CN111264899B - 一种能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟及其制备方法 - Google Patents
一种能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟及其制备方法，属于无烟气烟草制品技术领域。取苦丁茶粉碎后，用超纯水震荡提取多次，合并提取液，4℃下离心，取上清液，上清液冻干后保存备用，得到苦丁茶提取物；烟叶粉碎至粒径为50~100目，并控制含水率为8~12%，得到烟叶粉末；向步骤（2）得到的烟叶粉末中加入的水，之后进行热处理，之后再按顺序加入矫味剂、1~6份酸碱调节剂、香味剂、苦丁茶提取物、清凉剂和抗氧化剂，混合至均匀，冷藏后，杀菌，包装，得到能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟。本发明制备方法简单可靠，制得的袋装口含烟能有效降低口腔风险，可以大大改善现有的袋装口含烟由于产生高渗环境导致口腔上皮细胞死亡的情况。
Description
技术领域
本发明属于无烟气烟草制品技术领域，具体涉及一种能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟及其制备方法。
背景技术
无烟气烟草（Smokeless Tobacco, 简称ST）制品是指不经燃烧，直接通过口腔或鼻腔吸食的烟草制品，与传统卷烟相比其有害成分少，危害性较小；同时它不产生二手烟气，能在一定程度上缓解公共场所禁烟和吸烟的矛盾，并在一定程度上满足烟民的生理需要。口含烟，一般有瑞典口含烟和美式口含烟之分。瑞典口含烟，是一种具有瑞典风格的湿烟粉，通常由具有一定颗粒度的烟草粉末混合适量的香味物质、矫味剂、水、保润剂和酸碱调节剂经热处理加工制成。水分含量一般在30%~60%之间，有散装和袋装两种类型。这类产品是北欧最古老的无烟气制品之一，在瑞典较为常见，几乎20%的瑞典男性使用这种无烟气烟草制品。其使用方法可以直接取一定量散装产品或者袋装产品放在上嘴唇和牙龈之间进行消费。当前，袋装瑞典口含烟日益流行，很多烟草公司推出相关产品。美式口含烟，是由晾烟或明火烤烟加工而成的一种潮湿的烟粉或者烟丝烟草制品，水分高于40%，有散装和袋装两种类型，通常含在嘴唇和牙龈之间消费。美式口含烟在北美与欧洲较为受欢迎，是目前在美国市场份额最大的一种无烟气烟草制品。目前，此类产品，在外观上与瑞典口含烟较为相似，均是使用无纺布包装成的袋装小袋，也称为袋装口含烟。
由于这类烟草制品不像传统卷烟那样经过燃烧后由呼吸道消费烟气，而是通过口腔由消化道消费烟碱。口腔是人体最早接触食物并开始消化的器官。口腔上皮中，大多数部位并没有角化层（和皮肤相比），也没有粘液形成的粘液层（和胃肠道相比），因此口腔上皮细胞直接暴露于外界环境中，当食品药品中的部分物质对上皮细胞产生死亡时，口腔不适随之发生。研究表明口腔细胞死亡的原因之一是口腔唾液的渗透压受外界影响发生了改变。人在静息态唾液的渗透压约为50 mOsmol/L，而在摄取并咀嚼食物后，由于食物的降解以及小分子（包括盐离子、葡萄糖和氨基酸等）的释放，口腔内的渗透压会迅速升高至600-900mOsmol/L，大约相当于人体液正常渗透压的2-3倍（正常渗透压为285-295 mOsmol/L）。消费者问卷调查表明，部分袋装口含烟会引起口腔不适，包括造成唇部不适，唾液量增多，口腔有刺激感等，从而影响消费者在使用产品时的口腔感受。由于部分口含烟会添加糖分、盐分等成分，从而导致口腔形成高渗环境。
苦丁茶，是冬青科冬青属苦丁茶种常绿乔木，俗称茶丁、富丁茶、皋卢茶，主要分布在西南地区及华南地区等地，是纯天然保健饮料。苦丁茶中含有苦丁皂甙、氨基酸、维生素C、多酚类、黄酮类、咖啡碱、蛋白质等200多种成分。成品茶清香有苦味、而后甘凉，具有清热消暑、明目益智、生津止渴、利尿强心、润喉止咳、降压减肥、抑癌防癌、抗衰老、活血脉等多种功效，素有“保健茶”、“美容茶”、“减肥茶”、“降压茶”、“益寿茶”等美称。
