB4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRα、PDGFRβ、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGRF1～3、FGFR1～4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1～8、EPHB1～6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3、RTK106等。还报告了GAS6作为TAM(TYRO3、AXL、MER)家族的受体型酪氨酸激酶的配体而发挥作用(非专利文献13)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2009-501014号公报
专利文献2：日本特表2005-532805号公报
专利文献3：日本特开2009-77716号公报
非专利文献
非专利文献1：Hovatta O,Mikkola M,Gertow K et al.A culture system usinghuman foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of humanembryonic stem cells.Hum Reprod 2003；18：1404-1409.
非专利文献2：Richards M,Fong CY,Chan WK et al.Human feeders supportprolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonicstem cells.Nat Biotechnol 2002；20：933-936.
非专利文献3：Cheng L,Hammond H,Ye Z et al.Human adult marrow cellssupport prolonged expansion of human embryonic stem cells in culture.StemCells2003；21：131-142.
非专利文献4：Richards M,Tan S,Fong CY et al.Comparative evaluation ofvarious human feeders for prolonged undifferentiated growth of humanembryonic stem cells.Stem Cells 2003；21：546-556.
非专利文献5：Yue X-S,Fujishiro M,Nishioka C,Arai T,Takahashi E,Gong J-S,Akaike T,Ito Y.Feeder cells support the culture of induced pluripotent stemcells even after chemical fixation.PLoS ONE 2012；7：e32707.
非专利文献6：福角勇人、金村米博，人ES/iPS细胞的无饲养细胞培养技术的开发，医学的进步(医学のあゆみ),2011；239：1338-1344.
非专利文献7：Wang L,Schulz TC,Sherrer ES,Dauphin DS,Shin S et al.Self-renewal of human embryonic stem cells requires insulin-like growth factor-1receptor and ERBB2receptor signaling.Blood 2007；110：4111-4119.
非专利文献8：Veronika A,Peter WA,Stephen B,Nissim B,Jennifer B etal.Comparison of defined culture systems for feeder cell free propagation ofhuman embryonic stem cells.In Vitro Cell Dev Biol Anim.2010；46：247-58.
非专利文献9：Chen G,Gulbranson DR,Hou Z,Bolin JM,Ruotti V,Probasco MDet al.Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.NatMethods.2011；8：424-429.
非专利文献10：Chin AC,Fong WJ,Goh LT,Philp R,Oh SK,ChooAB.Identification of proteins from feeder conditioned medium that supporthuman embryonic stem cells.Journal of Biotechnology,2007；130：320-8.
非专利文献11：Manton KJ,Richards S,Van Lonkhuyzen D,Cormack L,Leavesley D,Upton Z,A chimeric vitronectin：IGF-I protein supports feeder-cell-free and serum-free culture of human embryonic stem cells,Stem CellsDev.2010,19(9)：1297-1305
非专利文献12：下田纯一、滨本高义，Gas6缺失小鼠，血栓止血杂志(血栓止血誌)，2001；12(6)：514-521.
非专利文献13：Vyacheslav AK.Axl-dependent signaling：a clinicalupdate.Clinical science 2012；122：361-368.
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题在于提供一种不使用饲养细胞而能够提高细胞的增殖效率的细胞培养基，特别是提供一种不含血清的细胞培养基。进而，本发明的可以还在于提供一种使用上述细胞培养基培养细胞的方法。
解决课题的方法
本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，通过向人多能干细胞的无血清培养基中添加GAS6，能够不与饲养细胞一起培养而促进人多能干细胞的增殖，从而完成了本发明。即，根据本发明，鉴定了GAS6为促进人多能干细胞增殖的因子。
根据本发明，提供以下的发明。
(1)一种细胞培养基，其含有生长停滞特异性蛋白质6(Growtharrest-specific6；GAS6)，且不含血清。
(2)根据(1)所述的细胞培养基，其中，培养基中含有的生长停滞特异性蛋白质6(Growth arrest-specific 6；GAS6)的浓度为2ng/ml以上且100ng/ml以下。
(3)根据(1)或(2)所述的细胞培养基，其还含有选自核心蛋白聚糖(Decorin)、基质金属蛋白酶-3(Matrix Metalloproteinase-3(MMP3))、骨桥蛋白(Osteopontin(OPN))、肿瘤坏死因子相关凋亡受体微弱诱导剂(TNF-related Weak Inducer of ApoptosisReceptor(TWEAK R))、胰岛素样生长因子结合蛋白2(Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2))、半乳糖凝集素1(galectin1(LGALS1))、以及胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1(IGF-1))中的至少一种以上。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的细胞培养基，其不含有白蛋白。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的细胞培养基，其中，细胞为源自小鼠的细胞或源自人的细胞。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的细胞培养基，其中，细胞为多能干细胞。
