CN110279739B - 野菊花提取物在制备用于防治口含烟引起的口腔上皮细胞死亡的药物或保健品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及野菊花提取物在制备用于防治口含烟引起的口腔上皮细胞死亡的药物或保健品中的应用，属于新型烟草制品研究技术领域。本发明发现人在品食口含烟的时候，口腔上皮细胞微环境的渗透压升高；口腔细胞暴露在高渗环境中会导致细胞死亡；在高渗溶液中加入野菊花提取物可以改善因为其引起的细胞死亡。本发明为野菊花提取物发掘了新的用途，为今后开发高渗引起的口腔上皮细胞死亡保护物质奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于新型烟草制品研究技术领域，具体涉及野菊花提取物在制备用于防治口含烟引起的口腔上皮细胞死亡的药物或保健品中的应用。
背景技术
口腔是人体最早接触食物并开始消化的器官。口腔上皮中，大多数部位并没有角化层（和皮肤相比），也没有粘液形成的粘液层（和胃肠道相比），因此口腔上皮细胞直接暴露于外界环境中，当食品药品中的部分物质对上皮细胞产生死亡时，口腔不适随之发生。
研究表明口腔细胞死亡的原因之一是口腔唾液的渗透压收外界影响发生了改变。人在静息态唾液的渗透压约为50 mOsmol/L，而在摄取并咀嚼食物后，由于食物的降解以及小分子（包括盐离子、葡萄糖和氨基酸等）的释放，口腔内的渗透压会迅速升高至600-900mOsmol/L，大约相当于人体液正常渗透压的2-3倍（正常渗透压为285-295 mOsmol/L）。
口含烟主要指通过口腔咀嚼、含化、口含等方式进行消费的无烟气烟草制品。消费者问卷调查表明，部分袋装口含烟会引起口腔不适，包括造成唇部不适，唾液量增多，口腔有刺激感等，从而影响消费者在使用产品时的口腔感受。由于部分口含烟会添加糖分、盐分等成分，从而导致口腔形成高渗环境。
野菊花（学名：Dendranthema indicum）为菊科多年生草本植物，野菊花性微寒，具疏散风热、消肿解毒。能治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、风火赤眼、头痛眩晕等病证。本发明将其应用保护到口含烟引起的口腔上皮细胞死亡中，至今未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供野菊花提取物在制备用于防治口含烟引起的口腔上皮细胞死亡的药物或保健品中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
野菊花提取物在制备用于防治口含烟引起的口腔上皮细胞死亡的药物或保健品中的应用。
进一步，优选的是，所述的口含烟为袋装口含烟。
进一步，优选的是，所述的野菊花提取物的制备方法包括如下步骤：
步骤（1），取野菊花干燥的头状花序，粉碎后，用超纯水震荡提取；
步骤（2），提取液采用高速冷冻离心机离心，留取上清液，弃沉淀；
步骤（3），上清液冻干后保存备用，得到野菊花提取物，冻干条件为：-30℃，24小时。
进一步，优选的是，用超纯水震荡提取多次，每次1小时。
进一步，优选的是，称取野菊花干燥的头状花序100g，粉碎后，分别用1L、500 ml和300 ml的超纯水震荡提取各一次，每次提取时间为1小时。
进一步，优选的是，高速冷冻离心机的离心参数为16000 g，30分钟。
进一步，优选的是，高速冷冻离心机的离心时的温度为4℃。
进一步，优选的是，冻干温度为-30℃，时间为24小时。
本发明对于步骤（1）粉碎后的粒径没有限制。
本领域技术人员应该知晓所述的保健品包括具有保健功能的食品和饮品。
本领域技术人员应该知晓本发明对于野菊花提取物的提取方法不限于上述方法。
本发明首先采用口含烟中常用的NaCl和葡萄糖（Glucose），加入无血清培养基中，测定渗透压的改变，再用不同渗透压的培养基刺激永生化的人口腔上皮细胞hTERT-OME，在实验中，同时设置野菊花提取物组（在高渗培养基中加入不同浓度的野菊花提取物）、空白组（培养基和MTS溶液，无细胞）、对照组（未经过高渗处理正常培养的细胞），每组设置三个复孔。刺激一段时间后用MTS试剂盒检测存活细胞。结果表明：人在品食口含烟的时候，口腔上皮细胞微环境的渗透压升高；口腔细胞暴露在高渗环境中会导致细胞死亡；在高渗溶液中加入野菊花提取物可以改善因为其引起的细胞死亡。本发明为野菊花提取物发掘了新的用途，为今后开发高渗引起的口腔上皮死亡保护物质奠定基础。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1、本发明的研究揭示了口含烟影响口腔不适的重要原因是引起了唾液渗透压改变；在试验过程中，建立了一种简单的可评估渗透压对细胞影响的检测方法，通过该方法发现野菊花提取物能够用于防治口含烟引起的口腔上皮细胞死亡；
