CN110275015A - 免疫色谱测量方法、免疫色谱用稀释液及免疫测试盒 - Google Patents
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Abstract
目的是抑制非特异反应而使检查的准确度提高。免疫色谱测量方法的一形态具备：将包含血清及血浆的至少一方的试样用盐浓度比生理盐水高的稀释液稀释的工序；使上述试样中的作为检测对象物质的血清淀粉样蛋白A(SAA)与检测物质标记抗SAA抗体反应而形成血清淀粉样蛋白A(SAA)与检测物质标记抗SAA抗体的复合体、使包含该复合体的上述试样色谱展开、将该复合体用固定着抗SAA抗体的测试线捕捉的工序；以及将上述测试线的颜色通过目视及分析装置的至少一方分析的工序。
Description
技术领域
本发明涉及免疫色谱测量方法、免疫色谱用稀释液及免疫测试盒。
背景技术
所谓免疫色谱(immunochromatography)法，是免疫测量法之一。其原理是：通过将因毛细管现象而在展开膜中流动的试样中的检测对象物质用固定在展开膜的测试线上的捕获抗体(或抗原)捕捉，测试线显色。另外，测试线的显色仅在作为伴随着无色的检测对象物质的捕捉的化学反应的结果显色的情况下没有，也有通过有色的检测对象物质的捕捉而被着色的情况，但本说明书中不将它们区别而称作显色。
通过对测试线的颜色进行分析，进行试样中的检测对象物质(例如炎症标志物)的测量。测试线的颜色的分析是定性的分析或者优选的是定量的分析。
作为炎症标志物，利用C反应性蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA：serum amyloidA)，α1酸性糖蛋白等，特别是CRP较为普遍。CRP对于人或狗而言在炎症时显著地上升，而对于猫而言在炎症时几乎不变动。另一方面，已知SAA作为猫的炎症标志物是有用的。
试样是从生物体采集的血液、血清、血浆等，用稀释液稀释而调制。在免疫色谱法中使用的稀释液使用生理盐水等的情况较多，其盐浓度是150mM左右。
例如在专利文献1中，公开了用生理盐水等将试样(血液)稀释为10010000倍的免疫色谱法。
此外，例如在专利文献2中，公开了使用在稀释液(缓冲液)中再添加了特定的有机物聚合物的展开溶媒的免疫色谱法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2014－119544号公报
专利文献2：日本特开2008－058334号公报
发明内容
发明要解决的课题
但是，在该免疫色谱法中，根据试料的种类，有发生尽管在试样中不存在检测对象物质但捕捉部位(测试线)显色的所谓非特异反应的情况。该非特异反应例如有引起基于目视的显色确认的检查中的准确度下降的情况。
进而，在使用免疫测试条读取器的显色强度测量的检查的情况下，如果由非特异反应带来的显色强度较高，则由非特异反应带来的显色而测量的范围被相应地压缩，测量的准确度下降。
所以，本发明的目的是抑制非特异反应而使检查的准确度提高。
用来解决课题的手段
为了解决上述问题，有关本发明的免疫色谱测量方法的一技术方案具备：将包含血清及血浆的至少一方的试样用盐浓度比生理盐水高的稀释液稀释的工序；使上述试样中的作为检测对象物质的血清淀粉样蛋白A(SAA)与检测物质标记抗SAA抗体反应而形成血清淀粉样蛋白A(SAA)与检测物质标记抗SAA抗体的复合体、使包含该复合体的上述试样色谱展开、将该复合体用固定着抗SAA抗体的测试线捕捉的工序；以及将上述测试线的颜色通过目视及分析装置的至少一方分析的工序。
本发明的发明者专门研究的结果发现，通过使用盐浓度比生理盐水高的稀释液，非特异反应被抑制。根据有关本发明的免疫色谱测量方法的上述技术方案，非特异反应被抑制，检查的准确度提高。