(7)根据(6)所述的细胞培养基，其中，多能干细胞为iPS细胞(inducedpluripotent stem cells)。
(8)一种细胞用培养基试剂盒，其包含生长停滞特异性蛋白质6(Growth arrest-specific 6；GAS6)和基本培养基。
(9)根据(8)所述的细胞用培养基试剂盒，其中，基本培养基为Essential8(注册商标)培养基。
(10)根据(8)或(9)所述的细胞用培养基试剂盒，其还含有选自核心蛋白聚糖(Decorin)、基质金属蛋白酶-3(Matrix Metalloproteinase-3(MMP3))、骨桥蛋白(Osteopontin(OPN))、肿瘤坏死因子相关凋亡受体微弱诱导剂(TNF-related WeakInducer of Apoptosis Receptor(TWEAK R))、胰岛素样生长因子结合蛋白2(Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2))、半乳糖凝集素1(galectin1(LGALS1))、以及胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1(IGF-1))中的至少一种以上。
(11)根据(8)～(10)中任一项所述的细胞用培养基试剂盒，其中，细胞为源自小鼠的细胞或源自人的细胞。
(12)根据(8)～(11)中任一项所述的细胞用培养基试剂盒，其中，细胞为多能干细胞。
(13)根据(12)所述的细胞用培养基试剂盒，其中，多能干细胞为iPS细胞或ES细胞。
(14)一种细胞培养系统，其包括：(a)(1)～(7)中任一项所述的细胞培养基或(8)～(13)中任一项所述的细胞用培养基试剂盒、和(b)细胞培养装置。
(15)一种细胞的培养方法，该方法包括下述工序：使用(1)～(7)中任一项所述的细胞培养基、(8)～(13)中任一项所述的细胞用培养基试剂盒、或者(14)所述的细胞培养系统中的任一种对细胞进行培养。
(16)根据(15)所述的培养方法，其中，在不存在饲养细胞的条件下对细胞进行培养。
(17)根据(15)或(16)所述的培养方法，其中，在具有未涂布细胞外基质的表面的培养基材上对细胞进行培养。
(18)根据(15)或(16)所述的培养方法，其中，在未涂布细胞外基质的培养基材上对细胞进行培养。
(19)根据(17)或(18)所述的培养方法，其中，细胞外基质为选自明胶、作为由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤产生且经过分离的基底膜成分的基质胶(matrigel)、胎盘基质、分层蛋白(merosin)、生腱蛋白(tenascin)、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、聚集蛋白聚糖(aggrecan)、双糖链蛋白多糖(biglycan)、凝血酶敏感素(thrombospondin)、层粘连蛋白(laminin)(层粘连蛋白-511、层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-332)、纤维连接蛋白(fibronectin)、玻璃体结合蛋白、胶原、E-钙粘蛋白、核心蛋白聚糖(decolin)、合成肽、合成聚合物、源自MEF、人血清或蜕膜间充质细胞的细胞外基质中的至少一种以上。
(20)根据(15)～(19)中任一项所述的培养方法，其中，细胞为源自小鼠的细胞或源自人的细胞。
(21)根据(15)～(20)中任一项所述的培养方法，其中，细胞为多能干细胞。
(22)根据(21)所述的培养方法，其中，多能干细胞为iPS细胞(inducedpluripotent stem cells)。
(23)一种细胞的培养方法，该方法包括在饲养细胞的存在下培养细胞的工序，所述饲养细胞导入了编码生长停滞特异性蛋白质6(Growth arrest-specific 6；GAS6)的氨基酸序列的碱基序列。
(24)根据(23)所述的培养方法，其中，饲养细胞选自MEF(mouseembryonicfibroblast)、STO细胞株(ATCC保藏编号：CRL-1503)、成纤维细胞、胎盘细胞、骨髓细胞、以及子宫内膜细胞。
(25)根据(23)或(24)所述的培养方法，其中，细胞为源自小鼠的细胞或源自人的细胞。
(26)根据(23)～(25)中任一项所述的培养方法，其中，细胞为多能干细胞。
(27)根据(26)所述的培养方法，其中，多能干细胞为iPS细胞(inducedpluripotent stem cells)。
(28)一种饲养细胞，其导入了编码生长停滞特异性蛋白质6(Growth arrest-specific 6；GAS6)的氨基酸序列的碱基序列。
(29)根据(28)所述的饲养细胞，其中，饲养细胞选自MEF(mouse embryonicfibroblast)、STO细胞株(ATCC保藏编号：CRL-1503)、成纤维细胞、胎盘细胞、骨髓细胞、以及子宫内膜细胞。
(30)一种对用于培养细胞的培养基进行评价的方法，该方法包括对培养基中含有的生长停滞特异性蛋白质6(Growth arrest-specific 6；GAS6)进行检测或定量。
(31)一种多能干细胞的增殖抑制剂，其含有抗GAS6抗体或GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂。
(32)根据(31)所述的增殖抑制剂，其中，GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂为选自下述中的一种以上：
BMS777607[N-(4-((2-氨基-3-氯吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-乙氧基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺]、
R428[1-(6,7-二氢-5H-苯并[2,3]环庚[2,4-d]哒嗪-3-基)-3-N-[(7S)-7-吡咯烷-1-基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-3-基]-1,2,4-三唑-3,5-二胺]、以及
UNC569[1-((反-4-氨基环己基)甲基)-N-丁基-3-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺]。
(33)根据(31)或(32)所述的增殖抑制剂，其中，多能干细胞为iPS细胞(inducedpluripotent stem cells)。
(34)一种细胞培养基，其含有(31)～(33)中任一项所述的增殖抑制剂。
(35)一种细胞用培养基试剂盒，其包含(31)～(33)中任一项所述的增殖抑制剂和基本培养基。
(36)一种细胞培养系统，其包含(a)(34)所述的细胞培养基或(35)所述的细胞用培养基试剂盒、和(b)细胞培养装置。
(37)一种细胞的培养方法，该方法包括下述工序：使用(34)所述的细胞培养基、(35)所述的细胞用培养基试剂盒、或者(36)所述的细胞培养系统中的任一种对细胞进行培养。
(38)一种多能干细胞的培养方法，该方法包括在抑制GAS6的作用的条件下培养多能干细胞的工序。
(39)根据(38)所述的培养方法，其中，在抑制GAS6的作用的条件下培养多能干细胞的工序是在抗GAS6抗体和/或GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂的存在下培养多能干细胞的工序。