如何利用苦丁茶来制备一种能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟以克服现有技术的不足是目前无烟气烟草制品技术领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟及其制备方法。本发明发现人在长期吸食袋装口含烟时，口腔上皮细胞微环境的渗透压升高，口腔细胞暴露在高渗环境中会导致细胞死亡，在高渗溶液中加入苦丁茶提取物可以改善因为其引起的细胞死亡，能显著降低吸食袋装口含烟引起的口腔风险。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取苦丁茶粉碎后，用超纯水震荡提取多次，合并提取液，4℃下离心，取上清液，上清液冻干后保存备用，得到苦丁茶提取物；
步骤（2），将烟叶粉碎至粒径为50~100目，并控制含水率为8~12%，得到烟叶粉末；
步骤（3），按照重量份数计，向步骤（2）得到的45~60份烟叶粉末中加入10~30份的水，之后进行巴氏热处理（Pasteurised in a proprietary heat treatment process），之后再按顺序加入1~15份矫味剂、1~6份酸碱调节剂、5~20份香味剂、1~5份保润剂、1~5份清凉剂、1~5份抗氧化剂和步骤（1）得到的苦丁茶提取物，混合至均匀，冷藏后，杀菌，包装，得到能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟；
其中，苦丁茶提取物的加入质量为烟叶粉末、水、矫味剂、酸碱调节剂、香味剂、保润剂、清凉剂和抗氧化剂总质量的0.5~10%。
进一步，优选的是，步骤（1）中，提取次数为3次，每次超纯水震荡提取1小时，苦丁茶与每次超纯水的用量比为：100g：1000ml：500ml：300ml；离心参数为16000g、30分钟；冻干温度为-30℃，冻干时间为24小时。
进一步，优选的是，步骤（3）中，巴氏热处理温度80~120℃，热处理时间10~180min；混合采用搅拌的方式，时间为4~6小时。
进一步，优选的是，步骤（3）中，冷藏温度为4~12℃，冷藏时间10~30小时；杀菌采用紫外杀菌，时间3~6小时；包装小袋质量为2.0g±10%。
进一步，优选的是，所述的烟叶为烤烟、晾晒烟和白肋烟中的一种或多种的混合物。
进一步，优选的是，所述的矫味剂为氯化钠、单糖、二糖、三糖、多糖、多元醇和增甜剂中的一种或多种的混合物；所述酸碱调节剂为碳酸氢钠和/或碳酸钠；所述的香味剂为柠檬、薄荷、咖啡、草莓、蓝莓、菠萝、桃子、苹果、橘子、西瓜、红枣、乌梅和橄榄味香精香料中的一种或多种的混合物。
进一步，优选的是，所述的所述的多元醇为甘露醇或麦芽糖醇；所述增甜剂为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、糖精、阿斯巴甜、安赛蜜、三氯蔗糖、糖精或环己氨基磺酸盐。
进一步，优选的是，所述的保润剂为丙二醇和/或丙三醇；清凉剂为薄荷脑、薄荷素油和椒样薄荷脑一种或多种的混合物；抗氧化剂为维生素A、维生素C、维生素E和茶多酚中的一种或多种的混合物。
本发明同时提供上述能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟的制备方法制得的能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟。
本发明还提供上述苦丁茶提取物在制备防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的药物、保健品、烟草制品中的应用。