在上述免疫色谱测量方法中，上述稀释液的盐浓度优选的是250mM以上。以实验确认了：如果盐浓度是250mM以上，则非特异反应被抑制到测试线的显色以目视不能辨识之程度。
此外，为了解决上述问题，有关本发明的免疫色谱用稀释液的一技术方案是用来在上述免疫色谱测量方法中使用的稀释液，被添加从氯化钠及氯化钾中选择的1种以上的盐。
作为向稀释液添加的盐，不仅是氯化钠，也可以使用氯化钾。
此外，为了解决上述课题，有关本发明的免疫测试盒的一技术方案具备：免疫测试条，具有固定着抗SAA抗体的测试线，将稀释后的试样进行色谱展开；以及稀释液，将上述试样稀释，盐浓度比生理盐水高。
根据这样的免疫测试盒，通过用盒中具备的稀释液将试样稀释并用免疫测试条进行色谱展开，容易地实现非特异反应被抑制的准确度较高的检查。
在上述免疫测试盒中，上述稀释液的盐浓度优选的是250mM以上。以实验确认了：如果盐浓度是250mM以上，则非特异反应被抑制到测试线的显色以目视不能辨识之程度。
此外，在上述免疫测试盒中，由上述免疫测试条进行色谱展开的试样也可以是包含血清淀粉样蛋白A(SAA)与检测物质标记抗SAA抗体的复合体的试样。
上述检测物质标记抗SAA抗体的标记粒子也可以是金属胶质、着色乳胶粒子及荧光硅石纳米粒子中的某种标记粒子。
发明效果
根据本发明，非特异反应被抑制，检查的准确度提高。
附图说明
图1是表示在本发明的免疫色谱测量方法的一实施方式中使用的分析装置的外观的立体图。
图2是表示本发明的免疫测试盒的一例的图。
图3是表示收容在盒的内部中的测试条的图。
图4是表示测试条的构造的图。
图5是表示本发明的免疫色谱测量方法的一实施方式的图。
图6是表示稀释液的盐浓度与非特异反应之间的强度的关系的曲线图。
具体实施方式
以下，基于附图说明本发明的实施方式。
图1是表示在本发明的免疫色谱测量方法的一实施方式中使用的分析装置的外观的立体图。
图1所示的分析装置1具有电源开关11、触摸板12及测试条插入口13。触摸板12被用于输入与应分析的试样有关的ID信息等的输入及动作指令信号。
在测试条插入口13中，将条状的免疫测试条(以下，单称作“测试条”)以将表面朝向上方的状态以水平的姿势插入。
在分析装置1的内部，组装有将免疫测试条的后述的测试线的颜色光学地读取的CMOS照相机等光学元件，将测试线的颜色用该光学元件读取，向吸光度等换算，使用存储在存储装置中的检量线信息向化学浓度换算。这样，用图1所示的分析装置1定量地分析测试线的颜色。
图2是表示本发明的免疫测试盒的一实施方式的图。
图2所示的免疫测试盒2具备测试条20和稀释液30。稀释液30相当于本发明的免疫色谱用稀释液的一实施方式。
本实施方式的测试条20被收容在形成有2个开口部22A、22B的例如塑料制的盒22的内部，测试条20的表面的一部分从开口部22A、22B露出。此外，在盒22的表面上设置有码区域21，在该码区域21中，记载有例如QR码(注册商标)等的二维码。二维码中包含的信息，例如是分析项目、有效期限、批次号等的测试条20的基本信息，以及例如反应时间、检量线等的测试条20所固有的与显色反应关联的信息等。
图3是表示收容在盒22的内部中的测试条20的图，图4是表示测试条20的构造的图。
在盒22的内部，固定收容着在试样的展开方向上较长地延伸的测试条20。
测试条20具备试样滴下部25、标记保持部26、展开部27、捕捉部28和吸收部29。测试条20作为整体由例如滤纸等的多孔质支承体构成。
试样滴下部25是稀释后的试样被滴下的部分，例如由滤纸构成。该试样滴下部25的部分在图2所示的一方的开口部22A露出。因而，将试样从该开口部22A向试样滴下部25滴下。被滴下到试样滴下部25上的试样被多孔质支承体吸收，通过毛细管现象而朝向标记保持部26。