(40)根据(39)所述的培养方法，其中，GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂为选自下述中的一种以上：
BMS777607[N-(4-((2-氨基-3-氯吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-乙氧基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺]、
R428[1-(6,7-二氢-5H-苯并[2,3]环庚[2,4-d]哒嗪-3-基)-3-N-[(7S)-7-吡咯烷-1-基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-3-基]-1,2,4-三唑-3,5-二胺]、以及
UNC569[1-((反-4-氨基环己基)甲基)-N-丁基-3-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺]。
(41)根据(39)所述的培养方法，其中，培养多能干细胞的培养基中含有的抗GAS6抗体的浓度为10ng/ml以上且100ng/ml以下。
(42)根据(40)所述的培养方法，其中，在培养多能干细胞的培养基含有BMS777607的情况下，培养基中含有的BMS777607的浓度为2ng/ml以上且20ng/ml以下，在培养多能干细胞的培养基含有R428的情况下，培养基中含有的R428的浓度为8ng/ml以上且80ng/ml以下，在培养多能干细胞的培养基含有UNC569的情况下，培养基中含有的UNC569的浓度为1ng/ml以上且10ng/ml以下。
(43)根据(38)～(42)中的任一项所述的培养方法，其中，多能干细胞为iPS细胞(induced pluripotent stem cells)。
(44)根据(38)～(43)中的任一项所述的培养方法，其中，多能干细胞用不含白蛋白的培养基进行培养。
(45)根据(38)～(44)中的任一项所述的培养方法，其中，多能干细胞用不含血清的培养基进行培养。
(46)根据(38)～(45)中的任一项所述的培养方法，其中，多能干细胞用含有GAS6的培养基进行培养。
(47)根据(38)～(46)中的任一项所述的培养方法，其中，多能干细胞用经MEF驯化过的培养基进行培养。
发明的效果
通过使用本发明的细胞培养基培养细胞，能够使多能干细胞等细胞高效地增殖。本发明的细胞培养基由于能够不使用饲养细胞而培养细胞，因此能够安全地培养细胞。
附图说明
图1示出通过碱性磷酸酶染色对无血清培养基、用MEF进行了驯化的无血清培养基、或者添加了各种蛋白质因子的无血清培养基中的人iPS细胞的增殖效率进行比较的结果。
图2示出通过碱性磷酸酶染色对无血清培养基、用MEF进行了驯化的无血清培养基、或者添加了各种蛋白质因子的无血清培养基中的人iPS细胞的增殖效率进行比较的结果。
图3示出对无血清培养基、用MEF进行了驯化的无血清培养基、或者添加了各种蛋白质因子的无血清培养基中的人iPS细胞的细胞数进行计数并进行比较的结果。
图4示出通过碱性磷酸酶染色对无血清培养基、用MEF进行了驯化的无血清培养基、或者添加了各种蛋白质因子的无血清培养基中的人iPS细胞的增殖效率进行比较的结果。
图5示出对无血清培养基、用MEF进行了驯化的无血清培养基、或者添加了各种蛋白质因子的无血清培养基中的人iPS细胞的细胞数进行计数并进行比较的结果。
图6示出通过碱性磷酸酶染色对在无血清培养基、用MEF进行了驯化的无血清培养基中进行无基质胶培养后的人iPS细胞的增殖效率进行比较的结果。
图7示出对无血清培养基、用MEF进行了驯化的无血清培养基、或者添加了抗GAS抗体且用MEF进行了驯化的培养基中的人iPS细胞的细胞数量进行测量并进行比较的结果。
图8示出对无血清培养基、用MEF进行了驯化的无血清培养基、或者添加了各种GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂且用MEF进行了驯化的培养基中的人iPS细胞的细胞数量进行测量并进行比较的结果。
图9是示出培养装置中各构成部件的配置的示意图。
图10是示出自动培养装置中观察装置的模块结构图。
图11示出自动培养装置的主要部分的硬件结构。
图12示出细胞培养装置的细胞检测系统的结构。
图13是示出培养装置内的各构成要素的配置的示意图。
图14示出图像处理单元的详细情况。
图15示出图像处理单元实施的细胞提取处理的一个例子。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明的细胞培养基是以含有生长停滞特异性蛋白质6(Growth arrest-specific 6；GAS6)、且不含血清为特征的培养基。通过添加生长停滞特异性蛋白质6(GAS6)，能够不使用血清和饲养细胞而促进人多能干细胞的增殖。由此，在不暴露于动物细胞、或者经过动物细胞驯化而得到的培养液中的任一种的情况下，可以容易地进行人多能干细胞的培养。
培养基中含有的生长停滞特异性蛋白质6(Growth arrest-specific 6；GAS6)的浓度只要能够使细胞增殖即可，没有特别限定，考虑到添加效果，通常下限为0.0001ng/ml，优选为0.001ng/ml，更优选为0.01ng/ml，进一步优选为0.1ng/ml，特别优选为1ng/ml，最优选为2ng/ml。考虑到成本方面，上限为10000ng/ml，优选为1000ng/ml，更优选为500ng/ml，进一步优选为400ng/ml，特别优选为300ng/ml，更进一步优选为200ng/ml以下，进一步特别优选为100ng/ml以下。浓度通常为1ng/ml以上且200ng/ml以下，特别优选为2ng/ml以上且100ng/ml以下。
本发明的细胞培养基的特征在于，可以在不含血清(即，源自血清的成分)的培养基中促进细胞增殖，且能够稳定地培养细胞。作为能在本发明中使用的培养基，可以制备动物细胞培养基中使用的培养基作为基础培养基。作为基础培养基，只要是下述能够用于动物细胞培养的培养基即可，没有特别限定，所述用于动物细胞培养的培养基有BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham培养基(Ham’s Medium)、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、以及它们的混合培养基等。例如，作为添加了胰岛素和转铁蛋白且不含源自血清的成分的培养基，可以列举：CHO-S-SFM II(GIBCO BRL公司制造)、Hybridoma-SFM(GIBCO BRL公司制造)、eRDF Dry Powdered Media(GIBCO BRL公司制造)、UltraCULTURETM(BioWhittaker公司制造)、UltraDOMATM(BioWhittaker公司制造)、UltraCHOTM(BioWhittaker公司制造)、UltraMDCKTM(BioWhittaker公司制造)等。作为人多能干细胞的培养用途而开发的Essential8(LifeTechnologies公司制造)、STEMPRO hESC SFM(Life Technologies公司制造)、mTeSR1(Veritas公司制造)、TeSR2(Veritas公司制造)、ReproXF(ReproCELL公司制造)等是最优选的培养基。特别优选使用添加了ITS(胰岛素、转铁蛋白、硒)、人FGF2、TGF-β1、2-磷酸抗坏血酸镁、以及碳酸氢钠的DMEM/F12(1︰1)培养基、或者Essential8(Life Technologies公司制造)。