本发明首先采用口含烟中常用的氯化钠（NaCl）和葡萄糖（Glucose），加入无血清培养基中，测定渗透压的改变，再用不同渗透压的培养基刺激永生化的人口腔上皮细胞hTERT-OME，在实验中，同时设置苦丁茶提取物组（在高渗培养基中加入不同浓度的苦丁茶提取物）、空白组（培养基和MTS溶液，无细胞）、对照组（未经过高渗处理正常培养的细胞），每组设置三个复孔。刺激一段时间后用MTS试剂盒检测存活细胞。结果表明：人在品食口含烟的时候，口腔上皮细胞微环境的渗透压升高；口腔细胞暴露在高渗环境中会导致细胞死亡；在高渗溶液中加入苦丁茶提取物可以改善因为其引起的细胞死亡。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1、本发明发现人在长期吸食袋装口含烟时，口腔上皮细胞微环境的渗透压升高，口腔细胞暴露在高渗环境中会导致细胞死亡，在高渗溶液中加入苦丁茶提取物可以改善因为其引起的细胞死亡，能显著降低吸食袋装口含烟引起的口腔风险。
2、本发明制备方法简单可靠，制得的袋装口含烟能有效降低口腔风险，可以大大改善现有的袋装口含烟由于产生高渗环境导致口腔上皮细胞死亡的情况；
3、本发明为苦丁茶提取物直接在口含烟使用中高渗引起的口腔上皮细胞死亡保护中提供了基础。口含烟提取物和上皮细胞孵育8小时导致50%口腔上皮细胞死亡，但是加入了5mg/ml的苦丁茶提取物可以将细胞死亡的比例降低至10%以下。
附图说明
图1为静息态口腔唾液渗透压测定结果和使用口含烟后口腔渗透压的结果；
图2为高渗透压对细胞死亡作用检测结果；其中，（A）通过在培养基中加入氯化钠的方法调高渗透压培养基，用不同渗透压的培养基处理口腔上皮细胞12小时后，用MTS测定细胞活力后计算细胞存活比例；（B）通过在培养基中加入葡萄糖的方法调高渗透压培养基，用不同渗透压的培养基处理口腔上皮细胞12小时后，用MTS测定细胞活力后计算细胞存活比例；（C）用两倍于生理渗透压（生理渗透压为290 mOsmol/L）的高氯化钠培养基处理细胞不同时间，后用MTS测定细胞活力，计算细胞存活比例；（D）用两倍于生理渗透压（生理渗透压为290 mOsmol/L）的高葡萄糖培养基处理细胞不同时间，后用MTS测定细胞活力，计算细胞存活比例。**：t检验P<0.01
图3为添加苦丁茶提取物后对高渗引起的细胞死亡的干预结果；其中，A为使用高氯化钠导致的高渗培养基得到的结果，B为使用高葡萄糖导致的高渗培养基中的到的检测结果。**：t检验P<0.01
图4为添加苦丁茶提取物后的口含烟对口腔上皮细胞死亡的干预结果。**：t检验P<0.01；
图5为在袋装口含烟中添加不同比例的苦丁茶提取物对其提取物影响口腔上皮细胞存活率结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
以下实施例中未有特别说明，百分比均为重量百分比，比例均为质量比。
实施例1
一种能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取苦丁茶粉碎后，用超纯水震荡提取多次，合并提取液，4℃下离心，取上清液，上清液冻干后保存备用，得到苦丁茶提取物；
步骤（2），将烟叶粉碎至粒径为50~100目，并控制含水率为8~12%，得到烟叶粉末；
步骤（3），按照重量份数计，向步骤（2）得到的45份烟叶粉末中加入10份的水，之后进行巴氏热处理，之后再按顺序加入1份矫味剂、1份酸碱调节剂、5份香味剂、1份保润剂、1份清凉剂、1份抗氧化剂和步骤（1）得到的苦丁茶提取物，混合至均匀，冷藏后，杀菌，包装，得到能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟；
其中，苦丁茶提取物的加入质量为烟叶粉末、水、矫味剂、酸碱调节剂、香味剂、保润剂、清凉剂和抗氧化剂总质量的0.5%。
实施例2
一种能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取苦丁茶粉碎后，用超纯水震荡提取多次，合并提取液，4℃下离心，取上清液，上清液冻干后保存备用，得到苦丁茶提取物；