2、本发明为野菊花提取物发掘了新的用途，为今后开发高渗引起的口腔上皮死亡保护物质奠定基础。2倍于生理渗透压（580mOsmol/L）的高NaCl培养基或者高葡萄糖培养基处理口腔上皮细胞8-12小时可以导致细胞约40%的细胞死亡，而加入5 mg/ml的野菊花提取物则可以几乎将细胞死亡的比例降低至10%以下。
3、本发明为野菊花提取物直接在口含烟使用中高渗引起的口腔上皮细胞死亡保护中提供了基础。口含烟提取物和上皮细胞孵育8小时导致约50%口腔上皮细胞死亡，但是加入5 mg/ml的野菊花提取物则可以将细胞死亡的比例降低至10%以下。
附图说明
图1为静息态口腔唾液渗透压测定结果和使用口含烟后口腔渗透压的结果；
图2为高渗透压对细胞死亡作用检测结果；其中，（A）通过在培养基中加入氯化钠的方法调高渗透压培养基，用不同渗透压的培养基处理口腔上皮细胞12小时后，用MTS测定细胞活力后计算细胞存活比例；（B）通过在培养基中加入葡萄糖的方法调高渗透压培养基，用不同渗透压的培养基处理口腔上皮细胞12小时后，用MTS测定细胞活力后计算细胞存活比例；（C）用两倍于生理渗透压（生理渗透压为290 mOsmol/L）的高氯化钠培养基处理细胞不同时间，后用MTS测定细胞活力，计算细胞存活比例；（D）用两倍于生理渗透压（生理渗透压为290 mOsmol/L）的高葡萄糖培养基处理细胞不同时间，后用MTS测定细胞活力，计算细胞存活比例；
图3为添加野菊花提取物后对高渗引起的细胞死亡的干预结果；其中，A为使用高氯化钠导致的高渗培养基得到的结果，B为使用高葡萄糖导致的高渗培养基中的到的检测结果；
图4为添加野菊花提取物后对口含烟提取物引起的细胞死亡的干预结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1：人在摄食胶基型口含烟1分钟后唾液渗透压
（1）随机招募了身体健康的25名志愿者，志愿者基本情况如下：年龄：22-24岁；性别：男性12名，女性13名；
（2）每位志愿者在静息状态收集其唾液，16000rpm离心5min，上清用于渗透压测定。
（3）在静息态采集唾液间隔1小时后，志愿者按照说明使用口含烟（Snus Frost，美国Camel产品）。
（4）在使用后第1分钟收集志愿者口腔内全部唾液（期间不可吞咽或者吐出唾液）。
（5）对唾液渗透压进行测定，评估无烟气烟草使用对唾液渗透压的影响。测定结果如图1所示，志愿者在静息态的唾液渗透压平均值为42.88 mOsmol/L。而在使用口含烟后则为619.60 mOsmol/L，增加了十倍多。
这些结果说明，在使用口含烟时，口腔将暴露在高渗的微环境中。
实施例2：高渗透压对细胞死亡作用检测
（1）细胞培养与传代：永生化的人口腔上皮细胞hTERT-OME购自Abmgood公司，并培养于含有体积百分数为1%胎牛血清（Hyclone产品）的MCDB151培养基（Sigma-Aldrich产品）的25cm2培养瓶中。细胞生长至80%融合状态后，弃培养液，用PBS洗涤一次，加入0.5-1mL0.25%胰蛋白酶-0.53mM EDTA消化液（Sigma-Aldrich产品），37℃消化1-5分钟。细胞变圆后，弃去消化液。加入含体积百分数为10%胎牛血清的MCDB151培养基，吹打重悬细胞，600g离心5分钟，弃上清，细胞重悬于15 ml前述含体积百分数为1%胎牛血清的MCDB151培养基中，按照1:3的比例传代。每2-3天换液一次，半量换液，换液的时候是换成新的含有体积百分数为1%胎牛血清的MCDB151培养基。
（2）利用MCDB151无血清培养基配置高渗溶液，分别使用添加NaCl、Glucose的方法调整培养基中的渗透压，对细胞进行不同渗透压的培养基或者固定渗透压进行不同时间刺激。使用的渗透压为无血清培养基的1.25倍、1.50倍、1.75倍、2.00倍和2.50倍。无血清培养基的渗透压为290 mOsmol/L，该渗透压也为生理渗透压。
（3）将处在对数生长期的hTERT-OME接种于96孔板中，每孔细胞数量为8000个，培养基体积为100 μl，采用无血清MCDB151培养基。细胞贴壁培养24小时后，更换细胞培养基为上述（2）中配制的等渗或者高渗培养基进行培养。
采用如下两种方式来检测高渗环境对细胞存活率的影响：
a）用2倍生理渗透压（580 mOsmol/L）处理细胞不同时间（4小时、8小时、12小时和24小时）；
b）用不同渗透压（290、363、435、580、1160 mOsmol/L）处理细胞12小时。
（4）在细胞培养终点，使用Promega的MTS试剂盒检测存活细胞，在每个细胞培养孔中加入10 μl MTS溶液，37℃孵育2小时。测定490 nm各孔的吸光值。在实验中，同时设置空白组（培养基和MTS溶液，无细胞），对照组（未经过高渗处理正常培养的细胞），每组设置三个复孔。