本发明的细胞培养基中还可以添加MEF分泌成分。作为MEF分泌成分，具体而言，可以添加选自核心蛋白聚糖(Decorin)、基质金属蛋白酶-3(Matrix Metalloproteinase-3(MMP3))、骨桥蛋白(Osteopontin(OPN))、肿瘤坏死因子相关凋亡受体微弱诱导剂(TNF-related Weak Inducer of Apoptosis Receptor(TWEAK R))、胰岛素样生长因子结合蛋白2(Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2))、半乳糖凝集素1(galectin 1(LGALS1))、以及胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1(IGF-1))中的至少一种以上。
除生长停滞特异性蛋白质6(GAS6)外，在能够添加的MEF分泌成分中，优选添加选自核心蛋白聚糖(Decorin)、半乳糖凝集素1(galectin 1(LGALS1))、以及胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1(IGF-1))中的至少一种以上。例如，可以将“GAS6与Decorin”、“GAS6与LGALS1”、“GAS6与IGF-1”、“GAS6、Decorin和LGALS1”、“GAS6、Decorin和IGF-1”、“GAS6、LGALS1和IGF-1”、或者“GAS6、Decorin、LGALS1和IGF-1”等组合添加。
需要说明的是，对于核心蛋白聚糖(Decorin)、半乳糖凝集素1(galectin1(LGALS1))、以及胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1(IGF-1))而言，即使在单独添加的情况下也具有促进细胞增殖的效果，因此，可以在细胞培养基中仅添加选自核心蛋白聚糖(Decorin)、半乳糖凝集素1(galectin1(LGALS1))、以及胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1(IGF-1))中的一种以上因子。
在添加上述MEF分泌成分的情况下，培养基中含有的各种成分的浓度只要能够使细胞增殖即可，没有特别限定，考虑到添加效果，通常下限为0.0001ng/ml，优选为0.001ng/ml，更优选为0.01ng/ml，进一步优选为0.1ng/ml，特别优选为1ng/ml，最优选为2ng/ml。考虑到成本方面，上限为10000ng/ml，优选为1000ng/ml，更优选为500ng/ml，进一步优选为400ng/ml，特别优选为300ng/ml，更进一步优选为200ng/ml以下，进一步特别优选为100ng/ml以下。浓度通常为1ng/ml以上且200ng/ml以下，特别优选为2ng/ml以上且100ng/ml以下。
本发明的细胞培养基优选不含有白蛋白。
本发明的细胞培养基中可以适当含有转铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、或3-硫代甘油、或者它们的等效物等。
本发明的培养基还可以含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如，非必需氨基酸)、维生素、增殖因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。例如，对于2-巯基乙醇而言，只要在适合干细胞培养的浓度下使用就没有限定，例如可以在约0.05～1.0mM、优选在约0.1～0.5mM的浓度下使用。
如上所述，通过将GAS6添加入基本培养基，可以制造本发明的细胞培养基，但也可以以含有GAS6和基本培养基的细胞用培养基试剂盒的方式来使用。即，将GAS6和基本培养基分别组合并以试剂盒的方式供给，通过使用者在使用时将GAS6加入基本培养基，可以制备本发明的细胞培养基并使用。
进而，根据本发明可以提供包含(a)上述细胞培养基或细胞用培养基试剂盒、和(b)细胞培养装置的细胞培养系统。
作为细胞培养装置，只要是能够使用上述细胞培养基或细胞用培养基试剂盒培养细胞的装置即可，没有限定，例如，可以使用日本特开2008-92811号公报、日本特开2008-92882号公报及日本特开2010-148391号公报(将上述公报中记载的内容引入本说明书中作为本说明书公开的一部分)中记载的细胞培养装置。
在本发明的一个例子中，可以使用如下所述细胞培养装置，如日本特开2008-92811号公报所记载，该细胞培养装置具备培养细胞的培养容器、拍摄上述培养容器的细胞的拍摄装置、拍摄上述细胞时对上述细胞照射光的光源设备、移动上述显微镜的移动设备，该细胞培养装置的特征在于：作为上述光源设备，具有多个光源，且点亮与上述显微镜的位置对应的上述光源。将细胞培养装置的结构的一个例子示于图9。
细胞培养装置1由以下部件组成：培养细胞的培养容器4、用于拍摄细胞的显微镜5、用于移动显微镜5的显微镜驱动装置6、控制显微镜驱动装置6的旋具10、基于显微镜5的位置信息而使设置于光源基板的多个光源3的特定光源所对应的电源处于打开状态的切换器7、连接切换器7与光源3的光源布线9、使光源3排列而成的光源基板2、对上述部件进行控制的控制器8。另外，培养装置具备与控制器8相连、且由轨迹球(trackball)或键盘构成的输入部20。显微镜驱动装置6具备具有电机和滚珠丝杠(Ball Screw)结构的驱动设备，能够经由滚珠丝杠结构使显微镜5进行二维移动。另外，滚珠丝杠结构中具有包含回转式编码器等的位置传感器，所述回转式编码器检测滚珠丝杠的旋转量，并将其转换成显微镜5的位置信息从而进行检测。位置传感器通过检测滚珠丝杠的旋转量，能够二维地确定显微镜5的位置。该显微镜5的位置信息经由旋具10传递至控制器8。滚珠丝杠结构由具有螺旋状的槽的滚珠丝杠和沿该槽移动的套筒构成。显微镜5设置于该套筒。通过使滚珠丝杠旋转，可以使套筒和显微镜5直线移动。通过具有两个滚珠丝杠结构，并使其相互成直角，能够使套筒和显微镜5进行二维移动。
在本发明的另一例子中，可以使用如下所述自动培养装置，如日本特开2008-92882号公报所记载，该自动培养装置具备控制设备，所述控制设备由以下部件形成：细胞培养器、拍摄该培养器内的细胞的相机、使该相机的位置沿着上述培养器的拍摄面相对于上述培养器移动的移动设备、存储用上述相机拍摄的图像的存储器、显示该存储器中存储的图像的显示器、能够切换自动拍摄模式和手动拍摄模式，
该自动培养装置的特征在于，上述自动拍摄模式具有如下功能：控制上述移动设备使其与预先确定的上述相机的视野对应，使上述相机扫描将上述拍摄面分割而成的多个小区域的位置，控制上述相机以上述小区域为单位拍摄上述拍摄面并将拍摄图像存入上述存储器，读取存入上述存储器内的图像并将上述拍摄面的整体图像显示于上述显示器；(a)上述手动拍摄模式具有如下功能：基于从输入设备输入的操作指令，控制上述移动设备通过上述相机拍摄上述拍摄面的任意位置的局部图像，并且将拍摄的局部图像显示于上述显示器，或者(b)上述手动拍摄模式具备如下功能：基于通过输入设备在上述显示器上指定的位置，控制上述移动设备移动上述相机的位置，拍摄指定位置的局部图像，并将拍摄的局部图像显示于上述显示器。将自动培养装置的结构的一个例子示于图10和图11。
如图11的立体图所示，本自动培养装置是在保温箱1内设置作为细胞培养器的圆形培养皿2而制成的，保温箱1内调节为已知的温度、CO2等气体浓度。培养皿2设置于由支架3支撑的基板4上，基板4设有不影响从下方观察培养皿2的底面的开口5。在基板4的开口5的下方设有拍摄培养皿2内的细胞的CCD相机6。CCD相机6具备能够观察细胞的高倍率物镜。需要说明的是，可以使用CMOS相机代替CCD相机6。CCD相机6搭载于沿图示箭头Y方向移动的Y轴调节器(actuator)7。Y轴调节器7搭载于沿图示箭头X方向移动的X轴调节器8。而且，在夹着培养皿2且与CCD相机6对置的位置设有光源54，光源54安装于固定在CCD相机6上的支撑臂10的前端。由此构成了移动设备，该移动设备通过Y轴调节器7和X轴调节器8使CCD相机6和光源54的位置沿培养皿2的底面相对于任意位置移动。CCD相机6、Y轴调节器7、X轴调节器8及光源54通过个人电脑(PC)等电脑11进行控制，由此构成了本发明的特征部的观察装置。