步骤（2），将烟叶粉碎至粒径为50~100目，并控制含水率为8~12%，得到烟叶粉末；
步骤（3），按照重量份数计，向步骤（2）得到的45份烟叶粉末中加入10份的水，之后进行巴氏热处理，之后再按顺序加入1份矫味剂、1份酸碱调节剂、5份香味剂、1份保润剂、1份清凉剂、1份抗氧化剂和步骤（1）得到的苦丁茶提取物，混合至均匀，冷藏后，杀菌，包装，得到能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟；
其中，苦丁茶提取物的加入质量为烟叶粉末、水、矫味剂、酸碱调节剂、香味剂、保润剂、清凉剂和抗氧化剂总质量的0.5%。
步骤（3）中，巴氏热处理温度80℃，热处理时间10min；混合采用搅拌的方式，时间为4小时。
步骤（3）中，冷藏温度为4℃，冷藏时间10小时；杀菌采用紫外杀菌，时间3小时；包装小袋质量为2.0g±10%。
所述的烟叶为烤烟。
所述的矫味剂为氯化钠；
所述酸碱调节剂为碳酸氢钠；
所述的香味剂为柠檬。
所述的保润剂为丙二醇；
清凉剂为薄荷脑；
抗氧化剂为维生素A。
实施例3
一种能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取苦丁茶粉碎后，用超纯水震荡提取多次，合并提取液，4℃下离心，取上清液，上清液冻干后保存备用，得到苦丁茶提取物；
步骤（2），将烟叶粉碎至粒径为50~100目，并控制含水率为8~12%，得到烟叶粉末；
步骤（3），按照重量份数计，向步骤（2）得到的60份烟叶粉末中加入30份的水，之后进行巴氏热处理，之后再按顺序加入15份矫味剂、6份酸碱调节剂、20份香味剂、5份保润剂、5份清凉剂、5份抗氧化剂和步骤（1）得到的苦丁茶提取物，混合至均匀，冷藏后，杀菌，包装，得到能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟；
其中，苦丁茶提取物的加入质量为烟叶粉末、水、矫味剂、酸碱调节剂、香味剂、保润剂、清凉剂和抗氧化剂总质量的10%。
步骤（3）中，巴氏热处理温度120℃，热处理时间180min；混合采用搅拌的方式，时间为6小时。
步骤（3）中，冷藏温度为12℃，冷藏时间30小时；杀菌采用紫外杀菌，时间6小时；包装小袋质量为2.0g±10%。
所述的烟叶为晾晒烟和白肋烟（质量比为1：1）。
所述的矫味剂为氯化钠、甘露醇、麦芽糖（质量比为1：1：1）；
所述酸碱调节剂为碳酸钠；
所述的香味剂为薄荷、咖啡和橄榄味香精（质量比为1：1：1）。
所述的保润剂为丙二醇和丙三醇（质量比为1：1）；
清凉剂为薄荷素油和椒样薄荷脑（质量比为1：1）；
抗氧化剂为维生素E和茶多酚（质量比为10：1）。
实施例4
一种能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取苦丁茶粉碎后，用超纯水震荡提取多次，合并提取液，4℃下离心，取上清液，上清液冻干后保存备用，得到苦丁茶提取物；
其中，提取次数为3次，每次超纯水震荡提取1小时，苦丁茶与每次超纯水的用量比为：100g：1000ml：500ml：300ml；离心参数为16000g、30分钟；冻干温度为-30℃，冻干时间为24小时；
步骤（2），将烟叶粉碎至粒径为50~100目，并控制含水率为8~12%，得到烟叶粉末；
步骤（3），按照重量份数计，向步骤（2）得到的50份烟叶粉末中加入20份的水，之后进行巴氏热处理，之后再按顺序加入3份矫味剂、3份酸碱调节剂、8份香味剂、3份保润剂、2份清凉剂、2份抗氧化剂和步骤（1）得到的苦丁茶提取物，混合至均匀，冷藏后，杀菌，包装，得到能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟；
其中，苦丁茶提取物的加入质量为烟叶粉末、水、矫味剂、酸碱调节剂、香味剂、保润剂、清凉剂和抗氧化剂总质量的1%。
步骤（3）中，巴氏热处理温度100℃，热处理时间60min；混合采用搅拌的方式，时间为5小时。