在标记保持部26上保持着标记抗体。具体而言，例如是使Au胶质溶液中物理吸附着抗SAA抗体的液体含浸在例如玻璃纤维片中并干燥而成的。本实施方式的检测对象物质是血清淀粉样蛋白A(SAA)，作为标记抗体而使用检测物质标记抗SAA抗体。更详细地讲，检测对象物质例如是猫SAA，标记抗体例如是金胶体标记抗猫SAA小鼠单克隆抗体(mousemonoclonal antibody)。
此外，作为检测物质标记抗SAA抗体的标记粒子，例如使用金胶体。另外，作为标记粒子，也可以使用金胶体以外的金属胶质，或者也可以使用着色乳胶粒子、荧光硅石纳米粒子。标记抗体溶解到移动至标记保持部26的试样中，在存在作为检测对象物质的血清淀粉样蛋白A(SAA)的情况下与该SAA结合而形成复合体。
展开部27是使含有这样的复合体的试样色谱展开的部分，例如由硝酸纤维素膜构成。在展开部27的途中，以沿与试样的展开方向正交的方向延伸的线状形成有捕捉部(测试线)28。在该捕捉部28上，固定着与检测对象物质特异地结合的捕获抗体(或抗原)。在本实施方式中，由于SAA是检测对象物质，所以作为捕获抗体而将抗SAA抗体固定在捕捉部28上。如果通过色谱展开而试样到达捕捉部28，则试样中包含的上述复合体的血清淀粉样蛋白A(SAA)与抗SAA抗体结合。结果，上述复合体留在捕捉部28中，通过复合体的标记抗体(具有的标记粒子)的颜色而捕捉部28显色。展开部27的形成有捕捉部28的部位在图2所示的另一方的开口部22B露出，经由开口部22B分析捕捉部28的颜色。
越过捕捉部28而进一步被色谱展开的试样例如被由滤纸构成的吸收部29吸收。
回到图2而继续说明。
稀释液30被封入在瓶31内，在使用时将瓶31的盖子32开封，将稀释液30用于试样的稀释。在稀释液30中，以比生理盐水高的浓度添加例如氯化钠或氯化钾等无机盐。此外，在稀释液30中没有添加有机物的聚合物。
另外，在免疫测试盒2中，也可以除了测试条20和稀释液30以外还具备包含标记抗体的标记试药。在免疫测试盒2中具备标记试药的情况下，在向测试条20滴下试样之前将标记试药向试样添加。此外，在免疫测试盒2中具备标记试药的情况下，不设置测试条20的标记保持部26。
对使用图1所示的分析装置1和图2所示的免疫测试盒2的本发明的免疫色谱测量方法的一实施方式进行说明。
图5是表示本发明的免疫色谱测量方法的一实施方式的图。
在图5所示的免疫色谱测量方法的第1工序(A)中，将免疫测试盒2中具备的稀释液30的瓶31开封，向瓶31内滴下试样40，用稀释液30稀释。试样40例如是通过从动物采集的血液的离心分离而得到的血清，例如将10μL用稀释液30稀释为100倍。
接着，在第2工序(B)中，将由稀释液30稀释后的试样41的例如100μL向测试条20的试样滴下部25滴下。由此，试样41被测试条20吸收，形成检测对象物质和标记抗体的复合体。接着，将包含该复合体的试样41进行色谱展开，用测试条20的捕捉部(测试线)28捕捉复合体。结果，捕捉部(测试线)28以与试样41中包含的检测对象物质的量对应的浓度显色。
接着，在第3工序(C)中，将测试条20连同盒22一起向分析装置1插入，由分析装置1对捕捉部(测试线)28的颜色进行定量分析。
另外，在本发明的免疫色谱测量方法中，作为测试线的颜色的分析，既可以进行以目视或传感器确认测试线是否显色的定性分析，或者也可以以目视观察比较测试线的显色的浓度与例如颜色样本的定量分析。
通过这样的免疫色谱测量方法，分析试样40、41中的检测对象物质的量(或有无)。
这里，对于分析的准确度的提高，捕捉部(测试线)28中的非特异反应的抑制是重要的，但本发明的发明者发现，通过使稀释液30的盐浓度成为适当的浓度，非特异反应被抑制。
以下，对非特异反应被抑制的稀释液30的盐浓度进行说明。
图6是表示稀释液30的盐浓度与非特异反应的强度的关系的曲线图。
图6的横轴表示稀释液30的盐浓度[mM]，纵轴表示非特异反应的强度。在稀释液30中，具体而言添加了氯化钠。此外，作为一例而测量猫的SAA是检测对象物质的情况下的非特异反应的强度。