电脑11由电脑主机12、显示器13、作为输入设备的键盘14和鼠标15等连接而成。电脑主机12具备CPU、存储器、I/O等，具备通用电脑所必需的I/O。
如图10所示，本装置具备由电脑主机12构成的控制部20，控制部20与保温箱1、CCD相机6、Y轴调节器7、X轴调节器8、显示器13、键盘14、鼠标15连接。键盘14设有中断开关14a、手动开关(X轴)14b、手动开关(Y轴)14c。而且，控制部20与存储用CCD相机6拍摄的图像的图像存储器21和拍摄位置数据存储器22连接。另外，控制部20具备读取图像存储器21中存储的图像并显示于显示器13的未图示的读取设备、以及控制CCD相机6的拍摄切换为自动拍摄模式和手动拍摄模式的控制设备。
使用本装置的操作的详细情况如日本特开2008-92882号公报的段号0029～0053所述。
在本发明的另一例子中，可以使用下述细胞培养装置的细胞检测系统，如日本特开2010-148391号公报所记载，所述细胞培养装置的细胞检测系统具备用于培养细胞的培养器设备，从上述培养器设备获取上述细胞的图像的图像获取设备、使上述图像获取设备和上述培养器设备的任一者移动而调节上述图像获取设备的焦点的焦点位置调节设备、控制上述图像获取设备使得上述图像获取设备在多个焦点位置获取图像的控制设备。所述细胞检测系统的特征在于，其具备从上述多个焦点位置获取的多个图像中选择细胞边缘清楚的图像的图像选择设备、以第1图像和第2图像实施差分处理的提取设备，所述第1图像为上述图像选择设备选择的细胞边缘清楚的图像，所述第2图像为在焦点与该第1图像的焦点位置错开的位置获取的图像。将细胞检测系统的结构的一个例子示于图12～图15。
如图12所示，细胞培养装置11具有其内部与外部空间隔绝的箱型结构，其内部包括以下部件：培养细胞的培养器12、用于拍摄该培养器12内的细胞的CCD相机13、对由CCD相机13获得的图像数据进行处理的图像处理单元14、用于将图像数据传送至图像处理单元14的转换器15、用于移动CCD相机13或培养器12的相机/培养器驱动装置16、用于将相机/培养器驱动装置16移动至任意位置的电机控制器17、设置于CCD相机13的上部的光源18。培养器12由透明的材质成型，CCD相机13由光源18照射，使其能拍摄透射培养器12的透射光。需要说明的是，在上述结构中，CCD相机13优选具备40万像素左右的CCD设备，另外，光源18没有特别限定，但在本实施例中优选为LED。
图13是示出培养装置11内各构成要素的配置的示意图，在图示的例子中示出了培养装置11中固定有培养器12，移动CCD相机13的情况的配置。如图13所示，培养装置11内的上面部安装有光源18。该光源18的下侧设置有培养器12，进而在培养器12的中央附近下侧设置有具备物镜22的CCD相机13。CCD相机13可上下活动地安装于移动用导轨21，通过由CPU32输出的指令而工作的相机/培养器驱动装置16的驱动控制，使其沿移动用导轨21上下移动，在上下方向改变焦点位置拍摄培养器12内的细胞图像。需要说明的是，对于CCD相机13与物镜22组合而成的拍摄装置而言，位于培养器12的中心附近的底面附近的微小面积优选为例如能够拍摄1.5mm(纵)×2.0mm(横)左右的微小区域的面积。
图14是示出图12的图像处理单元14的详细情况的图。图像处理单元14由以下部件组成：经由数据总线31进行运算处理的CPU32、将该CPU32临时作为存储区域使用的主存储器33、存储图像数据和位置信息的外部存储装置34、用于与电机控制器17通讯的通讯端口35、显示细胞提取后的图像的监视器36、接受用户输入的键盘37。在该图像处理单元14中，经由转换器15读取来自CCD相机13的图像，并进行各种图像处理。
图15是示出利用图像处理单元实施细胞提取处理的一个例子的流程图。图15所记载的一系列步骤通过预先安装的软件以细胞培养过程中给定的时间间隔例如1次/天的频率重复，根据CPU32输出的指令依次对图12～图14记载的单元进行驱动控制而实施。需要说明的是，用于以给定的时间间隔重复实施图15中记载的一系列步骤的钟表可以使用CPU32所具有的时钟发生器的输出。图15所示的细胞提取处理的详细情况如日本特开2010-148391号公报的段号0016～0028所述。
本发明提供一种细胞的培养方法，该方法包括使用上述本发明的细胞培养基、细胞用培养基试剂盒或细胞培养系统培养细胞的工序。进而，通过使用该细胞培养基、细胞用培养基试剂盒或细胞培养系统的任一种培养细胞而提供安全的多能干细胞。
本发明提供一种细胞的培养方法，该方法包括使用上述本发明的细胞培养基培养细胞的工序。
本发明中培养的细胞的种类没有特别限定，可以是同时具有多潜能性和自我复制能力的干细胞或分化细胞的任一种，优选为干细胞，进一步优选为多能干细胞。在本发明中，“多能干细胞”是指能够在体外培养、且具有能够分化成构成生物体的所有细胞的多潜能性的细胞。具体而言，可以列举：胚性干细胞(ES细胞)、源自胚胎的原始生殖细胞的多能干细胞(EG细胞：Proc Natl Acad Sci USA.1998,95：13726-13731)、源自睾丸的多能干细胞(GS细胞：Nature.2008,456：344-349)、源自体细胞的人工多能干细胞(inducedpluripotent stem cells；iPS细胞)等。另外，对于培养的细胞所来源的动物种没有特别限定，可以使用任意的源自哺乳类等的细胞，例如，可以使用源自小鼠的细胞或源自人的细胞等。需要说明的是，细胞的培养可以在普通的细胞培养条件下进行。
在本发明的优选方式中，可以在不存在饲养细胞的条件下培养细胞。
在不使用饲养细胞培养多能干细胞等的情况下，可以使用由作为细胞的基础(足場)的培养基质涂布过的培养容器来进行培养。作为细胞的基础(足場)的培养基质，只要是细胞培养用的即可，没有特别限定，可以列举例如：明胶、作为由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤产生且经过分离的基底膜成分的基质胶、胎盘基质、分层蛋白、生腱蛋白、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、聚集蛋白聚糖、双糖链蛋白多糖、凝血酶敏感素、层粘连蛋白(层粘连蛋白-511、层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-332)、纤维连接蛋白、玻璃体结合蛋白、胶原、E-钙粘蛋白、核心蛋白聚糖、合成肽、合成聚合物、源自MEF、人血清或蜕膜间充质细胞的细胞外基质等。
另外，根据其它的方式，在具有未使用如上所述的细胞外基质涂布的表面的培养基材上也可以使用本发明的细胞培养基培养细胞。
根据本发明的其它方式可以提供一种细胞的培养方法，该方法包括在饲养细胞的存在下培养细胞的工序，所述饲养细胞导入了编码生长停滞特异性蛋白质6(Growtharrest-specific 6；GAS6)的氨基酸序列的碱基序列。进而，根据本发明，还可以提供导入了编码生长停滞特异性蛋白质6(Growth arrest-specific 6；GAS6)的氨基酸序列的饲养细胞。即，导入了GAS6基因表达载体的饲养细胞可以用于人多能干细胞在饲养细胞上的培养，也可以用于使培养基驯化。饲养细胞的种类没有限定，可以列举例如：MEF(mouseembryonic fibroblast)、建立的STO细胞株(ATCC保藏编号：CRL-1503)、以及将新霉素抗性基因表达载体和LIF表达载体稳定地导入STO细胞而得到的SNL细胞等源自小鼠的细胞、成纤维细胞、胎盘细胞、骨髓细胞、子宫内膜细胞等源自人的细胞。