步骤（3）中，冷藏温度为6℃，冷藏时间15小时；杀菌采用紫外杀菌，时间4小时；包装小袋质量为2.0g±10%。
所述的烟叶为烤烟。
所述的矫味剂为氯化钠、安赛蜜（质量比为2：1）；
所述酸碱调节剂为碳酸氢钠和碳酸钠（质量比为1：3）；
所述的香味剂为桃子、苹果味香精（质量比为1：1）。
所述的保润剂为丙二醇；
清凉剂为薄荷素油；
抗氧化剂为维生素C。
应用实例
一种能降低口腔上皮健康风险的袋装口含烟的制备方法，包括如下步骤：
a、选取德阳晾晒烟、湖北白肋烟（C3F）、云南烤烟（B2F）、福建烤烟（C3F），将收集到的烟叶原料分别粉碎，过筛，保留20~60目之间的筛分并混合，并控制含水率为8~12%。
b、苦丁茶提取物的制备
（1）称取苦丁茶100g，粉碎后，分别用1000ml、500ml、300ml的超纯水震荡提取各一次，每次提取时间为1小时。
（2）合并提取液，16000 g高速冷冻离心（4℃，16000g，30分钟），留取上清液，弃沉淀。
（3）上清液冻干后保存备用，得到苦丁茶提取物，冻干条件为：-30℃，24小时。
c、将步骤a烟叶粉末50份加入到13份水中，通过巴氏消毒锅加热，热处理温度100℃，热处理2小时后，加入氯化钠2份、葡萄糖2份、阿巴斯甜1份、碳酸钠2份、苹果香精20份、甘油2份、薄荷脑1份、维生素C1份、苦丁茶提取物2份，掺配均匀，密封冷藏24小时，经紫外杀菌3小时，分装即为成品，每袋0.2 g，小袋规格为1.4 cm*2.8cm。
d、人在摄食袋装型口含烟1分钟后唾液渗透测定
（1）随机招募了身体健康的25名志愿者，志愿者基本情况如下：年龄：22-24岁；性别：男性12名，女性13名；
（2）每位志愿者在静息状态收集其唾液，16000rpm离心5min，上清用于渗透压测定。
（3）在静息态采集唾液间隔1小时后，志愿者按照说明使用口含烟（Snus Frost，美国Camel产品）。
（4）在使用后第1分钟收集志愿者口腔内全部唾液（期间不可吞咽或者吐出唾液）。
（5）对唾液渗透压进行测定，评估无烟气烟草使用对唾液渗透压的影响。测定结果如图1所示，志愿者在静息态的唾液渗透压平均值为42.88 mOsmol/L。而在使用口含烟后则为619.60 mOsmol/L，增加了十倍多。
这些结果说明，在使用口含烟时，口腔将暴露在高渗的微环境中。
以上结果见附图1。
e、高渗透压对细胞死亡作用检测
（1）细胞培养与传代：永生化的人口腔上皮细胞hTERT-OME购自Abmgood公司，并培养于含有1%胎牛血清（体积分数）（Hyclone产品）的MCDB151培养基（Sigma-Aldrich产品）的25cm2培养瓶中。细胞生长至80%融合状态后，弃培养液，用PBS洗涤一次，加入0.5-1mL0.25%胰蛋白酶-0.53mM EDTA消化液（Sigma-Aldrich产品），37℃消化1-5分钟。细胞变圆后，弃去消化液。加入含10%胎牛血清的MCDB151培养基，吹打重悬细胞，600g离心5分钟，弃上清，细胞重悬于15 ml前述含1%胎牛血清的MCDB151培养基中，按照1:3的比例传代。每2-3天换液一次，半量换液，换液的时候是换成新的含有1%胎牛血清的MCDB151培养基。
（2）利用MCDB151无血清培养基配置高渗溶液，分别使用添加NaCl、Glucose的方法调整培养基中的渗透压，对细胞进行不同渗透压的培养基或者固定渗透压进行不同时间刺激。使用的渗透压为无血清培养基的1.25倍、1.50倍、1.75倍、2.00倍和2.50倍。无血清培养基的渗透压为290 mOsmol/L，该渗透压也为生理渗透压。
（3）将处在对数生长期的hTERT-OME接种于96孔板中，每孔细胞数量为8000个，培养基体积为100 μl，采用无血清MCDB151培养基。细胞贴壁培养24小时后，更换细胞培养基为上述（2）中配制的等渗或者高渗培养基进行培养。
采用如下两种方式来检测高渗环境对细胞存活率的影响：