在稀释液30的盐浓度是比生理盐水低的125mM的情况下，非特异反应的强度非常高，显色强度为接近于饱和的强度。相对于此，如果稀释液30的盐浓度为比生理盐水高的250mM，则非特异反应被大幅地被抑制，通过目视确认了显色强度下降到不能辨识测试线的显色之程度。
250mM的盐浓度较大地超过了生理盐水的盐浓度，是担心试样中的蛋白质被破坏而通常不在稀释液中使用的盐浓度。但是，实际发明者用于稀释液后，确认了检测对象物质没有被破坏而非特异反应被抑制的作用。
在稀释液30的盐浓度为500mM的情况及1000mM的情况下也确认了非特异反应的大幅的抑制，但可知如果稀释液30的盐浓度达到2000mM，则非特异反应的强度再次增加。
根据反应强度的这样的变化，可以考虑非特异反应的抑制效果是通过与产生所谓的盐溶/盐析的作用同样的作用而产生的。即，在比生理盐水低的盐浓度下，通过检测对象物质和捕获抗体没能将围绕自己的周围的水分子族全部保持而向水中露出，包含夹杂物质的水溶液中的蛋白质分子彼此的非特异性的吸附作用超过检测对象物质与捕获抗体的特异性的吸附作用，产生较强的非特异反应。
并且，如果盐浓度增加，则检测对象物质和捕获抗体的周围的水分子族通过盐的存在而稳定化，在分子间总是产生距离。作为其结果，夹杂物质失去与捕获抗体接触的机会，非特异反应大幅减少。另一方面，由于检测对象物质与捕获抗体的吸附作用比夹杂物质强，所以在水分子族的存在下也失去反应性，仅观测到特异的反应。
如果盐浓度进一步增加，则由盐将蛋白质表面的水分子族带走，夹杂物质与捕获抗体接触的机会增加，所以非特异反应再次变强。
这样的作用不仅是向稀释液30添加氯化钠的情况，在添加氯化钾的情况及添加氯化钠和氯化钾的混合物的情况下，也预想在同样的盐浓度下会发生同样的作用。此外，不仅是猫SAA，在人SAA、狗SAA、马SAA是检测对象物质的情况下，也预想在同样的盐浓度下会发生同样的作用。特别是在人SAA中，在与图6的曲线图表示的盐浓度同样的盐浓度下确认了同样的作用，预想至少在SAA是检测对象物质的情况下普遍地发生同样的作用。
标号说明
1分析装置；2免疫测试盒；20测试条；25试样滴下部；26标记保持部；27展开部；28捕捉部；29吸收部；30稀释液。
Claims (7)
1.一种免疫色谱测量方法，其特征在于，
包括：
将包含血清及血浆的至少一方的试样用盐浓度比生理盐水高的稀释液稀释的工序；
使上述试样中的作为检测对象物质的血清淀粉样蛋白A(SAA)与检测物质标记抗SAA抗体反应而形成血清淀粉样蛋白A(SAA)与检测物质标记抗SAA抗体的复合体、使包含该复合体的上述试样色谱展开、将该复合体用固定着抗SAA抗体的测试线捕捉的工序；以及
将上述测试线的颜色通过目视及分析装置的至少一方分析的工序。
2.如权利要求1所述的免疫色谱测量方法，其特征在于，
上述稀释液的盐浓度是250mM以上。
3.一种免疫色谱用稀释液，是用来在权利要求1或2所述的免疫色谱测量方法中使用的稀释液，其特征在于，
被添加了从氯化钠及氯化钾中选择的1种以上的盐。
4.一种免疫测试盒，其特征在于，
具备：
免疫测试条，具有固定着抗SAA抗体的测试线，将稀释后的试样进行色谱展开；以及
稀释液，将上述试样稀释，盐浓度比生理盐水高。
5.如权利要求4所述的免疫测试盒，其特征在于，
上述稀释液的盐浓度是250mM以上。
6.如权利要求4或5所述的免疫测试盒，其特征在于，
由上述免疫测试条进行色谱展开的试样包含血清淀粉样蛋白A(SAA)与检测物质标记抗SAA抗体的复合体。
7.如权利要求6所述的免疫测试盒，其特征在于，
上述检测物质标记抗SAA抗体的标记粒子是金属胶质、着色乳胶粒子及荧光硅石纳米粒子中的某种标记粒子。
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