进而，本发明提供一种对用于培养细胞的培养基进行评价的方法，该方法包括对培养基中含有的生长停滞特异性蛋白质6(Growtharrest-specific 6；GAS6)进行检测或定量。作为检测和定量GAS6蛋白质的方法，可以在用SDS-PAGE、二维电泳进行分离后，通过MS分析、使用抗GAS6抗体利用蛋白质印迹法进行检测，而且可以通过酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay：ELISA)进行定量。
如以下的实施例所述可知，通过在抗GAS6抗体或GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂的存在下培养iPS细胞，能够抑制iPS细胞的增殖。由此，根据本发明能够提供一种含有抗GAS6抗体或GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂的多能干细胞的增殖抑制剂。
本发明还提供用于抑制多能干细胞的增殖的抗GAS6抗体、以及用于抑制多能干细胞的增殖的GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂。
本发明提供用于多能干细胞的增殖抑制剂的制造的抗GAS6抗体的用途、以及用于多能干细胞的增殖抑制剂的制造的GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂的用途。
本发明的范围还包括：含有本发明的增殖抑制剂的细胞培养基、含有本发明的增殖抑制剂和基本培养基的细胞用培养基试剂盒、以及含有本发明的细胞培养基或细胞用培养基试剂盒和细胞培养装置的细胞培养系统。进而，本发明的范围还包括细胞的培养方法，该方法包括使用本发明的细胞培养基、细胞用培养基试剂盒或细胞培养系统的任一种来培养细胞的工序。增殖抑制剂以外的构成要素及优选的范围如本说明书中所述。
进而，根据本发明，提供一种多能干细胞的培养方法，该方法包括在抑制GAS6的作用的条件下培养多能干细胞的工序。本发明的多能干细胞的培养方法可以在体外进行。通过在抑制GAS6的作用的条件下培养多能干细胞，能够在抑制多能干细胞增殖的状态下进行多能干细胞的培养。即，上述本发明的多能干细胞的培养方法是在抑制多能干细胞增殖的状态下进行多能干细胞培养的方法，该方法包括在抑制GAS6的作用的条件下培养多能干细胞的工序。多能干细胞的具体例子如本说明书中所述，优选为iPS细胞。
本发明中使用的抗GAS6抗体的种类没有特别限定，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。作为抗GAS6抗体，可以是市售的抗体，例如，可以从R&D Systems公司、SantaCruz Biotechnology公司等获得。培养多能干细胞的培养基中含有的抗GAS6抗体的浓度没有特别限定，优选为1ng/ml以上且100ng/ml以下，更优选为10ng/ml以上且100ng/ml以下。
本发明中使用的GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂的种类没有特别限定，优选为TAM家族的受体型酪氨酸激酶(TYRO3、AXL、MER)的抑制剂。具体而言，可以列举：BMS777607[N-(4-((2-氨基-3-氯吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-乙氧基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺]、R428[1-(6,7-二氢-5H-苯并[2,3]环庚[2,4-d]哒嗪-3-基)-3-N-[(7S)-7-吡咯烷-1-基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-3-基]-1,2,4-三唑-3,5-二胺]、以及UNC569[1-((反-4-氨基环己基)甲基)-N-丁基-3-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺]等。
使用BMS777607时的培养基中含有的BMS777607的浓度通常为1ng/ml以上且100ng/ml以下，优选为2ng/ml以上且20ng/ml以下。
使用R428时的培养基中含有的R428的浓度通常为1ng/ml以上且500ng/ml以下，优选为8ng/ml以上且80ng/ml以下。使用UNC569时的培养基中含有的UNC569的浓度通常为0.5ng/ml以上且100ng/ml以下，优选为1ng/ml以上且10ng/ml以下。
作为在抑制GAS6的作用的条件下培养多能干细胞的工序，优选在抗GAS6抗体和/或GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂的存在下培养多能干细胞的工序。
在抑制GAS6的作用的条件下培养多能干细胞的情况下，优选多能干细胞在不含白蛋白的培养基中培养的方式、在不含血清的培养基中培养的方式、在含有GAS6的培养基中培养的方式、在经过MEF驯化的培养基中培养的方式，也可以将上述方式进行组合。
通过以下的实施例对本发明进行具体地说明，但本发明并不限定于实施例。
实施例
(1)驯化的无血清培养基中的蛋白质的检测
驯化培养基(CM)是使用通过丝裂霉素处理而非活化的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)由无血清培养基制备的。以约500,000细胞/直径60mm皿的细胞密度将通过丝裂霉素处理而非活化的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)接种于MEF用培养基(添加了10％FBS的DMEM培养基)中。在至少培养细胞16小时后，用PBS(-)进行清洗，接着用Essential8培养基(Invitrogen)(以下，也将该无血清培养基称为E8培养基)进行清洗，并将培养基置换为相同的无血清培养基。
在置换培养基后，在CO2保温箱内培养(37℃、5％CO2浓度)24小时，然后回收培养基，得到了驯化培养基。
通过抗细胞因子抗体芯片对未驯化的无血清培养基和经过驯化的无血清培养基进行比较分析。在
Figure BDA0002088774790000202
Mouse Cytokine Antibody array G-Series2000(RayBiotech公司)的芯片上使用100μL封闭缓冲液(Blocking Buffer，附带试剂盒)，在25℃下进行30分钟的培养。在芯片上使用150μL的各种培养基(稀释倍率：1.5、换算为蛋白质为155μg左右)，在10℃下培养16小时。然后，使用清洗缓冲液I(附带试剂盒，25℃下2分钟×3次、25℃下10分钟×2次)、清洗缓冲液II(附带试剂盒，25℃下10分钟×2次)进行清洗。清洗后，在芯片上使用70μL生物素结合抗体(Biotin-Conjugated Antibody)，在25℃下培养2小时。用清洗缓冲液I(25℃下2分钟)、清洗缓冲液II(25℃下2分钟×2次)清洗芯片，然后在芯片上使用70μL荧光染料结合链霉抗生物素蛋白(Fluorescent Dye-conjugated Strepyavidin)，在25℃下培养1.5小时。使用清洗缓冲液I(25℃下2分钟)、清洗缓冲液II(25℃下2分钟×2次)、清洗缓冲液I(25℃下10分钟×2次)、超纯水(25℃下1分钟)清洗芯片，然后在1000rpm、25℃的条件下对芯片进行3分钟离心，在遮光下干燥20分钟。使用芯片用扫描仪/>
Figure BDA0002088774790000201
4400A(Molecular Devices,LLC)进行扫描，用分析软件Array-Pro Analyzer Ver.4.5(MediaCybernetics,Inc)根据得到的影像图像对各点的荧光强度值进行定量化。