a）用2倍生理渗透压（580 mOsmol/L）处理细胞不同时间（4小时、8小时、12小时和24小时）；
b）用不同渗透压（290、363、435、580、1160 mOsmol/L）处理细胞12小时。
（4）在细胞培养终点，使用Promega的MTS试剂盒检测存活细胞，在每个细胞培养孔中加入10 μl MTS溶液，37℃孵育2小时。测定490 nm各孔的吸光值。在实验中，同时设置空白组（培养基和MTS溶液，无细胞），对照组（未经过高渗处理正常培养的细胞），每组设置三个复孔。
（5）实验结果如图2所示：在培养基中添加额外的氯化钠或葡萄糖后，细胞出现时间和渗透压依赖的细胞死亡。当固定不同渗透压培养基处理细胞时间为12小时，改变培养基渗透压时，在2倍生理渗透压（580 mOsmol/L）时，即有约50%的细胞死亡。细胞对葡萄糖引起的高渗透压更为耐受，4倍的葡萄糖高渗培养基可以引起50%的细胞死亡。固定培养基的渗透压为580 mOsmol/L刺激细胞，细胞随着刺激时间延长，细胞存活比例下降。
（6）按照上述同样的方法，在高渗培养基中额外添加1-10 mg/ml苦丁茶提取物，检测细胞存活率，结果如图3所示。结果说明苦丁茶提取物可以有效保护因氯化钠和葡萄糖引起的高渗透压对口腔上皮细胞的损伤。
f、添加苦丁茶提取物后对口含烟提取物引起的细胞死亡的干预
1.用MCDB151培养基制备口含烟提取物：取唇烟（Snus Frost）1片，加入2 mlMCDB151培养基（预热至37℃），置于研钵中，用研磨杵挤压4次（间隔15秒挤压一次）。1 min后，弃烟袋及其剩余内容物，取萃取液16000 rpm离心10 min，经0.22 μm滤膜过滤备用，如不立即使用，冻存于-80℃。
2.口含烟提取物渗透压测定：对上述1中的提取物进行渗透压测定（美国/wescor），测得渗透压为：785±17 mOsmoL/kg。
3.按照上述e中相同的方法检测细胞死亡，细胞刺激的培养基包括：（1）对照组：无血清MCDB151培养基；（2）苦丁茶提取物对照组：MCDB151培养基中添加10 mg/ml苦丁茶提取物；（3）口含烟提取物刺激组：用MCDB151提取的口含烟提取物；（4）苦丁茶提取物保护组：用MCDB151提取的口含烟提取物中添加10 mg/ml苦丁茶提取物。刺激时间设置为8小时，用MTS法检测细胞存活率。
4.实验结果如图4所示，在MCDB151培养基中添加10 mg/ml苦丁茶提取物对细胞存活没有影响，口含烟提取物在刺激口腔上皮细胞8小时后，导致约50%细胞死亡，但是在口含烟提取物中添加5 mg/ml苦丁茶提取物可以有效保护口含烟提取物引起的细胞死亡。
g、制备口含烟过程中加入苦丁茶提取物对口腔上皮保护作用检测
按照上述a-c的方法制作含有苦丁茶提取物的口含烟，同时制作不含有苦丁茶提取物的口含烟（除不加入苦丁茶提取物外，其余与a-c的方法相同）
按照上文同样的方法测定渗透压，测得含有苦丁茶提取物的口含烟和不含苦丁茶提取物的口含烟的渗透压范围为825±40 mOsmoL/kg，该结果说明添加苦丁茶不会导致口含烟提取物渗透压改变。
按照f中的方法测定苦丁茶提取物对口腔上皮存活的影响，区别在于，采用上述不含有苦丁茶提取物的口含烟以及含有苦丁茶提取物的口含烟（苦丁茶提取物的用量为0.5%、1%、2%），其中，含有苦丁茶提取物的口含烟采用a-c的方法制作，不同之处在于苦丁茶提取物的用量的变化。
结果如图5所示，在制作口含烟过程中添加苦丁茶提取物可以有效保护口腔上皮细胞。
结论：添加了苦丁茶提取物的袋装口含烟能明显降低口腔上皮损伤健康风险。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (9)
1.一种能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的袋装口含烟的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），取苦丁茶粉碎后，用超纯水震荡提取多次，合并提取液，4℃下离心，取上清液，上清液冻干后保存备用，得到苦丁茶提取物；