（5）实验结果如图2所示：在培养基中添加额外的氯化钠或葡萄糖后，细胞出现时间和渗透压依赖的细胞死亡。当固定不同渗透压培养基处理细胞时间为12小时，改变培养基渗透压时，在2倍生理渗透压（580 mOsmol/L）时，即有约50%的细胞死亡。细胞对葡萄糖引起的高渗透压更为耐受，4倍的葡萄糖高渗培养基可以引起50%的细胞死亡。固定培养基的渗透压为580 mOsmol/L刺激细胞，细胞随着刺激时间延长，细胞存活比例下降。
实施例3野菊花提取物的制备
（1）称取野菊花干燥的头状花序100g，粉碎后，分别用1L、500 ml和300 ml的超纯水震荡提取各一次，每次提取时间为1小时。
（2）合并提取液，16000 g高速冷冻离心（4℃， 16000g，30分钟），留取上清液，弃沉淀。
（3）上清液冻干后保存备用，得到野菊花提取物，冻干条件为：-30℃，24小时。
实施例4添加野菊花天然提取物后对高渗引起的细胞死亡的干预
1.按照上述实施例2中相同的方法检测细胞死亡，选取2倍于生理渗透压的条件，即580 mOsmol/L进行实验，对细胞hTERT-OME的刺激时间设置为8小时（氯化钠）或者12小时（葡萄糖）。
2.在高渗培养基中加入不同浓度的野菊花提取物（CI extract），浓度包括：1 mg/ml、2 mg/ml、5 mg/ml。培养上述指定时间后，用MTS法检测细胞存活率。
3.实验结果如图3所示，在培养基中加入野菊花提取物（按照实施例3中的方法提取），其可以呈剂量依赖的方式抑制高渗引起的细胞死亡，5 mg/ml野菊花提取物可以几乎完全抑制因高渗导致的口腔上皮细胞死亡。在等渗情况下，5 mg/ml野菊花提取物对细胞没有细胞毒性。在高渗培养基中，野菊花提取物在不同浓度（1-5 mg/ml）可不同程度对细胞起到保护作用。
实施例5添加野菊花提取物后对口含烟提取物引起的细胞死亡的干预
1.用MCDB151培养基制备口含烟提取物：取唇烟（Snus Frost）1片，加入2 mlMCDB151培养基（预热至37℃），置于研钵中，用研磨杵挤压4次（间隔15秒挤压一次）。1 min后，弃烟袋及其剩余内容物，取萃取液16000 rpm离心10 min，经0.22 μm滤膜过滤备用，如不立即使用，冻存于-80℃。
2.口含烟提取物渗透压测定：对上述1中的提取物进行渗透压测定（美国/wescor），测得渗透压为：785±17 mOsmoL/kg。
3.按照上述实施例2中相同的方法检测细胞死亡，细胞刺激的培养基包括：（1）对照组：无血清MCDB151培养基；（2）野菊花提取物对照组：MCDB151培养基中添加5 mg/ml野菊花提取物；（3）口含烟提取物刺激组：用MCDB151提取的口含烟提取物；（4）野菊花提取物保护组：用MCDB151提取的口含烟提取物中添加5 mg/ml野菊花提取物。刺激时间设置为8小时，用MTS法检测细胞存活率。
4.实验结果如图4所示，在MCDB151培养基中添加5 mg/ml野菊花提取物对细胞存活没有影响，口含烟提取物在刺激口腔上皮细胞8小时后，导致约50%细胞死亡，但是在口含烟提取物中添加5 mg/ml野菊花提取物可以有效保护口含烟提取物引起的细胞死亡。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (4)
1.一种能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的口含烟，其特征在于，活性成分包括野菊花提取物；
所述的野菊花提取物的制备方法包括如下步骤：
步骤（1），取野菊花干燥的头状花序，粉碎后，用超纯水震荡提取；
步骤（2），提取液采用高速冷冻离心机离心，留取上清液，弃沉淀；
步骤（3），上清液冻干后保存备用，得到野菊花提取物，冻干条件为：-30℃，24小时；
所述的口含烟为袋装口含烟；
用超纯水震荡提取多次，每次1小时。
2.根据权利要求1所述的能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的口含烟，其特征在于，称取野菊花干燥的头状花序100g，粉碎后，分别用1L、500 ml和300 ml的超纯水震荡提取各一次，每次提取时间为1小时。
3.根据权利要求1所述的能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的口含烟，其特征在于，高速冷冻离心机的离心参数为16000 g，30分钟。
4.根据权利要求1所述的能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的口含烟，其特征在于，高速冷冻离心机的离心时的温度为4℃。
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