其结果是，在经过驯化的无血清培养基中，特异性地检测出了核心蛋白聚糖(Decorin)、基质金属蛋白酶-3(Matrix Metalloproteinase-3(MMP3))、骨桥蛋白(Osteopontin(OPN))、肿瘤坏死因子相关凋亡受体微弱诱导剂(TNF-related WeakInducer of Apoptosis Receptor(TWEAK R))、胰岛素样生长因子结合蛋白2(Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2))、半乳糖凝集素1(galectin1(LGALS1))、以及胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1(IGF-1))、GAS6蛋白质。
(2)细胞因子添加试验1
(2-1)未驯化的无血清培养基或经过驯化的无血清培养基的情况
供于实验的人iPS细胞(201B7)从iPS Academia Japan公司获得。人iPS细胞的制备在塑料培养皿上进行维持培养，所述塑料培养皿上接种有用丝裂霉素处理而非活化的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞。培养基使用在D-MEM/F12(Sigma D6421)中添加了最终浓度20％的KNOCKOUTTM SR、0.1mM NEAA(non-essential amino acids)、2mM L-谷氨酰胺、5ng/ml人basic FGF及0.1mM 2-巯基乙醇的培养基，在37℃下于CO2保温箱内进行培养。每6～7天进行传代，使用洗脱液(胶原蛋白酶溶液)将人iPS细胞的菌落从饲养层解离，通过吸液操作分成20～50个左右的小块，然后接种至新的饲养细胞层上。将在饲养细胞上维持培养的人iPS细胞用洗脱液解离，通过吸液操作分成20～50个左右的小块，通过300rpm离心处理5分钟回收iPS细胞，然后在涂布了明胶的培养皿上培养30分钟，由此除去MEF，然后在涂布了Matrigel(注册商标)(BD公司)的培养皿上分为四分之一并接种。培养基使用了未用MEF驯化的无血清培养基(E8培养基)和将该培养基用MEF驯化后的培养基，并进行了比较。
将对增殖性进行比较的结果示于表1。而且，将添加各种因子进行2天培养后用碱性磷酸酶染色而观察得到的结果示于图1。确认了与未驯化的培养基相比，经过驯化的培养基提高了人iPS细胞的增殖效率。
(2-2)
以2ng/ml或100ng/ml的浓度将核心蛋白聚糖(Decorin)、基质金属蛋白酶-3(Matrix Metalloproteinase-3(MMP3))、骨桥蛋白(Osteopontin(OPN))、肿瘤坏死因子相关凋亡受体微弱诱导剂(TNF-related Weak Inducer of Apoptosis Receptor(TWEAKR))、胰岛素样生长因子结合蛋白2(Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2))、半乳糖凝集素1(galectin 1(LGALS1))、或胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowth factor-1(IGF-1))添加于无血清培养基(E8培养基)，与上述(2-1)同样地研究了对人iPS细胞的增殖的影响。
将对增殖性进行比较的结果示于表1，将用碱性磷酸酶染色而观察得到的结果示于图1和图2。在核心蛋白聚糖(Decorin)、半乳糖凝集素1(galectin1(LGALS1))、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1(IGF-1))中确认了人iPS细胞的增殖促进效果。已经报告了核心蛋白聚糖(Decorin)在人多能干细胞的培养中可以用作培养基材的涂布基质(WO9920741)，报告了半乳糖凝集素1促进小鼠ES细胞的增殖(KR2010130677A)，IGF-1是将STEMPRO hESC SFM(Life Technologies公司制造)等添加于培养基得到的。
(2-3)
以2ng/ml或100ng/ml的浓度将GAS6添加于无血清培养基(E8培养基)，与上述(2-1)同样地研究了对人iPS细胞的增殖的影响。将对增殖性进行比较而得到的结果示于表1，将用碱性磷酸酶染色而观察得到的结果示于图2。该结果确认了GAS6对人iPS细胞的增殖促进效果。
(2-4)
分别以2ng/ml或100ng/ml的浓度将GAS6、核心蛋白聚糖(Decorin)、基质金属蛋白酶-3(Matrix Metalloproteinase-3(MMP3))、骨桥蛋白(Osteopontin(OPN))、肿瘤坏死因子相关凋亡受体微弱诱导剂(TNF-related Weak Inducer of Apoptosis Receptor(TWEAKR))、胰岛素样生长因子结合蛋白2(Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2))、半乳糖凝集素1(galectin1(LGALS1))、以及胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1(IGF-1))全部加入无血清培养基(E8培养基)，与上述(2-1)同样地研究了对人iPS细胞的增殖的影响。将与仅添加GAS6的培养基的增殖性进行比较而得到的结果示于表1，将用碱性磷酸酶染色而观察得到的结果示于图2。与仅添加了GAS6的培养基进行比较，进一步确认了人iPS细胞的增殖促进效果。
(3)细胞因子添加试验2
使用以下培养基作为培养基，与上述(2-1)同样地研究了对人iPS细胞的增殖的影响。
未用MEF驯化的无血清培养基(E8培养基)；
用MEF对上述E8培养基进行驯化而得到的培养基(E8CM)；
添加了核心蛋白聚糖(100ng/ml)、基质金属蛋白酶-3(MMP3)(2ng/ml)、GAS6(2ng/ml)、骨桥蛋白(OPN)(100ng/ml)、TWEAK R(2ng/ml)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)(2ng/ml)、半乳糖凝集素1(LGALS1)(2ng/ml)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)(100ng/ml)或BSA(100ng/ml)中的任意一种而得到的E8培养基；
添加了全部核心蛋白聚糖(100ng/ml)、基质金属蛋白酶-3(MMP3)(2ng/ml)、GAS6(2ng/ml)、骨桥蛋白(OPN)(100ng/ml)、TWEAK R(2ng/ml)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)(2ng/ml)、半乳糖凝集素1(LGALS1)(2ng/ml)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)(100ng/ml)或BSA(100ng/ml)而得到的E8培养基(E8+8)；
向用MEF对E8培养基进行驯化而得到的培养基中添加全部核心蛋白聚糖(100ng/ml)、基质金属蛋白酶-3(MMP3)(2ng/ml)、GAS6(2ng/ml)、骨桥蛋白(OPN)(100ng/ml)、TWEAKR(2ng/ml)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)(2ng/ml)、半乳糖凝集素1(LGALS1)(2ng/ml)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)(100ng/ml)或BSA(100ng/ml)而得到的培养基(E8CM+8)；
添加了核心蛋白聚糖(100ng/ml)、GAS6(2ng/ml)、骨桥蛋白(OPN)(100ng/ml)、TWEAK R(2ng/ml)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)(2ng/ml)、半乳糖凝集素1(LGALS1)(2ng/ml)、以及胰岛素样生长因子-1(IGF-1)(100ng/ml)而得到的E8培养基(E8+8-MMP3)；