步骤（2），将烟叶粉碎至粒径为50~100目，并控制含水率为8~12%，得到烟叶粉末；
步骤（3），按照重量份数计，向步骤（2）得到的45~60份烟叶粉末中加入10~30份的水，之后进行巴氏热处理，之后再按顺序加入1~15份矫味剂、1~6份酸碱调节剂、5~20份香味剂、1~5份保润剂、1~5份清凉剂、1~5份抗氧化剂和步骤（1）得到的苦丁茶提取物，混合至均匀，冷藏后，杀菌，包装，得到能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的袋装口含烟；
其中，苦丁茶提取物的加入质量为烟叶粉末、水、矫味剂、酸碱调节剂、香味剂、保润剂、清凉剂和抗氧化剂总质量的0.5~10%。
2.根据权利要求1所述的能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的袋装口含烟的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，提取次数为3次，每次超纯水震荡提取1小时，苦丁茶与每次超纯水的用量比为：100g：1000ml：500ml：300ml；离心参数为16000g、30分钟；冻干温度为-30℃，冻干时间为24小时。
3.根据权利要求1所述的能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的袋装口含烟的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，巴氏热处理温度80~120℃，热处理时间10~180min；混合采用搅拌的方式，时间为4~6小时。
4.根据权利要求1所述的能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的袋装口含烟的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，冷藏温度为4~12℃，冷藏时间10~30小时；杀菌采用紫外杀菌，时间3~6小时；包装小袋质量为2.0g±10%。
5.根据权利要求1所述的能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的袋装口含烟的制备方法，其特征在于，所述的烟叶为烤烟、晾晒烟和白肋烟中的一种或多种的混合物。
6.根据权利要求1所述的能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的袋装口含烟的制备方法，其特征在于，所述的矫味剂为氯化钠、单糖、二糖、三糖、多糖、多元醇中的一种或多种的混合物；所述酸碱调节剂为碳酸氢钠和/或碳酸钠；所述的香味剂为柠檬、薄荷、咖啡、草莓、蓝莓、菠萝、桃子、苹果、橘子、西瓜、红枣、乌梅和橄榄味香精香料中的一种或多种的混合物。
7.根据权利要求6所述的能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的袋装口含烟的制备方法，其特征在于，所述的多元醇为甘露醇或麦芽糖醇。
8.根据权利要求1所述的能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的袋装口含烟的制备方法，其特征在于，所述的保润剂为丙二醇和/或丙三醇；清凉剂为薄荷脑、薄荷素油中的一种或多种的混合物；抗氧化剂为维生素A、维生素C、维生素E和茶多酚中的一种或多种的混合物。
9.权利要求1~8任意一项所述的能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的袋装口含烟的制备方法制得的能够防治由于渗透压导致的口腔上皮细胞死亡的袋装口含烟。
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