添加了核心蛋白聚糖(100ng/ml)、基质金属蛋白酶-3(MMP3)(2ng/ml)、GAS6(2ng/ml)、TWEAK R(2ng/ml)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)(2ng/ml)、半乳糖凝集素1(LGALS1)(2ng/ml)、以及胰岛素样生长因子-1(IGF-1)(100ng/ml)而得到的E8培养基(E8+8-OPN)。
将对细胞的增殖性进行比较而得到的结果示于表1。而且如上述(2-1)所述，用碱性磷酸酶对细胞进行染色，测定细胞数量。将使用了E8培养基的情况的细胞数量设为1，求出使用了其它培养基的情况时细胞数量的比率，将求得的结果示于图3。
(4)细胞因子添加试验3
使用以下培养基作为培养基，与上述(2-1)同样地研究了对人iPS细胞的增殖的影响。
未用MEF进行驯化的无血清培养基(E8培养基)；
用MEF对上述E8培养基进行驯化而得到的培养基(E8CM)；
添加了核心蛋白聚糖(100ng/ml)、GAS6(100ng/ml)、骨桥蛋白(OPN)(100ng/ml)、半乳糖凝集素1(LGALS1)(100ng/ml)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)(100ng/ml)或BSA(100ng/ml)中任一种的E8培养基；
添加了全部核心蛋白聚糖(100ng/ml)、基质金属蛋白酶-3(MMP3)(100ng/ml)、GAS6(100ng/ml)、骨桥蛋白(OPN)(100ng/ml)、TWEAKR(100ng/ml)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)(100ng/ml)、半乳糖凝集素1(LGALS1)(100ng/ml)、以及胰岛素样生长因子-1(IGF-1)(100ng/ml)的E8培养基。
将对细胞的增殖性进行比较而得到的结果示于表1，将用碱性磷酸酶染色而观察得到的结果示于图4。对于添加了GAS6的培养基而言，确认了提高了人iPS细胞的增殖效率。另外，用碱性磷酸酶对细胞进行染色，测定细胞数量。将使用了E8培养基的情况的细胞数量设为100，求出使用了其它培养基的情况的细胞数量的比率，将其结果示于图5。
表1
Figure BDA0002088774790000241
(5)关于基质胶
使用未涂布Matrigel(注册商标)(BD公司)的培养皿来代替涂布了Matrigel(注册商标)(BD公司)的培养皿，与上述(2-1)同样地使用未驯化的无血清培养基或经过驯化的无血清培养基比较了人iPS细胞的增殖性。将用碱性磷酸酶对细胞进行染色而观察得到的结果示于图6。对于经过驯化的培养基而言，即使在使用未涂布基质胶的培养皿的情况，细胞也能增殖。
(6)关于抗GAS6抗体
使用涂布了Matrigel(注册商标)(BD公司)的培养皿，向用MEF进行了驯化的无血清培养基(E8培养基)添加100ng/ml的抗GAS6抗体(R&D Systems公司)，与上述(2-1)同样地研究了对人iPS细胞的增殖的影响。用碱性磷酸酶对细胞进行染色，测定细胞数量。将使用由MEF进行驯化而得到的培养基的情况的细胞数量设为100，求出使用其它培养基的情况时细胞数量的比率，将求得的结果示于图7。通过添加抗GAS6抗体，经过MEF驯化而得到的培养基的细胞增殖性降低。
(7)关于抗GAS6抗体及GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂
使用涂布了Matrigel(注册商标)(BD公司)的培养皿，向用MEF进行了驯化的无血清培养基(E8培养基)添加10ng/ml或100ng/ml的抗GAS6抗体(R&D Systems公司)、或者各种GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂、BMS777607(Santa Cruz Biotechnology公司)(2ng/ml或20ng/ml)、R428(Synkinase公司)(8ng/ml或80ng/ml)、UNC569(Calbiochem公司)(1ng/ml或10ng/ml)，与上述(2-1)同样地研究了对人iPS细胞的增殖的影响。将这些均溶解于DMSO，然后通过0.22μm的过滤器进行过滤除菌处理，相对于培养基量添加1/1000的量。用碱性磷酸酶对细胞进行染色，测定细胞数量。将使用了由MEF进行驯化而得到的培养基的情况的细胞数量设为100，求出使用了其它培养基的情况的细胞数量的比率，将求得的结果示于图8。通过添加抗GAS6抗体或各种GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂，用MEF进行驯化而得到的培养基的细胞增殖性降低。

Claims (7)

1.抗GAS6抗体或GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂作为多能干细胞的增殖抑制剂的用途，所述抗GAS6抗体或GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂用于抑制因GAS6引起的多能干细胞的增殖。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂为选自下组中的一种以上：
BMS777607[N-(4-((2-氨基-3-氯吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-乙氧基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺]、
R428[1-(6,7-二氢-5H-苯并[2,3]环庚[2,4-d]哒嗪-3-基)-3-N-[(7S)-7-吡咯烷-1-基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-3-基]-1,2,4-三唑-3,5-二胺]、以及
UNC569[1-((反-4-氨基环己基)甲基)-N-丁基-3-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺]。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，多能干细胞为iPS细胞(induced pluripotentstem cells)。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述抗GAS6抗体或GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂用于含有分离的GAS6的细胞培养基。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述抗GAS6抗体或GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂用于包含含有分离的GAS6的基本培养基的细胞用培养基试剂盒。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述抗GAS6抗体或GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂用于下述细胞培养系统，所述细胞培养系统包含：
(a)含有分离的GAS6的基本培养基、和
(b)细胞培养装置。
7.一种在多能干细胞的增殖受到抑制的状态下培养多能干细胞的方法，该方法包括如下工序：使用包含抗GAS6抗体或GAS6受体型酪氨酸激酶抑制剂、以及分离的GAS6的细胞培养基对多能干细胞进行培养。
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